Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Fare Retina kullanma CNS'deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

Kemirgen retina uzun beyin için erişilebilir bir pencere olarak kabul edilmiştir. Bu teknik yazıda iskemik yaralanma sonrası, merkezi sinir sistemi içinde, vasküler rejenerasyon başarısız olmasına yol mekanizmaları incelemek için oksijen kaynaklı retinopatinin fare modeli kullanan bir protokol sağlar. Anlatılan sistem, aynı zamanda, retina ve CNS içindeki fonksiyonel kan damarlarının büyümesini teşvik etmek için stratejiler keşfetmek için dönüştüğü edilebilir.

Abstract

Kemirgen retina, belki de, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde nörovasküler etkileşimi araştırmak için hangi en kolay memeli sistemidir. Bu giderek kabul edilmektedir ki bu, Alzheimer, multipl skleroz ve vasküler uzlaşma amiyotrofik lateral skleroz, mevcut elemanları gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Buna ek olarak, çocuk ve çalışma çağındaki nüfus (sırasıyla prematürite ve diyabetik retinopati retinopati) körlük en önemli nedenleri fizyolojik vasküler yeniden büyüme damar dejenerasyonu ve başarısızlık ile karakterizedir. Bu teknik çalışmanın amacı retinadaki sinir sistemi vasküler rejenerasyonu incelemek için ayrıntılı bir protokol sunmaktır. Yöntem, iskemik yaralanma sonrası vasküler büyüme başarısız olmasına yol moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, potansiyel tedavi yöntemleri, sağlıklı damar plexuses hızlandırmak ve geri keşfedilebilir. Bulgular obtained anlatılan yaklaşım kullanılarak, şeker hastalığı ya da prematüre edilene iskemik retinopati için terapötik yollar sağlar ve muhtemelen diğer merkezi sinir sistemi vasküler hastalıkların yararlı olabilir.

Introduction

CNS gelişimi, sinir, bağışıklık hücreleri ve kan damarları boyunca yeterli doku perfüzyonunu sağlamak ve duyusal bilginin 1-5 iletimine izin derece birleştiğinde ağları kurmak. Yetersiz doku oksijenasyonu ve tehlikeye metabolik arz ve vasküler sistem sonuçlarının dağılımı giderek nörodejeneratif hastalıkların 6 patogenezinde önemli bir katkı olarak kabul edilmektedir. Vasküler bırakma ve beyin içinde nörovasküler biriminin bozulma, örneğin, vasküler bunama, beyin 7 beyaz maddenin vasküler lezyonlar ve arteriyollerin ve küçük damarların stenozu 8 ile Alzheimer hastalığı ile ilişkilidir. Ayrıca, bozulmuş damar bariyer fonksiyonu, birden fazla skleroz 9 ve amiyotrofik lateral skleroz 10 katkıda bulunduğu düşünülmektedir.

Kör, bu protokolü açıklanan retina modele doğrudan ilgilidiyabetik retinopati 11 ve 12 prematüre retinopatisi gibi hastalıklar, 13 erken vasküler dejenerasyon aşaması ile karakterize edilir. Nörovasküler retina üzerinde eden iskemik stres olasılıkla yeniden yatırmak oksijen ve enerji arzı 14-16 bir telafi edici yanıt olarak kaynaklıdır aşırı ve patolojik neovaskülarizasyon ikinci aşaması tetikler. Hastalığın ilerlemesi için merkezi iskemik stres üstesinden gelmek için bir çekici strateji, özellikle nöro-retina (Şekiller 2 ve 3) ve iskemik bölgelerin fonksiyonel damar ağları sağlamaktır. Kontrollü bir anjiyojenik tepki düşündürücü karşı-sezgisel tür anti-VEGF'lerinde gibi anti-anjiyogenik tedaviler uyarlanmış tedaviler olarak kabul edildiği bir durumu olarak rastlamak olabilir. Ancak, bu yaklaşımın geçerliliği için kanıt montaj olduğunu. Örneğin, ischem in "fizyolojik gibi" vasküler yeniden büyümesini artırmakic retinopatiler zarif endotel hücrelerinin öncü 17, diyet ω-3 çok-doymamış yağlı artan diğer anjiyojenik faktörler 18, miyeloid progenitörlerin 19 püskürtülmesi, NADPH oksidaz kaynaklı apoptozun inhibisyonu 20 arasında Müller hücre-ifade edilen VEGF kaynaklı baskılanması inhibisyonunun getirilmesi ile gösterilmiştir asit alımı 21, bir triptofan tRNA sentetazı 22 karboksil-terminal parçası ve glial hücreler 23 korunması için, VEGF ya da FGF-2 doğrudan uygulanması ile tedavisi. Ayrıca, bu tür iskemik retinopati Semaphorins veya netrinler gibi klasik nöronal rehberlik sufle modüle retina içinde sağlıklı damarların damar rejenerasyon hızlandırır ve dolayısıyla patolojik anjiyojenez 24, 25 azalttığını göstermiştir. Doğrudan klinik alaka, yukarıda belirtilen hayvan çalışmaları birkaç kanıt sağlayan vasküler yeniden teşvikretinopatilerin erken iskemi safhasında üretiminin anlamlı ölçüde muhtemel iskemik yükünün azaltılması yoluyla, görüş-tehdit öncesi retinal neovaskülarizasyon 19, 23, 24, 26 azaltabilir.

Fonksiyonel damarların yenilenmesini teşvik tedavi stratejilerinin oluşturulması vasküler biyologlar için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada retinada damar büyümesini modüle etmek için stratejiler keşfetmek için oksijen ile tetiklenen retinopati (OIR) 'in fare modeli kullanan bir deneysel sistem tarif eder. Smith ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. 1994 27 yılında, bu model insan proliferatif retinopatilerin için bir vekil olarak hizmet ve ortam oda O 2-gerilim (Şekil için P12 kadar% 75 O 2 P7 fare yavrular tutulması ve yavrular yeniden tanıtan oluşur 1). Bu paradigma gevşek bir prematüre bebek havalandırılan bir senaryo taklitO 2 ile. Hiperoksiye fare yavrularının maruz retina kılcal ve mikrovasküler dejenerasyon kışkırtır ve maksimal VO alanı yapıldıktan sonra 48 saat (P9) ulaşmış olmasına rağmen tipik olarak, P12 de O 2 çıkış üzerine değerlendirildi vazo-obliterasyonunun tekrarlanabilir bir alanı (VO) verir O 2 28 maruz. Fare, avasküler VO bölgeleri kendiliğinden oda havasına yeniden giriş aşağıdaki hafta boyunca yeniden ve sonunda VO bölgeleri tamamen (Şekil 2) re-vaskülarize edilir. OIR maruz farelerin oda havasına yeniden giriş aynı zamanda tipik bir anti-anjiyogenik tedavi paradigmalarının etkinliğini belirlemek için değerlendirilir ön-retinal neovaskülarizasyon (NV) (P17'de maksimal) kışkırtır. En saf haliyle, OSB modeli oksijen kaynaklı vasküler dejenerasyon değerlendirmek ve yıkıcı öncesi neovaskülarizasyona 29-31 kapsamını belirlemek için son derece tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir araç sağlar.

30, 31 tarafından tarif edilmiştir. Burada farmakolojik bileşikler, olası terapötik, viral vektörlerin tarafından nöral retinada fizyolojik revaskülarizasyon modülasyonu araştırmak veya transgenik veya nakavt farelerde aday genlerin etkisini incelemek için basit bir adım-adım bir prosedür sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik deyimi: Tüm hayvan deneyleri Görme ve Oftalmoloji oftalmik Hayvanların Kullanımı ve Vizyon Araştırma ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (ARVO) Bildirimi Araştırma Derneği tarafından kurulan hayvan bakım kurallarına uyar.

1.. Oksijen İsteyerek Retinopati (OSB)

  1. Tutanak P0 olarak fare yavrularının doğum tarihi.
  2. Yeterli ağırlık aralığı sağlamak için O 2 girmesiyle tüm hayvanların ağırlıkları kaydedin. Not: P17 da C57BL / 6 fareleri için, vücut ağırlığı maksimum NV 32 boyunca 5 ve 7.5 g arasında olmalıdır. Çevre sağlamak amacıyla, bu (genetik olarak modifiye edilmiş farelerde hem de farenin deneysel tedavi alan) bir kontrol olarak kardeşlerinden kullanılması tavsiye edilir. Bir viral vektör etkilerini değerlendirirken, bir virüsün tropizminin düşünün ve viral-teslim transgenlenn tam ifadesi için yeterli zaman tanımak gerekir. Hızla sentezleyen viralBu tür 3. nesil lentivirüsler 24, 25 olarak vektörler, 33 tavsiye edilir.
  3. P7 (C57BL / 6 ya da istenilen gerginlik) ve 5 gün 27 için% 75 O 2 set bir oksijen odasına annesini teşvik bir CD1 de yer fare yavrular. Çevresel nem ve sıcaklık O 2 maruz boyunca sabit tutuldu. Not: O 2 merkezi bir kaynağı ile donatılmış Araştırma tesisleri ideal ve boş O 2 tankları hantal değiştirilmesini sınırlamak. Transgenik ya da nakavt fareler çalışma durumunda, bu kontrol ve deney fareler aynı suşlar 30, 29 içinde, genetik akımlarını sınırlamak için, aynı satıcıdan alınan sağlamak için önemlidir.
  4. P12 olarak, oksijen odasından fareler kaldırmak ve O 2 çevre hayvanlar dönün.

İç Retina için Bileşiklerin teslimi için 2. İntravitreal Enjeksiyon (WhFarmakolojik bir bileşik ya da rekombinant protein en Değerlendirme etkileri)

  1. P14 noktada oksijen 2 L / dk (veya seçim hayvan koruma komitesi onaylı anestezik)% 2 izofluran ile fareler uyutmak. Anestezi etkinliğini doğrulamak için, sırayla forseps ile kuyruk, arka ayak ve kulak çimdik.
  2. Karnı üzerinde fare yerleştirin.
  3. Eğimli bir çekilmiş cam bir iğneye sahip bir şırınga 10 ul steril kullanarak, 45 ° ile, gözün posterior limbus araştırılmaktadır bileşiği veya araç (fizyolojik tuzlu su) ihtiva eden bir çözeltinin 1 ul bir maksimal hacim enjekte gerçekleştirmek Lensi kaçınarak açısı. Not: çekilmiş cam iğneli epoksi reçine bir damla şırınga ile eklenir.
  4. Farenin gözüne bir bez ile yağ oftalmik merhem (ideal antibiyotik ile) bir damla uygulayın.
  5. Anneyi teşvik ile geri kafesine fare dönün. Fareler daha sonra dikkatli bir şekilde yeniden kadar izlenirkapalı ve tam olarak ayakta.

Flöresein Anjiyografi ile Gemi Perfüzyonunun ve Bariyer Fonksiyonu (Dürüstlük) 3. Değerlendirilmesi

  1. Oksijen 2 L / dk (veya seçim hayvan koruma komitesi onaylı anestezik)% 2 izofluran ile fareler anestezi. Anestezi etkinliğini doğrulamak için, sırayla forseps ile kuyruk, arka ayak ve kulak çimdik. Not: yenilenme değerlendirilir, bu tipik olarak P17 gerçekleştirilir. Ayrıca carry-out analizi P19 ve P21 damar bütünlüğü zamanla korunmuş olup olmadığını belirlemek için.
  2. Bir kez anestezi, fare tartın.
  3. Diseksiyon makas ile orta hat karın kesi olun. Not: Diseksiyon araçları düzenli olarak kontrol ve bilenmiş olmalıdır.
  4. Yanal kaburga Kes ve forseps yardımı ile göğüs kafesi yükseltmek. Not: kalbe zarar görmesini önlemek için yanal olarak mümkün kesmek gereklidir.
  5. Perip uzaklaştırılmasından sonrakalpten Heral doku, hemostatik forseps ile inen aorta kelepçe.
  6. Yavaş yavaş 25 G iğne kullanılarak sol ventrikül fluoreseini-dekstran enjekte. Not: vasküler bariyer fonksiyonu incelenmiştir ise, 70 kDa floresein-dekstran damar bütünlüğü tehlikeye zaman damarların sızıntı gibi kullanılır. Araştırmacı kan damarlarını döküm istiyorsa, 2 MDa floresein-dekstran kullanılır. Kritik adımlar: 1) homojen bir bölünmeyi, santrifüj fluoreseini-dekstran sağlamak ve yüzer enjekte, 2) damarı daralma önlemek amacıyla, ısıtılmış floresein-dekstran solüsyonu enjekte etmek, 3) Tirajı zaman gerektiği aşırı değil 4 dk.
  7. İşletim makas ile enjeksiyondan sonra farelere 2 dk başını kesmek.

4.. Enükleasyon ve Göz Fiksasyon

Not: vasküler rejenerasyon oranlarını değerlendirirken, ilk P12 olarak ve ayrıca P14 ve P17 ile retina toplamak. Örneklenmiş zaman noktasında sayısını artırınrevaskülarizasyon 24 oranlarının daha doğru belirlenmesi için i.

  1. Fare kafasını yatırın ve yan üzerine yerleştirin.
  2. Cilt ve diseksiyon makas kullanarak göz kapaklarını kaplayan çıkarın.
  3. Göz altında kavisli bir forseps yerleştirin ve yavaşça optik sinir ayrılana kadar yukarı doğru çekin.
  4. Onun diğer yüzüne farenin kafasını çevirin ve aynı adımları (4.2 ve 4.3 adımları) gerçekleştirin.
  5. Fiksatif daha iyi nüfuz etmesini sağlamak için, 30 G iğne ile, gözün anteryor odacığı bir delik delinerek.
  6. % 4 paraformaldehit (PFA) ihtiva eden bir tüpe aktarın ve gözler, oda sıcaklığında 1 saat boyunca düzeltin.
  7. PFA çıkarın ve buz gibi soğuk PBS çözeltisi ile gözler 4 kez yıkayın.

5.. Retina Diseksiyon

  1. Soğuk PBS içeren bir Petri kabındaki fare gözleri yerleştirin ve bir stereo mikroskop altında retina diseksiyon.
  2. Mikro diseksiyon bilim ile göz çevresindeki fazla yağ / doku çıkarınssors.
  3. Mikro diseksiyon makas ile kornea kesti.
  4. Forseps iki çift kullanarak, inceden uzak optik sinir doğru çevreden sklera soyma ve atın.
  5. Forseps ile lens (kornea altında beyazımsı top) sıkın ve göz fincan ayıklayın. Bir destek olarak forseps çifti, ve kavrama diğer kullanın ve dikkatli lens yükseltmek ve çıkarın.
  6. Küçük fırçalar (boyut 0) ve forsepsler kullanılarak retinanın iç taraftan cam gibi damarları ayırın.
  7. Forseps kullanarak optik diskin bağlı hiyaloid gemilerin demetleri çıkarın.
  8. Aktarım önce boyama işlemine başlamadan için buz üzerinde PBS ve yeri ihtiva eden 2 ml mikrosantrifüj tüplerine retina kesilir.

6.. Retina Damar Boyama

  1. Gece boyunca yumuşak bir floresan PBS içinde bağlanmış-isolectin B4 (rodamin-lektin ya da diğer) 1 mM CaCl2 ihtiva eden bir çözelti içinde, 4 ° C'de çalkalayarak kesilir retina inkübe
  2. Ertesi gün, boyama çözeltisi çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 3x retina yıkayın.

Retinal Flatmounts 7. Hazırlanması

  1. Bir mikroskop lamı üzerine, fotoreseptör tarafı aşağı retina, transfer ve dört eşit büyüklükte parçaya bölünür retina bölmek için bir cerrahi neşter kullanılarak dört adet derin eşit radyal kesiler yapmak. Hareket etmez, böylece kesiler sırasında, bir fırça ile retina destekleyin.
  2. PBS batırılmış iki fırça kullanarak, dikkatli bir kadran fotoreseptör yan aşağı dümdüz ve fotoğraf beyazlatma önlemek için orta montaj retina batırmayın. Sonra dikkatlice basınç uygulayarak ve hava kabarcıkları kapak kayma altında birikir yok emin olmadan monte retina yüzeyinde bir lamel yerleştirin. </ Li>

8. Önce 31 Açıklanan Görüntüleme ve Vasoobliteration (VO) ve Neovaskülarizasyonunun (NV) Kantitasyonu olarak

  1. 10X bir büyütmede bir epi-floresan mikroskobu ile tam monte edilmiş retina görüntülerini al.
  2. Fotoğraf düzenleme yazılımı retina görüntü açın, bir araya dikmek ve total retina alanı ve avasküler alanı ölçmek. Konum piksel olarak ifade edilebilir.
  3. Retinal alanında piksel sayısı ile avasküler alanında piksel sayısına bölünmesi ile VO ölçüde belirler.
  4. Açıklandığı gibi, 31 total retina alanındaki piksel sayısına göre NV'nin piksel sayısına bölünmesiyle NV kapsamını belirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OIR modeli genel olarak retina oksijen kaynaklı vasküler dejenerasyon ve iskemiye bağlı patolojik neovaskülarizasyonu çalışma için kullanılır ve oküler hastalıklar 27, 29, 30 için şu anda kullanılan anti-anjiyojenik tedavilerin geliştirilmesinde etkili olmuştur. Bu modeli kullanılarak elde edilen bulgular, gevşek gibi proliferatif diyabetik retinopati ve prematüre retinopatisi 30 olarak iskemik retinopatilerin için çıkarım olabilir.

Burada damar rejenerasyon çalışması için bu model alternatif kullanımını sunuyoruz. Biz son zamanlarda bizim laboratuar tarafından yayımlanan iskemik retina yeniden bir stratejinin bir örnek anlatacağız. Sunulan çalışmada sürekli nöronal iskemi endoplazmik retikulum (ER), stres ve efektör endoribonükleazlar IRE1α, klasik nöronal yönlendirme işaret netrin-1 yaran mRNA biri ile aktive ettiğini gösterir. Biz göstermekNetrin-1'in bu göz içi doğum, retinal miyeloid hücrelerde onarıcı anjiyojenez bir program uyarır ve bu nedenle OIR 25 sonra sinir dokusu revaskülarizasyon hızlandırır. Ayrıca, biz IRE1α lentiviral aracılı susturulması kullanarak hızlandırılmış damar rejenerasyon bir örnek sağlar.

Anlatılan deney paradigmalar tercih edilen bir araştırıcı tedavi araştırmak için modifiye edilebilir. Önemli bir şekilde, intravitreal enjeksiyonunun zaman noktası araştırdı bileşiğin doğasına göre belirlenir ve dikkate incelenmiştir tedavi hareket hangi mekanizma almalıdır. Bir hızlı etkili müdahale revaskülarizasyon (Şekil oranını hızlandırmak yardımcı olabilir retinal vaskülarizasyon henüz hızlandırıcı bir zaman noktasına karşılık gelir Örneğin, bir farmakolojik bileşik (reseptör agonisti, antagonisti, vs) okumak için, P14 seçilebilir 2 ve 3a). Viral vektörler olduğunda, kullanılan yeterince zaman yolcu geni ve bir önceki zaman noktası tam olarak ifade sağlamak için tahsis edilmelidir transgenin ya da hedef genin tam susturma (Şekil 4) tam olarak ifade sağlamak için seçilebilir. Lentiviral esaslı vektörler, özellikle de nedeniyle hızlı bir ifade, düşük üretim ve inflamatuar yanıt 24, 25 kolaylığı için bu konuda uygundur. Bu hedef gen, uygun retinal hücre popülasyonu (RGC, endotel hücresi, Müller Cell, vs) teslim edilir, bu nedenle seçilen viral vektörün tropizmi kabul edilmelidir olduğundan emin olmak için de çok önemlidir. Alternatif olarak, transgenik ya da nakavt hayvanlar kullanılarak damar rejenerasyon bir genin rolünün çalışılması göz içi enjeksiyonları gerçekleştirmek için gerek olmayan avantajını sunmaktadır.

Şekil 1 Şekil 1... Fare yavrular ve emziren anneler P12 P7 dan% 75 O 2 maruz fare OSB modelinin şematik olarak gösterilmesi. Sürekli O 2 teslimat ve oksimetre ile havalandırılan oksijen odası gereklidir. Bu ilk dönemde, retina vazo-obliterasyon oluşur. P12 de, fareler maksimal patolojik öncesi retina kumeleme meydana P17 kadar oda havası (% 21 O 2) iade edilir. Neovaskülarizasyon aşağıdaki gün içinde düzelir. Vasküler rejenerasyon araştırmak için ideal bir dönemdir P12 ve P17 arasında penceredir. Vazo-obliterasyonunun ölçüde birkaç zaman puan Örnekleme ve değerlendirilmesi revaskülarizasyon doğru oranlarını aydınlatılması anahtarıdır.

Şekil 2,
Şekil 2.. Oksijen kaynaklı vazo-oblite aşağıdaki retina revaskülarizasyon zaman seyrirasyon. Retina flatmounting prosedürün) Grafik tasviri. Bir kesi kornea (siyah-gri kubbe) üst ve sklera (noktalı kırmızı çizgiler) ile yapılır ve retina dışarı alay edilir. Lens kornea / sklera açıldıktan sonra veya sklera şemada gösterildiği gibi çıkartıldıktan sonra ya da elde edilebilir. Hyaloid kaplar daha sonra çıkarıldı ve gerçekleştirilen retinal damarların boyama edilir. Boyama protokolü tamamlandıktan sonra, daha sonra 4 retina eşit aralıklı kesitler halinde kesilir ve bir mikroskop lamı damar yan up. B) OIR tabi farelerden Lektin-lekeli flatmount retina üzerine monte edilir. Gemiler yeniden olarak, (burada P12 maksimal) vazo-obliterasyonunun alan patolojik neovaskülarizasyon P17'de maksimal ve lektin lekeli OIR retina doymuş noktalar olarak görüntülenir içeri doldurur. P19-P21 ile, retina vaskular ağlar tam olarak yeniden var. (Bu rakam Binet ve diğ. Hücre Metabolizması 2013 25 modifiye edilmiştir)

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Şekil 3,
Netrin-1:. Retinal vasküler rejenerasyonu hızlanır enjekte edilebilir bir tedavi Şekil 3, Örnek. A) Netrin-1 P17'de değerlendirilen vasküler yeniden büyüme P14 ve ölçüde enjekte edilir. Vasküler rejenerasyonunda bir doza bağımlı bir artış görülmektedir. B) damar bütünlüğü düşük molekül ağırlıklı dekstran floresan ile perfüzyon ile değerlendirilebilir. Gemiler tehlikeye bariyer fonksiyonunu göstermesi durumunda, floresan Dekstran gemi (oklar) dışında sızdırıyor. (Bu rakam Binet ve diğ. Hücre Metabolizması 2013 25 modifiye edilmiştir)

Şekil 4,
Gen susturma wi Şekil 4. Örnekinci retinal vasküler rejenerasyon için shRNAs lentiviral-teslim:. Lv.shIRE1α vasküler rejenerasyon yardım retina ganglion nöronları IRE1α gen susturma yeteneğini değerlendirmek için bir shIRE1α için bir lentivirüstür kodlama intravitreal enjeksiyonu yeterli zaman tanımak için P3 enjekte edildi vasküler büyüme ve vazo-obliterasyonu değerlendirilir olduğunda gen susturulması için. Bu örnekte kullanılan 3. nesil lentivirüs plazma membranları hedeflemek için tasarlanmış bir modifiye veziküler stomatit virüsü glikoproteini (VSV-G) içerir. Bu vektörler etkin bir şekilde retinal ganglion hücreleri enfekte birlikte, sentezleme diğer yerel hücre tiplerinde de not edilebilir. (A) Bu tedavi, daha sonra zaman noktalarında ölçülen vazo-obliterasyonundan tüm gözlenen faydaları artmış vasküler rejenerasyon nedeniyle olduğunu simgeleyen, P12 olarak belirlenen oksijen kaynaklı vazo-obliterasyonundan farkedilir değişikliklere yol açmamıştır. IRE1α (B) Hücre Kültüründe in bu paradigma dramatik P17'de OIR ve büyütme aşamasında vasküler rejenerasyon gelişmiş. Böyle P14 gibi vazo-obliterasyonunun üçüncü bir zaman noktasını Değerlendirilmesi (C) (Bu rakam Binet ve diğ. Hücre Metabolizması 2013 25 modifiye edilmiştir), revaskülarizasyon doğru oranlarını belirlemek için gereklidir. (Bu rakam Joyal vd. Kanı 2011 24 modifiye edilmiştir) , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Iskemik sinir dokusunda yeni sağlıklı damarlarının büyümesini teşvik etmek için en etkili yolu nedir? Bunu engelleyebilir ve damar büyümesini meydana gelen doğal hızlandırmak için terapötik geçerli mi? Iskemik retinopati veya felç gibi nöro-iskemik patolojilerde, vasküler dejenerasyon indirgenmiş nöronal fonksiyonu 35-38 ile ilişkilidir. Bu nedenle hastalığın erken / acil kesimi sırasında bölgesel mikro-dolaşımı reinstating, erken yaralanmaya karşı yararlı olabilir. Oküler bağlamda, iskemik retina revaskülarizasyon hızlandırmak deneysel paradigmalar patolojik neovaskülarizasyon 21-25, 34 ve bu nedenle bu yaklaşımın yararları daha fazla araştırma azaltır.

20 yıl önce piyasaya sunulmasından bu yana, OSB modeli 27 retina anjiyogenez araştırma 30 devrim yarattı. Burada muhtemel Strat incelemek için bu model için ek bir uygulama sağlamakiskemik retina damar fizyolojik rejenerasyon modüle egies. İdeal bir hayvan modeli gibi insan pato-fizyolojisi yakınlığı, yüksek tekrarlanabilirlik, ideal hızlı bir şekilde yürütülmesi ve düşük maliyetli olarak çeşitli kriterleri içermelidir. OIR fare modeli tüm bu kriterleri karşılayan ve taşınan-out olabilir az 3 hafta içinde.

Çok sayıda listelenen faydalarına rağmen, sakıncaları önce analizlere fareyi kurban geçerli ihtiyacını içerir ve bir hayvan dolayısıyla doğru uzunlamasına izleme mevcut görüntüleme araçları ile henüz mümkün değildir. Şu anda, bu tür Ekim ya da floresein anjiografi gibi in vivo görüntüleme teknikleri nedeniyle ilgili değildir retinanın en merkezi bölgelerine görüntüleme kapsama 39 azaltır fare gözün (eğrilik yarıçapı ve küçük boyutu) doğasında optik sınırlama büyük ölçüde başarısız olan modelinin erken aşamaları.

P olarak vasküler rejenerasyon çalışması için istihdam zamanBu protokol kağıt roposed, neovaskülarizasyon okuyan için geçerli olan tüm hususlar da takip edilmelidir. Bu ağır anjiogenezisi 32 etkiler yavru metabolik sağlık, tahmin kaydederken hayvan ağırlığını içermektedir. Hiperoksik odasındaki oksijen geriliminin doğru kontrolü de önemlidir. Oksijen konsantrasyonu Varyasyon kaçınılmaz kritik veri yanlış yorumlanmasına yol açabilir vasoobliteration üzerinde doğrudan etkisi vardır. Bu nedenle, oda oksijen konsantrasyonunun sürekli elektronik izleme uygulamak ya da en az, oksijen seviyesi günlük değişiklikleri izlemek ve sabit oksijen seviyesini korumak için oxycycler kapı açma ya da sınırlamak için tavsiye edilir. Retina Optimal işlem de pratik ister. Ekstraksiyon, montaj ve retinanın boyama nispeten kırılgan retina gibi dikkatle yürütülmesi gerekir incelikle ele alınması gerekir. Buna ek olarak, genetik olarak tadil edilmiş hayvanlar, bir koloni c genetik drift her deney için olduğu gibiBir karıştırıcı ile sonuçlanır. (Örneğin, bir sıçan kolonisinde) seçici bir kuvvet yokluğunda, alelik veya genetik sürüklenme kısa bir süre içinde nüfusun büyük değişikliklere yol açabilir rastgele bir süreçtir. Allel frekansları kuşaktan kuşağa değiştirebilir ve bir alt koloninin 40, 41 oluşumuna neden olabilir. Bu mutasyonlar ölçüde belirlenemeyen ve aynı kolonide aynı damızlık çiftleri tarafından üretilen nesillerin sayısını sınırlamak için bu nedenle önemlidir. Yüksek genetik istikrarın sağlanmasının en etkili yolu her beş kuşak "hisse senedi" yenileme veya aynı arka planda bir satın fare ile çaprazlanması devam etmektir.

Ayrıca, retinal dejenerasyon mutasyon (rd) 1, 8 42, en az bir kez test etmek için tavsiye edilir erken fotoreseptör dejenerasyonu atfedilebilir fenotipleri karıştırıcı önlemek amacıyla yeni bir satır başlamadan önce. Transjenik hayvanlar için,Bu kontrol ve mutant fareler hem de aynı satıcıdan alınan ve aynı genetik arka planda zorunlu olduğundan emin olmak için hayati önem taşımaktadır.

Biz kan damarı oluşumu ve büyüme moleküler mekanizmaları aydınlatmak için devam ederken, roman, hızlandırmak yavaş, ya da doğmakta olan kan damarları kaynaklanmakta yönlendirmek yaklaşımlar. Damarlanma modülasyonu bir patolojik bağlamda in vivo olarak keşfedilmeyi hangi bir model sistemi CNS içindeki nöronal iskemi karşı muhtemel terapötik paradigmaları keşfetmek için değerli bir araç sağlayabilir. Vasküler rejenerasyon çalışması için fare OSB modelini adapte böyle bir mekan sağlar ve fizyolojik ve patolojik anjiyogenez için moleküler temeli anlayışımızı ilerletmek için değerli bir araç olmaya devam edecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

PS Retina Hücre Biyolojisi Kanada Araştırma Başkanı ve Alcon Araştırma Enstitüsü Yeni Araştırmacı Ödülü tutar. Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri (221478) hibe tarafından desteklenen, Kanada Diyabet Derneği (OG-3-11-3329-PS), Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (418.637) ve Vakfı Mücadele Körlük Kanada. Desteği de Reseau de Recherche en Sante de la Vision du Québec tarafından sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter