Summary
Vi beskriver dissektion og ex vivo kultur mus embryonale hud. Dyrkningssystemet opretholder en luft-væske-grænsefladen på tværs af vævsoverfladen og giver billeder på et inverteret mikroskop. Melanoblasts, en komponent i at udvikle hud, er fluorescens-mærkede lade deres adfærd til at blive observeret ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Abstract
Melanoblasts er den neurale crest afledte forløbere for melanocytter; de celler, der er ansvarlige for at producere pigment i hud og hår. Melanoblasts vandrer gennem epidermis af embryonet, hvor de efterfølgende kolonisere udvikle hårsækkene 1,2. Neuralkam cellemigrering er grundigt undersøgt in vitro, men in vivo er stadig ikke veludviklet, især i mammale systemer. Et alternativ er at bruge ex vivo organotypisk kultur 3-6. Kultur af muse embryonale hud kræver opretholdelse af en luft-væske-grænsefladen (ALI) på tværs af overfladen af vævet 3,6. Høj opløsning levende billeddannelse af mus embryonale hud har været hæmmet af manglen på en god metode, der ikke kun vedligeholder denne ALI men giver også mulighed kulturen skal vendes og derfor forenelig med kort arbejdstid afstand objektive linser og mest konfokale mikroskoper. Denne artikel beskriver de seneste forbedringer til et method der bruger en gasgennemtrængelig membran til at overvinde disse problemer og giver høj opløsning konfokal billeddannelse af embryonale hud ex vivo kultur 6. Ved at bruge en melanoblast specifik Cre-rekombinase udtrykker mus linje kombineret med R26YFPR reporter linje, vi er i stand til fluorescens mærke melanoblast befolkning inden for disse hud kulturer. Teknikken tillader levende billeddannelse af melanoblasts og observation af deres adfærd og interaktioner med det væv, hvor de udvikler sig. Repræsentative resultater er medtaget for at demonstrere evne til at leve-image 6 kulturer i parallel.
Introduction
Traditionelt embryonale huden er blevet dyrket ved at dissekere fra muse-embryoner og montering på en polycarbonat Nuclepore membran. Membranen derefter flød på dyrkningsmediet, og opretholder således en luft-væske-grænseflade hen over overfladen af det udviklende væv 3,4. Denne teknik er blevet brugt til at analysere melanoblast adfærd ved fastsættelse af væv og vurdere melanoblast distribution via β-galactosidase som markør 7. Vi har udviklet en metode, der giver levende billeddannelse af fluorescensmærkede melanoblasts i ex vivo hud kultur 6. Her beskriver vi metoden i detaljer fra dissektion, at setup, for at leve konfokal billedbehandling og omfatter nogle af de seneste forbedringer.
Melanoblasts er de embryonale forstadier af melanocytter, de celler, der producerer pigment i hår og hud. Melanoblasts opstå i neurale våbenskjold siden neuralrøret på omkring embryonale dag 9 (E9) i udviklingslandene mus embryo. Efterfølgende de vandrer langs en dorsolaterale gangsti mellem ectoderm og udviklingslandene somitter. Ved E12.5 de flytter fra dermis til epidermis, hvor de formerer sig og fortsætte deres migration. Den primære hårsækken mønster begynder at dannes i epidermis ved E14.5 og E15.5 melanoblasts er lokalisere disse follikler. For en gennemgang af melanoblast / melanocyt udvikling se Thomas & Erickson (2008) 1.. For at mærke melanoblast befolkning har vi kombineret Tyr :: Creb dyr, der udtrykker Cre-rekombinase drevet af muse tyrosinase promotor 8 med R26YFPR dyr, der udtrykker gult fluorescerende protein (YFP) betinget fra ROSA26 locus 9.
Vi beskriver en metode til kultur embryonale hud og tage billeder ved hjælp af en omvendt konfokal mikroskop. Det er tilpasset form oprindelige metode beskrevet i Mort et al. (2010) 6. Den foreliggendefremgangsmåde muliggør billeddannelse i en 6-brønds format og fjerner afhængighed Nuclepore membraner og matrigel at støtte kulturen. I stedet ved hjælp af en lille blok af 1% agarose at stabilisere embryonale hud. Fjernelse af afhængighed matrigel er vigtigt, især i situationer, hvor svaret fra embryonale hud opløselige vækstfaktorer er i fokus for undersøgelsen. Vores oprindelige metode er allerede blevet brugt til at få ny indsigt i melanoblast udvikling 10-13, og vi forventer, at de forbedringer, vi beskriver her, vil gøre det mere kraftfuld som en eksperimentel teknik især hvor flere parallelle kulturer er et krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer under licens af det britiske indenrigsministerium (projekt licensnummer PPL 60/3785 og 60/4424).
1.. Forberedelse
- Mærk melanoblasts i udviklingslandene huden ved at kombinere en passende Cre-rekombinase udtrykker mus linje med en fluorescerende reporter mus linje. Tyr :: CreA, Tyr :: CREB 8 og Wnt1 :: Cre 14 er blevet anvendt med succes som Cre-udtrykkende linjer og R26YFPR 9 som reporter linje.
- Forbered dyrkningsmediet i en laminær strømning; supplere Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med (1% v / v penicillin / streptomycin), 10% v / v føtalt kalveserum og 0,584 g / l L-glutamin.
- De levende imagografiapparat er skitseret i figur 1 Steriliser imaging kammer basen ved at tørre ned med 70% ethanol. Sterilisere skær, billedbehandling klip, og O-ringe ved opblødning overnight i 70% ethanol. Brug en steril låget fra en 6-brønds plade som låget af kammeret.
- Den nederste overflade af den billeddannende kammer består af en lummox membran holdes på plads af en O-ring (figur 1). Start med en 35 mm gasgennemtrængeligt lummox fad. Sæt fadet over imaging kammer og klip gasgennemtrængelig membran med en enægget barberblad. Skub O-ring over membranen for at fastgøre den til billeddannelse kammeret.
- De billeddiagnostiske clips (6 i alt) fastspænde embryonale hud på plads (Figur 1), før brug, de skal fyldes med 1% agarose. Forbered en 2% opløsning af agarose med sterilt dH2O ved microwaving og afkøling til 60 ° C. Mix 01:01 med 10 ml dyrkningsmedium (se trin 2) forvarmet til 60 ° C. Stand de 6 billeddannende klip i en steril 6-brønds plade. Dryp 1% agaroseopløsning i midten af hvert klip med en fin pastette og lad den afkøle. 1 ml koldt sterilt PBS til hver brønd for at forhindre etgarose tørrer ud. De billeddiagnostiske klip kan opbevares i flere timer i PBS.
- At udføre den vanskelige adskillelse af embryonale hud og til at håndtere det dissekerede væv bruge 'hår stick metode "som beskrevet i Kashiwagi et al. 3. I stedet for at bruge en spisepind en bambus kebab spyddet kan anvendes. Lav en lille slids i den flade ende af spyd ved hjælp af et enægget barberblad og indsætte en blød tandbørste børster. Trim spyddet, så det er cirka 15 cm i længden.
- Brug et konfokalt mikroskop med en fuld klimakammer eller stadiet øverste kammer give 5% CO2 i luft. Opvarmning af objektbordet til 37 ° C i mindst 1 time før billeddannelse. Dette hjælper med at forhindre prøve afdrift forårsaget af udvidelse af scenen komponenter, som de varme op.
- Forbered en multi-indstillede position ved hjælp af mikroskop kontrol software, så man hurtigt og nemt kan fokusere på midten af hver kultur til at oprette et eksperit.
2.. Procedure
- Parre mus og udpege den første dag efter coitum som dag E0.5. På dag E14.5, frasortering hun ved cervikal dislokation og udsætte kropskaviteten ved at lave en lille midtlinjeincision, trække fra hinanden huden mod hoved og hale, og derefter skære den underliggende bughinden og pealing tilbage på begge sider af kroppen. Dissekere livmoderen i koldt steril PBS ved at holde fast med en pincet og klippe langs mesometrium hjælp kirurgiske saks. Hold livmoderen på is indtil brug. For en detaljeret beskrivelse se Shea et al. (2007) 15.
- Dissekere embryoner fra uterus ved først at skære længden af livmodervæggen med kirurgisk saks til at frigive decidua og derefter dissekere embryoner fra decidua ved at trække dem fra hinanden med to par fine tænger. Skærm til fluorescerende reporter ekspression (hvis nødvendigt).
- Frasortering embryoner ved halshugning før dissektion. Subsequently fjerne hale og bagben og derefter forbenene hjælp af en enkelt kantet barberblad. Behold væv til genotypebestemmelse hvis det kræves.
- Lave et snit i ventrum tæt på midterlinjen i en Rostro-haleretningen. Brug af hår pinde er beskrevet i trin 1.6, omhyggeligt drille væk huden fra det underliggende bindevæv dreje embryo på samme tid. Du må ikke fjerne huden fuldstændigt, men snarere lade det fastgjort langs den ventrale kant længst væk fra det første snit.
- Det er vigtigt ikke at lade huden bliver skruet op, da det er så meget vanskeligt at montere. For at forhindre dette, flade ud huden ved hjælp af hår sticks (dermale side up) på overfladen af en tør petriskål og derefter skåret væk fra embryonet stammen ved hjælp af en enægget barberblad. Den dermale side kan skelnes fra den epidermale side ved omhyggelig observation af forbindelsen mellem det dissekerede væv og embryoet før huden fjernes. Arealet af det dissekerede væv ercirka 0,5 mm 2, når dissekere en E14.5 embryo.
- Placer en billeddannelse klip på toppen af huden, så agarosen rører den dermale side af vævet. Lad det stå i 60 sek og derefter forsigtigt drille kanterne af vævet op siderne af klippet. Vend klippet og bruge hår stikker at flade ud i huden og fjerne eventuelle luftbobler, der tager sig at berøre overfladen af vævet (i det område, der vil blive afbildet) så lidt som muligt.
- Brug silkesutur tråd til at binde huden til billeddannelse klippet via to simple thumb knuder på hver side af den billeddannende klippet så de stramme og trække huden ind i rillen tæt på toppen af klippet. Vend klippet, skubbe inde i billedbehandling indsatsen og plads i basen. Fyld indsatsen med ~ 5 ml næringssubstrat (se trin 1.2). Figur 1 skitserer samlingen af imaging kammer.
- Gentag Protokol for de resterende 5 prøver.
Lev 3..Imaging
- De billeddannende kammer har samme dimensioner som en standard 6-brønds plade. Brug en passende pladeindlægget at montere kammeret på scenen af konfokal mikroskop.
- En automatiseret trin er påkrævet for at billedet kulturer parallelt. Definer de seks positioner til billedet i konfokal software. De nøjagtige indstillinger vil afhænge af evnen til mikroskopet anvendes. Typisk en lille z-stabel (3-5 z-positioner for at tage hensyn til eventuel afdrift fase) anvendes i hver af de 6-stillingerne og en z-stak indfanges hver 2 min i 18-24 timer. For levende billedbehandlingsprogrammer er det generelt en fordel at bruge en større end optisk optimale pinhole indstilling for at reducere laser magt og antallet af z-sektioner påkrævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser repræsentative resultater fra en tidsforskydning eksperiment ved hjælp af embryonale hud fra Tyr :: Creb x R26YFPR embryoner ved E14.5. 6 embryonale hud kulturer blev afbildet ved konfokal mikroskopi hver 2 min i 18 timer. Freeware billedanalyse softwarepakke ImageJ blev anvendt til at analysere adfærden af YFP-mærkede melanoblasts i 6 film. De melanoblasts var automatisk spores ved hjælp af wrMTrck plugin er udviklet af Jesper Søndergaard Pedersen ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) tracking resultaterne vises i figur 2.. Movies 1-3 er repræsentative for eksperimentet og svarer til panelerne A og G. De viser det lys, YFP og sammensatte visninger hhv. Det migrerende melanoblast befolkning er overordentlig aktive. Celler bevæger næsten konstant og kun holde pause, når de er ved at dividere med miTosis. Det er også muligt at observere for udviklingen af den primære hårsækken mønster over perioden kultur i transmitteret lys kanal (figur 3A-3X og film 1).
.. Figur 1. Udstyr og opsætning A: Den levende billeddannelse kammer base består af en klar plexiglas kabinet med identiske udvendige dimensioner til en 6-godt kultur fad. Den indeholder seks huller, hvor de 6 individuelle kammer samlinger kan slot B:. Hvert indsatsen består af 4 komponenter; en imaging klip, en billeddannende indsats, en lummox membran, og en O-ring. Klippet og indsatsen er drejet fra sort acetyl plastik, vi fandt dette at have den laveste autofluorescens af plasten, vi testede. O-ringen er lavet af PVC etd bruges til at fastspænde lummox membranen på bunden af indsatsen danner luft væske interface (ALI). De billeddannende klip (sort acetyl) har flere huller til at tillade cirkulation af dyrkningsmedium C:. Den centrale aksel klippet er fyldt med 1% agarose før brug for at give en fast flade, hvor at montere huden. Huden er fastgjort til klemmen med suturtråd, før den skubbes ind i indsatsen, sandwiching huden mellem agarose og lummox membran. Indsatsen er så fyldt med dyrkningsmedium D:. At dissekere og manipulere embryonale hud en enkelt tand børste stritter er monteret i en slids i den flade ende af en bambus kebab spyd. Et par af hår pinde kan anvendes i kombination med fine tænger til at dissekere embryonale hud og montere i den billeddannende kammeret E:.. Fotografier af de komponenter, der er beskrevet i AC Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Repræsentative resultater af 6 film optaget parallelt. AF: Sporing resultaterne fra 6 film optaget i parallel for at demonstrere mulighederne i systemet. Hver film blev optaget ved 2 min tidspunkter i alt 18 timer (se film 1-3 for den tilsvarende film af paneler A og G). Positionerne af cellerne i ramme et af filmen vises og tracking resultater overlejret på toppen GL:. Sammenfatning af tracking resultater plottet som nulstillet sporing af data.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Figur 3 Repræsentative billeder fra time-lapse film af hårsækken udvikling og en melanoblast undergår mitose AX:.. Valgte beskåret frames fra Movie 1 Primære hårsækkene bliver synlige i den periode, hud kultur 0-18 timer.. En LUT blev anvendt til billederne A'-X '.: Udvalgte, beskæres billeder fra Movie 2 Repræsentative billeder af melanoblasts migrerer i udviklingslandene epidermis og en enkelt celle (se pil i A.') Undergår mitose (pil i T ') . Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Repræsentant resultat af transmitteret lys kanal fra en 18-timers time-lapse eksperiment. </ Strong> Den primære hår-follicle mønster, men ikke indlysende i starten af filmen, bliver mere fremtrædende som kulturen skrider frem.
Movie 2: . Repræsentant resultat af YFP kanal fra en 18-timers time-lapse eksperiment melanoblast befolkning er en meget dynamisk og vandrende befolkning. Sjældne stationære celler normalt undergår mitose (se figur 3).
Movie 3: . Repræsentant resultat af den sammensatte kanal fra en 18-timers time-lapse eksperiment melanoblast befolkning kan ses at migrere inden udviklingslandene epidermis og interagere med udviklingslandene hårsækkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode til kultur embryonale hud, der er særegne modtagelig for live-cell imaging på omvendte konfokal mikroskoper. Fremgangsmåden omfatter de seneste forbedringer, der tillader 6 kulturer skal afbildes parallelt og fjerner afhængigheden af matrigel og Nuclepore membraner af den oprindelige metode 6. Den afgørende tekniske forskel fra lignende teknikker er brugen af en gas-gennemtrængelige lummox membran for at etablere en luft flydende interface og også til at fungere som et dækglas. Vi har med succes fastholdt kulturerne med kontinuerlig konfokal billedbehandling i op til 48 timer. Den høje opløsning og fremragende signal-støjforhold af konfokale billeder til tillader automatiseret cellesporing at analysere melanoblast adfærd i de resulterende tidsforskudte film.
Ved hjælp af denne teknik er det muligt at undersøge dynamikken i melanoblast spredning og studere deres samspil med epidermis og udviklingslandene hårsækkene. Den kritiske steps i protokollen, at foretage en omhyggelig dissektion, der ikke beskadiger udviklingslandene epidermis og at montere hudprøver dermal side mod agarose uden knæk eller strækninger. Det er beskrevet i dette papir procedure fungerer bedst mellem E13.5 og E15.5. Før E13.5 huden er meget skrøbelig og efter E15.5 det er relativt tykke og hårde til at trænge ind ved konfokal mikroskopi. Funktionerne i mikroskopet system, der anvendes, er også meget vigtigt. Vi bruger typisk en Nikon A1R konfokal mikroskop udstyret med Nikons eget perfekt fokus-system (PFS). Brug PFS stærkt reducerer antallet af dårlige film forårsaget af fase afdrift, er til rådighed for andre platforme lignende systemer.
En ulempe ved denne teknik er kravet om specialiserede kultur udstyr. Men design er enkel og kammeret kunne let samles af enhver lille teknisk workshop. Sammenfattende præsenterer vi en simpel metode, skal være af bred anvendelse for studies af fosterudviklingen hud og melanoblast adfærd. Det forventes, at teknikken også kan modificeres til andre scenarier, hvor en luft-væske-grænsefladen er et krav for vellykket kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af grundlæggende finansiering fra Medical Research Council. Vi er taknemmelige for Craig Nicol for udarbejdelse af tekniske tegninger. Vi er taknemmelige for Matthew Pearson og Paul Perry for deres billeddannelse støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. Turksen, K. 289, Humana Press. 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), Cambridge, England. 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
