Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Hud og Live-avbildning av Melanoblast Migration

Summary

Vi beskriver disseksjon og ex vivo kultur av muse embryonale hud. Kultursystemet opprettholder en luft-væske-grensesnittet over vevsoverflaten og tillater avbildning på et invertert mikroskop. Melanoblasts, en komponent i utviklings hud, er fluorescensmerkede slik at deres atferd for å bli observert ved hjelp konfokalmikroskopi.

Abstract

Melanoblasts er neural crest avledet forløpere for melanocytter; cellene som er ansvarlige for produksjon av pigment i huden og håret. Melanoblasts migrere gjennom epidermis av embryoet hvor de senere kolonisere utvikle hårsekkene ^1,2. Neural crest celle migrasjon er grundig studert in vitro, men in vivo metoder er fortsatt ikke godt utviklet, særlig i pattedyr systemer. Ett alternativ er å bruke ex vivo organotypic kultur ^3-6. Kultur av muse-embryonale hud krever opprettholdelse av en luft-væske-grensesnittet (ALI) over overflaten av vevet ^3,6. Høyoppløselig live avbildning av mus embryonale huden har blitt hemmet av mangelen på en god metode som ikke bare opprettholder denne ALI men også lar kulturen å bli invertert, og derfor kompatibel med kort arbeidsavstand objektiv og mest confocal mikroskoper. Denne artikkelen beskriver de siste forbedringene til en method som bruker en gass-permeabel membran for å overvinne disse problemer og tillate høy oppløsning confocal avbildning av embryonale hud i ex vivo kultur ^6.. Ved å bruke en melanoblast bestemt Cre-recombinase uttrykke muselinje kombinert med R26YFPR reporter linjen er vi i stand til å fluorescently merke melanoblast befolkningen innenfor disse hud kulturer. Teknikken tillater levende-avbildning av melanoblasts og observasjon av deres atferd og interaksjoner med vevet der de utvikler. Representative resultater er inkludert for å demonstrere evnen til å leve-bilde 6 kulturer i parallell.

Introduction

Tradisjonelt embryonale huden har blitt dyrket ved å dissekere fra mus embryo og montering på et polykarbonat Nuclepore membran. Membranen blir så fløtet på kulturmediet, og dermed opprettholde en luft-væske-grensesnittet over overflaten av det fremkallende tissue ^3,4. Denne teknikken er blitt brukt for å bestemme melanoblast oppførsel ved å feste vevet og vurdering melanoblast fordeling ved hjelp β-galaktosidase som en markør ^7.. Vi har utviklet en metode som gjør at levende-avbildning av fluorescensmerkede melanoblasts i ex vivo hud kultur ^seks. Her beskriver vi metoden i detalj fra disseksjon, å sette opp, for å leve confocal bildebehandling og inkluderer noen nye forbedringer.

Melanoblasts er de embryonale forløpere av melanocytter, cellene som produserer pigment i hår og hud. Oppstår Melanoblasts i neural crest tilstøtende til det nevrale røret på rundt embryonisk dag 9 (E9) i den tredje muse embryo. Deretter de vandrer langs en dorsolaterale svei mellom ektoderm og utviklings somites. På E12.5 flytter de fra dermis til epidermis hvor de sprer og fortsette sin vandring. Den primære hårsekken mønster begynner å danne i epidermis på E14.5 og ved E15.5 melanoblasts er lokalisere til disse folliklene. For en gjennomgang av melanoblast / melanocyte utvikling se Thomas & Erickson (2008) ^1. For å merke melanoblast befolkningen har vi kombinert Tyr :: CREB dyr som uttrykker Cre-recombinase drevet av muse tyrosinase arrangøren ⁸ med R26YFPR dyr som uttrykker gul fluoriserende protein (YFP) betinget fra ROSA26 locus ^ni.

Vi beskriver en metode for å kultur embryonale hud og ta bilder ved hjelp av en invertert konfokal mikroskop. Den er tilpasset formen den opprinnelige metoden beskrevet i Mort et al. (2010) ^6.. ForeliggendeMetoden tillater avbildning i en 6-brønns format og fjerner avhengighet av Nuclepore membraner og på matrigel å støtte kulturen. Istedenfor ved hjelp av en liten blokk med 1% agarose for å stabilisere den embryoniske huden. Fjerne avhengigheten matrigel er viktig, spesielt i situasjoner der responsen fra embryonale huden til løselige vekstfaktorer er fokus for studien. Vår opprinnelige metoden har allerede blitt brukt til å få ny innsikt i melanoblast utvikling ^10-13 og vi forventer at de forbedringene vi beskriver her vil gjøre det mer kraftig som en eksperimentell teknikk spesielt der flere parallelle kulturer er et krav.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer under lisens av det britiske Home Office (prosjekt lisensnummer PPL 60/3785 og 60/4424).

En. Forberedelse

1. Merke melanoblasts i utviklings huden ved å kombinere en passende Cre-recombinase uttrykke mus tråd med et fluorescerende reporter mus linje. Tyr :: Crea, Tyr :: CREB ⁸ og Wnt1 :: Cre ¹⁴ har blitt brukt med hell som Cre-uttrykke linjer og R26YFPR ⁿⁱ som reporter linje.
2. Forbered kulturmediet i en laminær strømningshette; supplere Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med (1% v / v Penicillin / Streptomycin), 10% v / v føtalt kalveserum og 0,584 g / l L-glutamin.
3. Det levende bildeapparat er skissert i figur 1. Sterilavbildningskammeret base ved å tørke med 70% etanol. Steril innleggene, bildebehandlings klipp, og O-ringer av soaking overnight i 70% etanol. Bruk et sterilt lokk fra en 6-brønns plate som lokket av kammeret.
4. Den nedre overflaten på bildekammeret består av en lummox membran holdes på plass av en O-ring (fig. 1). Begynn med en 35 mm gasspermeabelt lummox fatet. Sett fatet over bildekammeret og kutte ut gass permeable membran med en enkelt edged barberblad. Skyv O-ringen over membranen til å feste den til bildebehandling kammeret.
5. Det tenkelig klips (6 totalt) spennes fast embryonale huden på plass (figur 1) før bruk må de fylles med 1% agarose. Forbered en 2% løsning av agarose med steril dH ₂ O ved mikrobølgeovnen og kjøling til 60 ° C. Bland 1:1 med 10 ml kulturmedium (se trinn 2) forvarmet til 60 ° C. Stå de seks bildeklipp i et sterilt seks-brønns plate. Drypp 1% agarose løsning inn til sentrum av hvert klipp med en fin pastette og avkjøl. Tilsett 1 ml kald steril PBS til hver brønn for å unngå at engarose tørker ut. Det tenkelig klipp kan lagres i flere timer i PBS.
6. For å utføre den skjøre separasjon av embryonale huden og for å håndtere de dissekerte vev bruke 'hair pinne-metoden "som beskrevet i Kashiwagi et al. ^3. I stedet for å bruke en chopstick en bambus kebab spyd kan brukes. Lag en liten rift i den flate enden av spyd med en enkelt edged barberblad og setter inn en myk tannbørste bust. Trim spyd, slik at det er ca 15 cm i lengde.
7. Bruk en konfokalmikroskop med en full miljøkammer eller iscenesette øverste kammer som gir 5% CO ₂ i lufta. Prewarm objektbordet til 37 ° C i minst 1 time før avbildning. Dette bidrar til å hindre at prøven avdrift forårsaket av utvidelse av scenekomponenter når de varmes opp.
8. Forbered en multi-posisjon er innstilt med mikroskop kontroll programvare, slik at man raskt og enkelt kan sentrere på midten av hver kultur for å sette opp en experiment.

2. Prosedyre

1. Mate mus og utpeke den første dagen innlegget coitum som dagen E0.5. Ved dag E14.5, innhente den kvinnelige ved cervikal dislokasjon og utsetter kroppshulrommet ved å lage en liten midtlinjesnitt trekke fra hverandre huden mot hodet og halen, og deretter å skjære det underliggende bukhule og pealing tilbake til hver sin side av kroppen. Dissekere livmoren i kaldt sterile PBS ved å holde fast med tang og snipping langs mesometrium hjelp kirurgisk saks. Hold livmoren på is inntil nødvendig. For en detaljert beskrivelse se Shea et al. (2007) ^15.
2. Dissekere embryoer fra livmoren ved først å kutte lengden av livmorveggen med kirurgiske sakser for å frigjøre decidua og deretter dissekere embryoene fra decidua ved å trekke dem fra hverandre med to par fin pinsett. Screen for fluorescerende reporter uttrykk (om nødvendig).
3. Cull embryoer ved halshogging før disseksjon. Subsequently fjerne halen og bakbena og deretter forbein hjelp av en enkelt edged barberblad. Beholde vev for genotyping hvis nødvendig.
4. Lag et snitt i ventrum nær midtlinjen i en rostro-caudal retning. Ved hjelp av de hår pinner som er beskrevet i trinn 1.6, omhyggelig erte bort huden fra det underliggende bindevev roterende embryoet på samme tid. Ikke fjern huden helt, men heller la det festet langs ventral kanten lengst fra første snittet.
5. Det er viktig ikke å la huden bli skrudd opp så det er da meget vanskelig å montere. For å forhindre dette, flate ut huden ved hjelp av håret pinner (dermal siden opp) på overflaten av en tørr Petri-skål, og deretter skjære bort fra embryo stammen ved hjelp av en enkelt kantet barberblad. Den dermale side kan skilles fra epidermal side ved nøye observasjon av forbindelsesstedet mellom den dissekerte vev og embryoet før huden fjernes. Arealet av det dissekerte vev erca 0,5 mm ² når dissekere en E14.5 embryo.
6. Plasser en avbildning klippet på toppen av huden, slik som agarose berører den dermale side av vevet. La det stå i 60 sek og deretter forsiktig erte kantene av vevet opp sidene av klemmen. Vend klippet og bruke håret stikker å flate ut huden og fjerne eventuelle luftbobler, ta vare å ta på overflaten av vevet (i området som vil bli fotografert) så lite som mulig.
7. Bruk silke sutur tråden for å binde huden til avbildning klippet ved hjelp av to enkle tommel knuter på hver side av avbildningsklemmen, slik at de stramme og trekke huden inn i sporet i nærheten av toppen av klemmen. Vend klippet, presse i bildebehandlings innsatsen og plass i basen. Fyll innsatsen med ~ 5 ml dyrkningsmedium (se trinn 1.2). Figur 1 skisserer sammenstillingen på bildekammeret.
8. Gjenta Protokoll for de resterende fem prøver.

Tre. LevImaging

1. Den bildeKammeret har samme dimensjoner som en standard 6-brønns plate. Bruk en egnet plate sette inn for å montere kammer på scenen av konfokalmikroskop.
2. En automatisert scenen er nødvendig for å image kulturene i parallell. Definer de seks posisjonene til bilde i confocal programvare. De nøyaktige innstillinger vil være avhengig av evnen til mikroskop. Vanligvis er en liten z-stabel (3-5 z-stillinger for å ta hensyn til hvilket som helst stadium drift) er brukt i hver av de 6-stillingene og en z-stabelen er tatt hvert 2 min for 18-24 timer. For live-bildebehandlingsprogrammer er det vanligvis en fordel å bruke et bredere enn optisk optimale pinhole innstillingen for å redusere laser makt og antall z-seksjoner som kreves.

Representative Results

Figur 2 viser representative resultater fra en tid forfalle eksperiment ved hjelp av embryonale hud fra Tyr :: CREB x R26YFPR embryoer ved E14.5. 6 embryonale hud kulturer ble fotografert ved konfokal mikroskopi hvert 2 min i 18 timer. Den freeware bildeanalyse programvarepakke ImageJ ble brukt til å analysere oppførselen til YFP-merket melanoblasts i de seks filmene. De melanoblasts var automatisk spores ved hjelp av wrMTrck plugin utviklet av Jesper Søndergaard Pedersen ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) sporingsresultater vises i figur 2. Filmer 1-3 er representative for eksperimentet og tilsvare paneler A og G. De viser overført lys, YFP og sammensatte visninger hhv. Den utvandrende melanoblast befolkningen er usedvanlig aktiv. Celler flytte nesten hele tiden og bare ta en pause når de er i ferd med å dele seg etter miTosis. Det er også mulig å observere utviklingen av den primære hårsekken mønster over for-kultur i overført lys-kanal (figurene 3A-3X og film 1).

.. Figur 1 Utstyr og oppsett A: Den direkte avbildning kammersokkelen består av en klar perspex boliger med identiske utvendige dimensjoner til en 6-godt kultur parabolen. Den inneholder seks hull hvori de 6 separate kammersammenstillinger kan sporet B:. Hver innsats består av fire komponenter; en avbildning klipp, en avbildning innsats, en lummox membran, og en O-ring. Klippet og innsatsen er dreiet fra svart acetyl plast, fant vi dette for å ha den laveste autofluorescence av plasten vi testet. O-ringen er laget av PVC end blir brukt til å klemme fast lummox membran på bunnen av innsatsen, som danner luft væske-grensesnittet (ALI). Den bildeklips (sort acetyl) har flere hull for å tillate sirkulasjon av kulturmedium C:. Den midtre aksel av klemmen er fylt med 1% agarose før bruk for å gi en fast flat overflate som å montere skin. Huden er festet til klemmen med sutur tråden før den blir skjøvet inn i innsatsen, sandwiching huden mellom agarose og lummox membran. Innsatsen blir deretter fylt med kultur medium D:. Å dissekere og manipulere den embryonale huden en enkelt tann pensel bust er montert inn i en spalte i den flate enden av en bambus kebab spyd. Et par av hår pinner kan brukes i kombinasjon med fin pinsett til å dissekere embryonale hud og montere i bildekammeret E:.. Fotografier av komponentene beskrevet i AC Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Representative resultater av seks filmer som er spilt inn parallelt. AF: Spore resultater fra seks filmer som er spilt inn parallelt vise mulighetene i systemet. Hver film ble spilt inn på to-min tidspunkter for totalt 18 timer (se filmer 1-3 for den tilsvarende film av paneler A og G). Posisjonene til cellene i en ramme av filmen er vist og sporingsresultatene er overlagret på toppen GL:. Oppsummering av sporingsresultatene plottet som nullet sporingsdata.

d/51352/51352fig3.jpg "/>
Figur 3 representative bilder fra time-lapse filmer av hårsekken utvikling og av en melanoblast gjennomgår mitose AX:.. Selected, beskjæres rammer fra Movie en Primær hårsekkene blir synlige over en periode på huden kultur 0-18 hr.. En LUT ble brukt på bildene A'-X. ': Selected, beskjæres rammer fra Movie 2 Representative bilder av melanoblasts migrerer i utviklings epidermis og en enkelt celle (se pil i A.') Gjennomgår mitose (pilen i T ') . Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Film 1: Representative resultat av det overførte lys-kanal fra en 18-timers tidsintervall eksperiment. </ Strong> Den primære hår-follicle mønster, men ikke tydelig i starten av filmen, blir mer fremtredende som kulturen utvikler seg.

Film 2: . Representant resultat av YFP kanal fra en 18-timers time-lapse eksperiment melanoblast befolkningen er en svært dynamisk og vandrende befolkningen. Sjeldne stasjonære celler blir vanligvis omgår mitose (se figur 3).

Movie 3: . Representant resultat av den sammensatte kanalen fra en 18-timers time-lapse eksperiment melanoblast befolkningen kan sees å migrere innenfor utviklings epidermis og samhandle med utviklings hårsekkene.

Discussion

Vi beskriver en metode for å kultur embryonale hud som er PARTICULARITY mottagelig for live-cell imaging på omvendte confocal mikroskoper. Fremgangsmåten omfatter nylige forbedringer som tillater seks kulturene som skal bli avbildet i parallell og fjerner avhengighet av matrigel og Nuclepore membraner av den opprinnelige metoden ^{til 6.} Den avgjørende forskjell teknisk av lignende teknikker er bruk av en gass-permeabel membran lummox å etablere en luft-væske-grensesnittet, og også til å fungere som et dekkglass. Vi har lykkes opprettholdt de kulturer med kontinuerlig confocal bildebehandling i opptil 48 timer. Den høye oppløsning og utmerket signal til støy-forhold på de confocal bilder tillater automatisert celle sporing å analysere melanoblast atferd i de resulterende time-lapse filmer.

Ved hjelp av denne teknikken er det mulig å undersøke dynamikken i melanoblast spredning og studere deres interaksjon med overhuden og utviklings hårsekkene. Den kritiske steps i protokollen er å gjennomføre en forsiktig disseksjon som ikke skader utviklings epidermis og å montere huden prøver dermal siden mot agarose uten knekk eller strekninger. Prosedyren som er beskrevet i denne artikkelen fungerer best mellom E13.5 og E15.5. Før E13.5 huden er meget skjøre, og etter E15.5 den er relativt tykk og vanskelig å trenge gjennom ved konfokal mikroskopi. Egenskapene til mikroskopet systemet som brukes er også svært viktig. Vi bruker vanligvis en Nikon A1R konfokalmikroskop utstyrt med Nikons egen perfekt fokussystem (PFS). Ved hjelp av PFS reduserer antallet dårlige filmer forårsaket av scenen drift, tilsvarende systemer er tilgjengelig for andre plattformer.

En ulempe ved denne teknikk er behovet for spesialisert utstyr kultur. Men designen er enkel og kammeret kan enkelt monteres av noen små tekniske verksted. I sammendraget presenterer vi en enkel metode som bør være av bred bruk for studies av embryonale hud utvikling og melanoblast atferd. Det er forventet at teknikken kunne også modifiseres for andre situasjoner hvor en luft-væske-grensesnittet er en forutsetning for vellykket kultur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high glucose	Biochrom AG	F0475	without phenol red
Penicillin	Sigma	P3032
Streptomycin	Sigma	S9137
Fetal calf serum	Hyclone	SV30160.03
Glutamax	Gibco	35050-038
Ethanol	Generic
Live imaging chamber	Custom made
Lummox dishes	Sarstedt	94.6077.410
6-well plate	Greiner Bio-One	657-160
Single edged razor blade	Fisher Scientific	1244-3170
Agarose	Biogene	300-300
Fine pastette	Generic
PBS	Generic
Kebab skewers	Waitrose		Bamboo BBQ skewers 30 cm
Toothbrush	Generic
Petri dishes	Greiner Bio-One	633185
Suture thread	Look	SP115	Black silk suture thread