Summary
Se describe la disección y el cultivo ex vivo de la piel del ratón embrionario. El sistema de cultivo mantiene una interfase aire-líquido a través de la superficie del tejido y permite formación de imágenes en un microscopio invertido. Melanoblastos, un componente de la piel en desarrollo, están marcados con fluorescencia que permite su comportamiento que debe observarse mediante microscopía confocal.
Abstract
Melanoblastos son la cresta neural precursoras de melanocitos derivados; las células responsables de la producción de pigmento en la piel y el cabello. Melanoblastos migran a través de la epidermis de embrión donde posteriormente colonizan el cabello folículos en desarrollo 1,2. Neural migración celular cresta se estudió extensamente in vitro, pero los métodos in vivo todavía no están bien desarrollados, sobre todo en los sistemas de mamíferos. Una alternativa es utilizar ex vivo cultivo organotípico 3-6. Cultura de ratón de la piel embrionaria requiere el mantenimiento de una interfase aire-líquido (ALI) a través de la superficie del tejido 3,6. De alta resolución en vivo de imágenes de ratón de la piel embrionaria se ha visto obstaculizada por la falta de un buen método que no sólo mantiene este ALI sino que también permite la cultura a ser invertida y por lo tanto compatible con distancia de trabajo corta lentes de objetivo y microscopios confocales más. Este artículo describe las mejoras recientes a una metanfetaminadesde que utiliza una membrana permeable a los gases para superar estos problemas y permitir de alta resolución de imagen confocal de la piel embrionaria en cultivo ex vivo 6. Mediante el uso de un melanoblasto Cre-recombinasa específica expresando línea de ratones combinado con la línea reportero R26YFPR podemos etiquetar con fluorescencia la población melanoblasto dentro de estos cultivos de piel. La técnica permite vivir de imágenes de melanoblastos y la observación de su comportamiento y las interacciones con el tejido en el que se desarrollan. Los resultados representativos se incluyen para demostrar la capacidad de vivir-image 6 cultivos en paralelo.
Introduction
Tradicionalmente la piel embrionaria se ha cultivado mediante la disección de la embrión de ratón y de montaje sobre una membrana de policarbonato Nuclepore. La membrana se hace flotar entonces en medio de cultivo, manteniendo así una interfaz aire-líquido a través de la superficie del tejido en desarrollo 3,4. Esta técnica ha sido utilizada para someter a ensayo el comportamiento melanoblasto mediante la fijación del tejido y la evaluación de la distribución melanoblasto utilizando β-galactosidasa como marcador 7. Hemos desarrollado un método que permite melanoblastos de imágenes en directo de la etiqueta fluorescente en ex vivo cultivo de piel 6. A continuación se describe el método en detalle de la disección, para configurar, para vivir de imagen confocal y se incluyen algunas mejoras recientes.
Melanoblastos son los precursores embrionarios de los melanocitos, las células que producen el pigmento en el cabello y la piel. Melanoblastos surgen en la cresta neural adyacente al tubo neural en torno al día embrionario 9 (E9) en el ratón en desarrollo embryo. Posteriormente que migran a lo largo de una vía dorsolateral entre el ectodermo y los somitas en desarrollo. En E12.5 se mueven de la dermis a la epidermis, donde proliferan y continúan su migración. El patrón folículo piloso primaria comienza a formarse en la epidermis en E14.5 y E15.5 por melanoblastos están localizando a estos folículos. Para una revisión del desarrollo melanoblasto / melanocito ver Thomas & Erickson (2008) 1. Con el fin de etiquetar la población melanoblasto hemos combinado Tyr :: animales CREB que expresan Cre-recombinasa impulsado por el promotor de la tirosinasa de ratón con 8 animales R26YFPR que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) condicionalmente desde el locus ROSA26 9.
Se describe un método para la piel y la captura de imágenes de cultivo de embriones utilizando un microscopio confocal invertido. Se forma el método original descrito en Mort et al. (2010) 6 está adaptada. La presentemétodo permite formación de imágenes en un formato de 6 pocillos y se elimina la dependencia de las membranas Nuclepore y en Matrigel para apoyar la cultura. En lugar usando un pequeño bloque de agarosa al 1% para estabilizar la piel embrionaria. Extracción de la dependencia de Matrigel es importante, especialmente en situaciones en las que la respuesta de la piel embrionaria a factores de crecimiento solubles es el foco de estudio. Nuestro método original ya se ha utilizado para obtener nuevos conocimientos sobre el desarrollo melanoblasto 10-13 y esperamos que las mejoras que describimos aquí se hacen más potente como una técnica experimental especialmente cuando múltiples culturas paralelas son un requisito.
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Protocol
Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales bajo licencia por el Ministerio del Interior del Reino Unido (número de licencia del proyecto PPL 60/3785 y 60/4424).
1. Preparación
- Etiquetar los melanoblastos en la piel en desarrollo mediante la combinación de una línea de ratones que expresan Cre-recombinasa apropiada con una línea de ratones reportero fluorescente. Tyr :: CreA, Tyr :: CREB 8 y Wnt1 :: Cre 14 se han utilizado con éxito como líneas de Cre-expresando y R26YFPR 9 como línea reportero.
- Preparar el medio de cultivo en una campana de flujo laminar; complementar medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con (1% v / v de penicilina / estreptomicina), 10% v / v de suero de ternera fetal y 0,584 g / l de L-glutamina.
- El aparato de formación de imágenes en vivo se describe en la Figura 1 esterilizar la base de la cámara de formación de imágenes, al limpiar con etanol al 70%. Esterilizar los insertos, clips de imágenes, y las juntas tóricas remojando overnight en etanol al 70%. Use una tapa estéril de una placa de 6 pocillos que la tapa de la cámara.
- La superficie inferior de la cámara de formación de imágenes se compone de una membrana lummox mantiene en su lugar por una junta tórica (Figura 1). Comience con un gas permeable plato lummox 35 mm. Coloque el plato sobre la cámara de imágenes y cortar la membrana permeable a los gases con una hoja de afeitar afilada sola. Empuje la junta tórica sobre la membrana para asegurar que a la cámara de formación de imágenes.
- Los clips de imágenes (6 en total) sujetan la piel embrionaria en su lugar (Figura 1) antes de su uso, se rellenarán con un 1% de agarosa. Prepare una solución al 2% de agarosa con dH 2 O estéril en el microondas y enfriamiento a 60 ° C. Mezcla 1:1 con 10 ml de medio de cultivo (véase el paso 2) precalentado a 60 ° C. Párese los 6 clips de imagen en una placa de 6 pocillos estériles. Por goteo la solución de agarosa al 1% en el centro de cada clip con una multa Pastette y dejar enfriar. Añadir 1 ml de PBS estéril frío a cada pocillo para evitar la unagarose se sequen. Los clips de formación de imágenes pueden ser almacenadas durante varias horas en PBS.
- Para llevar a cabo la delicada separación de la piel embrionaria y de manejar el tejido diseccionado utilizar el "método del palillo del pelo" como se describe en Kashiwagi et al. 3 En lugar de utilizar un palillo un kebab brocheta de bambú se puede utilizar. Hacer una pequeña hendidura en el extremo plano de la brocheta utilizando una hoja de afeitar afilada única e insertar un cepillo de dientes de cerdas suaves. Recorte el pincho de modo que es de aproximadamente 15 cm de longitud.
- Utilice un microscopio confocal con una cámara ambiental completa o etapa superior de la cámara proporcionando 5% de CO 2 en el aire. Precalentar la platina del microscopio a 37 ° C durante al menos 1 h antes de la formación de imágenes. Esto ayuda a evitar la dispersión de la muestra causado por la expansión de los componentes de la plataforma como se calientan.
- Prepare un conjunto de múltiples posiciones mediante el software de control del microscopio para que se pueda centrar rápida y fácilmente en el medio de cada cultura para hacer una experimentaciónt.
2. Procedimiento
- Mate de los ratones y designar el primer día post coito como día E0.5. Al día E14.5, sacrificar la hembra por dislocación cervical y exponer la cavidad del cuerpo haciendo una pequeña incisión en la línea media, separando la piel hacia la cabeza y la cola y luego cortar el peritoneo subyacente y repique de vuelta a cada lado del cuerpo. Diseccionar el útero en PBS estéril fría sosteniendo firmemente con unas pinzas y cortar con tijeras a lo largo del mesometrio utilizando tijeras quirúrgicas. Mantenga el útero en hielo hasta su utilización. Para una descripción detallada, véase Shea et al. (2007) 15.
- Diseccionar embriones de útero cortando en primer lugar la longitud de la pared uterina con tijeras quirúrgicas para liberar la decidua y luego la disección de los embriones de la decidua tirando de ellos, aparte de dos pares de pinzas finas. Pantalla para la expresión del indicador fluorescente (si es necesario).
- Cull embriones por decapitación antes de la disección. Subseliminar equently la cola y las extremidades traseras y luego las patas delanteras utilizando una hoja de afeitar afilada sola. Conservar el tejido para el genotipado, si es necesario.
- Hacer una incisión en la zona ventral cerca de la línea media en dirección rostro-caudal. El uso de los palillos del pelo descrito en la etapa 1.6, se burlan cuidadosamente lejos de la piel del tejido conjuntivo subyacente girar el embrión al mismo tiempo. No quite la piel por completo, sino más bien dejar que se adjunta a lo largo del borde más ventral de la primera incisión.
- Es importante no dejar que la piel se arrugó, ya que es entonces muy difícil de montar. Para evitar esto, aplanar la piel usando los palillos del pelo (cara dérmica hacia arriba) en la superficie de un plato de Petri en seco y luego se corta distancia del tronco de embriones utilizando una hoja de afeitar afilada sola. El lado dérmico se puede distinguir de la lado de la epidermis por la observación cuidadosa de la unión entre el tejido diseccionado y el embrión antes de que se retira la piel. El área del tejido diseccionado esaproximadamente 0,5 mm 2 cuando la disección de un embrión E14.5.
- Coloque un clip de formación de imágenes en la parte superior de la piel para que la agarosa está en contacto con el lado dérmico del tejido. Dejar reposar durante 60 segundos y luego, con cuidado se burlan de los bordes del tejido por los lados de la pinza. Invierta el clip y utilizar el pelo se pega a aplanar la piel y eliminar las burbujas de aire, teniendo cuidado de tocar la superficie del tejido (en el área que va a ser fotografiada) lo menos posible.
- Utilice hilo de sutura de seda para atar la piel para el clip de imágenes usando dos nudos simples pulgar a cada lado de la pinza de imágenes para que se contraen y tire de la piel en la ranura cerca de la parte superior del clip. Invierta el clip, empuje interior de la inserción de imágenes y colocar en la base. Llene el inserto con ~ 5 ml de medio de cultivo (véase el paso 1.2). Figura 1 describe el montaje de la cámara de imágenes.
- Repita Protocolo para las 5 muestras restantes.
3. VivirImaging
- La cámara de imágenes tiene las mismas dimensiones que una placa de 6 pocillos estándar. Utilice un inserto placa apropiada para montar la cámara sobre la platina del microscopio confocal.
- Se requiere una etapa automatizado para la imagen de las culturas en paralelo. Definir las seis posiciones de la imagen en el software confocal. Los ajustes exactos dependerán de la capacidad del microscopio usado. Normalmente, una pequeña z-stack (3-5 z posiciones para dar cuenta de cualquier variación etapa) se utiliza en cada una de las 6 posiciones y una z-stack se captura cada 2 min durante 18 a 24 horas. Para aplicaciones de formación de imágenes en vivo generalmente es ventajoso utilizar una más ancha que ajuste del agujero de alfiler ópticamente óptima para reducir la potencia del láser y el número de z secciones requeridas.
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Representative Results
La figura 2 muestra los resultados representativos de un experimento de lapso de tiempo utilizando la piel embrionaria de Tyr :: CREB x embriones R26YFPR en E14.5. 6 cultivos de piel embrionarias fueron imágenes por microscopía confocal cada 2 min durante 18 h. El paquete de software de análisis de imágenes ImageJ software gratuito se utilizó para analizar el comportamiento de los melanoblastos etiquetados-YFP en las 6 películas. Los melanoblastos fueron rastreados automáticamente utilizando el plugin wrMTrck desarrollado por Jesper Søndergaard Pedersen ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) los resultados de rastreo se muestran en la Figura 2. Movies 1-3 son representativos del experimento y corresponden a los grupos A y G. Se muestra la luz transmitida, YFP y vistas compuestas respectivamente. La población melanoblasto migración es extraordinariamente activo. Las células se mueven casi constantemente y sólo se detienen cuando están a punto de dividirse por mitosis. También es posible observar el desarrollo del patrón de folículo piloso primaria sobre el período de cultivo en el canal de luz transmitida (Figuras 3A-3X y Película 1).
.. Figura 1 Equipos y configuración R: La base de la cámara de imágenes en vivo se compone de una carcasa de metacrilato transparente con dimensiones exteriores idénticas a una placa de cultivo de 6 pocillos. Contiene seis hoyos en los que los 6 conjuntos de cámara individuales pueden Ranura B:. Cada inserto consta de 4 componentes; un clip de formación de imágenes, una pieza de inserción de formación de imágenes, una membrana lummox, y una junta tórica. El clip y el inserto se torneados de plástico acetil negro, encontramos que esto tenga la autofluorescencia más bajo de los plásticos que probamos. La junta tórica está hecha de un PVCD se utiliza para sujetar la membrana lummox en la parte inferior de la pieza de inserción de formación de la interfaz aire-líquido (ALI). El clip de formación de imágenes (acetil negro) tiene varios agujeros para permitir la circulación de medio de cultivo C:. El eje central de la pinza se llena con 1% de agarosa antes de su uso para proporcionar una superficie plana sólida sobre la que montar la piel. La piel está unido a la pinza con hilo de sutura antes de ser empujado a la pieza de inserción, intercalando la piel entre la agarosa y la membrana lummox. El inserto se llena con medio de cultivo D:. Para diseccionar y manipular la piel embrionaria un solo cepillo de dientes de cerdas se monta en una ranura en el extremo plano de un kebab brocheta de bambú. Un par de palillos del pelo se puede utilizar en combinación con unas pinzas finas para diseccionar la piel embrionaria y montar en la cámara de imágenes E:.. Fotografías de los componentes detallados en la AC Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los resultados representativos de 6 películas grabadas en paralelo. AF: Seguimiento de los resultados de 6 películas grabadas en paralelo para demostrar las capacidades del sistema. Cada película fue grabado en los puntos de tiempo 2-min para un total de 18 horas (ver Películas 1-3 para la película correspondiente de los paneles A y G). Las posiciones de las células en una trama de la película se muestran y los resultados del rastreo se superponen en la parte superior GL:. Resumen de los resultados de seguimiento de traza como cero los datos de seguimiento.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Figura 3 Imágenes representativas de películas a intervalos de desarrollo de los folículos del pelo y de una mitosis melanoblasto someterse AX:.. Seleccionado, recorta los fotogramas de la película 1 folículos primarios se hacen visibles durante el periodo de cultivo de piel 0-18 h.. Una LUT se aplicó a las imágenes A'-X. ': Seleccionado, recortada fotogramas de la película 2 Imágenes representativas de melanoblastos que migran en la epidermis en desarrollo y una celda individual (ver flecha en A.') Mitosis sometidos (flecha en T ') . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: resultado Representante del canal de luz transmitida desde un time-lapse experimento de 18 horas. </ Strong> El patrón del folículo piloso primaria, aunque no es evidente en el inicio de la película, se vuelve más importante que la cultura progrese.
Película 2: . Representante resultado del canal de YFP de un time-lapse experimento de 18 horas La población melanoblasto es una población muy dinámica y migratorias. Células estacionarias Raras son por lo general experimentan mitosis (ver Figura 3).
Movie 3: . consecuencia Representante del canal compuesto de un time-lapse experimento de 18 horas La población melanoblasto se puede ver a migrar dentro de la epidermis en desarrollo e interactuar con los folículos pilosos en desarrollo.
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Discussion
Se describe un método para la cultura de la piel embrionaria que es particularidad susceptible imágenes de células vivas que en microscopios confocal invertido. El método incluye las recientes mejoras que permiten a los 6 cultivos para obtener imágenes en paralelo y elimina la dependencia de matrigel y membranas Nuclepore del método original 6. La diferencia técnica fundamental de técnicas similares es el uso de una membrana permeable a los gases lummox para establecer una interfaz aire-líquido y también para actuar como un cubreobjetos. Hemos logrado mantener los cultivos con la imagen confocal continua durante hasta 48 horas. La alta resolución y una excelente relación señal-ruido de las imágenes de confocal permite el seguimiento automático de células para analizar el comportamiento melanoblasto en las películas a intervalos resultantes.
Utilizando esta técnica es posible investigar la dinámica de la dispersión melanoblasto y estudiar su interacción con la epidermis y los folículos pilosos en desarrollo. La vía fundamentaleps en el protocolo son para llevar a cabo una disección cuidadosa que no daña la epidermis en desarrollo y para montar el lado dérmico muestras de la piel contra la agarosa sin dobleces o estiramientos. El procedimiento descrito en este artículo funciona mejor entre E13.5 y E15.5. Antes E13.5 la piel es muy frágil y después E15.5 es relativamente gruesa y difícil de penetrar por microscopía confocal. Las capacidades del sistema de microscopio usado también son muy importantes. Lo general el uso de un microscopio confocal Nikon A1R equipado con sistema de Nikon propietaria perfecta enfoque (PFS). El uso de PFS reduce en gran medida el número de malas películas producidas por la etapa de deriva, los sistemas similares están disponibles para otras plataformas.
Una desventaja de esta técnica es el requisito de cultura equipo especializado. Sin embargo, el diseño es simple y la cámara podría ser montado fácilmente por cualquier pequeño taller técnico. En resumen, presentamos un método simple que debe ser de amplio uso para studies del desarrollo embrionario de la piel y el comportamiento melanoblasto. Se prevé que la técnica también podría ser modificado para otros escenarios en los que una interfaz aire-líquido es un requisito para el cultivo con éxito.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por la financiación básica del Consejo de Investigación Médica. Estamos muy agradecidos a Craig Nicol para preparar los dibujos técnicos. Estamos muy agradecidos a Mateo Pearson y Paul Perry por su apoyo de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
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