Summary
Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden.
Abstract
Melanoblasten sind die Neuralleiste Vorläufer von Melanozyten; die Zellen zur Herstellung des Pigments in Haut-und Haar verantwortlich. Melanoblasten wandern durch die Epidermis des Embryos, wo sie anschließend besiedeln die Entwicklungs Haarfollikel 1,2. Neuralleiste Zellmigration wird weitgehend in vitro untersucht, aber in vivo-Methoden sind immer noch nicht gut entwickelt, vor allem in Säugetiersystemen. Eine Alternative ist die ex vivo organotypischen Kultur 6.3 zu verwenden. Kultur von embryonalen Maus-Haut erfordert die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Interface (ALI) über die Oberfläche des Gewebes 3,6. Hochauflösende Live-Bildgebung von embryonalen Maus-Haut hat sich durch den Mangel an einer guten Methode, die nicht nur unterhält diese ALI, sondern ermöglicht auch die Kultur umgekehrt werden und daher mit kurzen Arbeitsabstand und die meisten Objektive konfokalen Mikroskopen behindert. Dieser Artikel beschreibt die jüngsten Verbesserungen an einen Method dass verwendet eine gasdurchlässige Membran, diese Probleme zu überwinden und hochauflösenden konfokalen Imaging der embryonalen Haut in Ex-vivo-Kultur 6. Durch die Verwendung eines spezifischen Melanoblasten Cre-Rekombinase exprimierenden Mauslinie in Kombination mit der R26YFPR Reporter Linie sind wir in der Lage, innerhalb dieser Hautkulturen fluoreszenz beschriften Sie die Melanoblasten Bevölkerung. Die Technik ermöglicht Live-Bildgebung von Melanoblasten und der Beobachtung ihres Verhaltens und ihrer Wechselwirkungen mit dem Gewebe, in dem sie sich entwickeln. Repräsentative Ergebnisse sind enthalten, um die Fähigkeit zu leben-Bild 6 Kulturen parallel zu demonstrieren.
Introduction
Traditionell embryonalen Haut durch Sezieren von der Maus Embryo und die Montage auf einem Polycarbonat Nuclepore Membran kultiviert. Die Membran wird dann auf Kulturmedium schwimmen, damit die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf der Oberfläche der Entwicklungs Gewebe 3,4. Diese Technik wurde verwendet, um Melanoblasten Verhalten durch Fixieren des Gewebes und der Beurteilung Melanoblasten Verteilung mit β-Galactosidase als Markierungs 7 testen. Wir haben eine Methode, die Live-Imaging von fluoreszenzmarkierten Melanoblasten in ex vivo Hautkultur 6 ermöglicht. Hier beschreiben wir die Methode im Detail von der Dissektion zu gründen, um die konfokale Bildgebung und umfassen einige der jüngsten Verbesserungen.
Melanoblasten sind die embryonalen Vorstufen der Melanozyten, die Zellen, die Pigment im Haar und Haut. Melanoblasten entstehen in der Neuralleiste neben dem Neuralrohr bei rund embryonalen Tag 9 (E9) in der Entwicklung von e-Mausmbryo. Anschließend wandern sie entlang einer dorsolateralen Weg zwischen Ektoderm und den Entwicklungs Somiten. Bei E12.5 sie aus der Dermis zu bewegen, um die Epidermis, wo sie sich vermehren und setzen ihre Migration. Der primäre Haarfollikel Muster beginnt in der Epidermis bei E14.5 und E15.5 durch Melanoblasten werden, um die Lokalisierung dieser Follikel zu bilden. Für einen Überblick über Melanoblasten / Melanozyten-Entwicklung zu sehen Thomas & Erickson (2008) ein. Um die Bevölkerung Melanoblasten beschriften wir Tyr kombiniert :: CREB Tiere, die Cre-Rekombinase-von der Maus Tyrosinase-Promotor mit 8 R26YFPR Tiere, die gelb fluoreszierendes Protein (YFP) bedingt von der ROSA26 Locus 9 auszudrücken angetrieben auszudrücken.
Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut und die Aufnahmen mit einem inversen konfokalen Mikroskop. Es wird in der Form angepasst Mort et al ursprünglichen Methode. (2010) 6. Die vorliegendeVerfahren ermöglicht die Abbildung in einer 6-Well-Format und entfernt die Abhängigkeit von Nuclepore Membranen und auf Matrigel, um die Kultur zu unterstützen. Statt mit einem kleinen Block von 1% Agarose, um die embryonale Haut zu stabilisieren. Entfernen der Abhängigkeit von Matrigel ist besonders in Situationen, in denen die Reaktion der embryonalen Haut löslichen Wachstumsfaktoren im Mittelpunkt der Untersuchung wichtig. Unsere ursprüngliche Methode wurde bereits verwendet worden, um neue Einblicke in die Entwicklung Melanoblasten 10-13 zu gewinnen, und wir erwarten, dass die Verbesserungen, die wir hier beschreiben, wird es stärker als experimentelle Technik vor allem, wenn mehrere parallele Kulturen sind eine Voraussetzung zu machen.
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Protocol
Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter Lizenz von der britischen Home Office (Projektlizenznummer PPL 60/3785 und 60/4424) durchgeführt.
1. Vorbereitung
- Beschriften Sie die Melanoblasten in der Entwicklung von Haut durch die Kombination eines geeigneten Cre-Rekombinase exprimierenden Mauslinie mit einem fluoreszierenden Reportermauslinie. :: CreA Tyr, Tyr :: CREB 8 und Wnt1 :: Cre 14 erfolgreich als Cre-exprimierenden Linien eingesetzt und R26YFPR 9 als Reporter Linie.
- Bereiten Sie das Kulturmedium in einer Steril; Ergänzung nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit (1% v / v Penicillin / Streptomycin), 10% v / v fötales Kälberserum und 0,584 g / l L-Glutamin.
- Die Live-Bildgebungsgerät ist in Abbildung 1 skizziert Sterilisieren Sie die Imaging-Kammer Basis durch Abwischen mit 70% Ethanol. Sterilisieren Sie die Einsätze, Imaging-Clips und O-Ringe durch Einweichen overnight in 70% Ethanol. Eine sterile Abdeckung aus einer Platte mit 6 Vertiefungen, wenn der Deckel der Kammer.
- Die Bodenfläche des Bilderzeugungskammer aus einem lummox Membran anstelle von einem O-Ring (1) gehalten wird. Beginnen Sie mit einer 35-mm-gasdurchlässige lummox Gericht. Die Schale über den Imaging-Kammer und schneiden Sie die gasdurchlässige Membran mit einer einzigen Rasierklinge. Schieben Sie den O-Ring über der Membran, um es in der bildgebenden Kammer zu sichern.
- Die bildgebenden Clips (6 insgesamt), klemmen die embryonalen Haut statt (Abbildung 1) vor dem Gebrauch müssen sie mit 1% Agarose gefüllt werden. Vorbereitung einer 2% igen Lösung von Agarose mit sterilem dH 2 O durch Mikrowellenbehandlung und Abkühlen auf 60 ° C. Mischung 1:1 mit 10 ml Kulturmedium (siehe Schritt 2) auf 60 ° C vorgewärmt Stehen die sechs Bildclips in eine sterile 6-Well-Platte. Drip der 1% igen Lösung in der Mitte jeder Clip mit einem feinen pastette und abkühlen lassen. 1 ml kaltem sterilem PBS in jede Vertiefung, die ein zu verhinderngarose Austrocknen. Die Abbildungs Clips kann mehrere Stunden in PBS gelagert werden.
- Zur Durchführung der Trennung von empfindlichen embryonalen Haut und in der Handhabung der sezierten Gewebe verwenden Sie den "Haar-Stick-Methode ', wie in Kashiwagi et al. 3 Statt mit einem Ess-Stäbchen eine Bambus-Kebab-Spieß kann verwendet werden, beschrieben. Machen Sie einen kleinen Schlitz in dem flachen Ende des Spießes mit einer einzigen Rasierklinge und legen Sie eine weiche Zahnbürste Borsten. Schneiden Sie den Spieß, so dass es etwa 15 cm in der Länge.
- Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einer vollständigen Klimakammer oder inszenieren oberen Kammer bietet 5% CO 2 in der Luft. Vorwärmen des Mikroskoptisches auf 37 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Bilderzeugung. Dies hilft, Probe Drift durch Erweiterung der Bühne Komponenten zu vermeiden, wie sie aufzuwärmen.
- Bereiten Sie eine Multi-Positions-Satz über die Steuerungssoftware des Mikroskops, so dass man schnell und einfach zu zentrieren auf der Mitte einer jeden Kultur die Einrichtung eines Versuchst.
2. Vorgehen
- Kamerad die Mäuse und bezeichnen den ersten Tag post coitum als Tag E0.5. Am Tag E14.5, filtern das Weibchen durch Genickbruch und setzen die Körperhöhle mit einem kleinen Mittellinienschnitt, Auseinanderziehen der Haut in Richtung Kopf und Schwanz und dann schneiden die zugrunde liegende Bauchfell und läuten wieder auf beiden Seiten des Körpers. Präparieren Sie die Gebärmutter in kalte sterile PBS durch Halten mit einer Zange fest und schnippeln entlang der Mesometrium Verwendung von chirurgischen Schere. Halten Sie die Gebärmutter auf Eis, bis sie benötigt. Für eine detaillierte Beschreibung siehe Shea et al. (2007) 15.
- Dissect Embryonen aus der Gebärmutter, indem zuerst die Länge der Gebärmutterwand mit chirurgischer Schere, um die Decidua freizugeben und dann sezieren die Embryonen aus der Dezidua, indem Sie sie heraus mit zwei Paaren von feinen Pinzette. Bildschirm fluoreszierenden Reporter-Expression (falls erforderlich).
- Cull Embryonen durch Enthauptung vor der Dissektion. Subsequently entfernen Sie den Schwanz und Hinterbeine und dann die Vorderbeine mit einer einzigen Rasierklinge. Bewahren Gewebe zur Genotypisierung, wenn erforderlich.
- Einen Einschnitt in der ventrum in einer rostro-kaudale Richtung nahe der Mittellinie. Mit Hilfe der in Schritt 1.6 beschrieben Haar-Sticks, sorgfältig zu necken entfernt die Haut vor dem Drehen des Embryo in der gleichen Zeit zugrunde liegenden Bindegewebe. Sie die Haut vollständig entfernen nicht, sondern lassen Sie es entlang der ventralen Rand weitesten vom ersten Schnitt angebracht.
- Es ist wichtig, die Haut wird oben geschraubt, wie es ist dann sehr schwierig zu montieren zu lassen. Um dies zu verhindern, glätten die Haut mit Hilfe der Haar-Sticks (Hautseite nach oben) auf der Oberfläche eines trockenen Petrischale und dann schneiden Sie aus dem Embryo Stamm mit einer einzigen Rasierklinge. Die dermale Seite von der epidermalen Seite durch sorgfältige Beobachtung der Verbindung zwischen dem sezierten Gewebe und der Embryo unterscheiden, bevor der Haut entfernt werden. Die Fläche des sezierten Gewebeca. 0,5 mm 2, wenn Sezieren eines E14.5 Embryos.
- Platzieren eines Abbildungs Clip auf der Haut, so daß die Agarose Berühren der dermalen Seite des Gewebes. Lassen Sie für 60 Sekunden stehen gelassen und dann sorgfältig zu necken die Kanten des Gewebes an den Seiten des Clips. Kehren Sie den Clip und verwenden Sie das Haar klebt zu glätten die Haut und entfernen Sie alle Luftblasen, kümmert sich um die Oberfläche des Gewebes (in dem Bereich, der abgebildet wird), so wenig wie möglich zu berühren.
- Verwenden Seide Faden, um die Haut auf die Abbildungs Clip binden mit zwei einfachen Daumen Knoten auf beiden Seiten des Bildclip, so dass sie zu straffen und ziehen Sie die Haut in die Nut der Nähe der Spitze des Clips. Kehren Sie den Clip, Push innerhalb des Abbildungseinsatz und in der Basis. Füllen des Einsatzes mit ~ 5 ml Kulturmedium (siehe Schritt 1.2). Abbildung 1 beschreibt den Aufbau der Abbildungskammer.
- Wiederholen Protokoll für die verbleibenden 5 Proben.
3. LebenImaging
- Die Abbildungskammer hat die gleichen Abmessungen wie ein Standard-6-Well-Platte. Verwenden Sie eine geeignete Platteneinsatz, um die Kammer auf der Bühne des konfokalen Mikroskops befestigen.
- Eine automatisierte Stufe ist mit Bild die Kulturen parallel erforderlich. Definieren Sie die sechs Positionen, um Bild in der konfokalen Software. Die genauen Einstellungen werden auf der Fähigkeit des verwendeten Mikroskops ab. Typischerweise ein kleiner Z-Stapel (3-5 z-Positionen, für jede Stufe Drift zu berücksichtigen) ist in jedem der 6-Stellung verwendet wird und eine z-Stapel wird alle 2 min für 18-24 h erfasst. Für Live-Abbildungsanwendungen in der Regel ist es vorteilhaft, eine größere als optisch optimale Lochblende Einstellung verwenden, um Laserleistung und die Anzahl von Z-Profilen zu reduzieren.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse aus einer Zeitraffer-Experiment mit embryonalen Haut von Tyr :: CREB x R26YFPR Embryonen E14.5. 6 embryonale Hautkulturen wurden durch konfokale Mikroskopie 18 Stunden abgebildet alle 2 min. Die Freeware-Bildanalyse-Software ImageJ wurde verwendet, um das Verhalten der YFP-markierte Melanoblasten in den sechs Filmen zu analysieren. Die Melanoblasten waren mit der wrMTrck Plugin von Jesper Pedersen entwickelt Søndergaard (automatisch verfolgt http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) die Tracking-Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Movies 1-3 Vertreter des Experiments sind und entsprechen den Feldern A und G. Sie zeigen die Durchlicht, YFP und Verbundansichten. Die Migration Melanoblasten Bevölkerung ist außerordentlich aktiv. Die Zellen bewegen sich ständig und fast nur anhalten, wenn sie über die von mi teilen sindtose. Es ist auch möglich, um die Entwicklung des Primär Haarfollikel Muster über die Kulturzeit im Durchlichtkanal (Fig. 3A-3X und Film 1) zu beobachten.
.. Abbildung 1 Ausstattung und Einrichtung A: Die Live-Imaging-Kammer Basis besteht aus einer klaren Plexiglasgehäuse mit identischen Außenmaßen zu einer 6-Well-Kulturschale. Es enthält sechs Löcher, in denen die sechs einzelnen Kammeranordnungen Steckplatz können. B: Jeder Einsatz besteht aus 4 Komponenten; eine Abbildungsclip, eine Abbildungseinsatz eine lummox Membran und ein O-Ring. Der Clip und die Einlage sind aus schwarzem Kunststoff Acetyl abgedreht, fanden wir, dass dies die niedrigste Autofluoreszenz der Kunststoffe, die wir getestet haben. Der O-Ring ist aus PVC eine gemachtd wird verwendet, um die lummox Membran auf dem Boden des Einsatzes bildenden Luft Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) festzuklemmen. Die Abbildungsclip (schwarz Acetyl) mehrere Löcher, damit Zirkulation des Kulturmediums C:. Der zentrale Schaft des Clips ist mit 1% Agarose vor der Verwendung, um eine feste ebene Fläche, auf der der Haut Halterung bereitzustellen gefüllt. Die Haut wird an der Klammer mit Faden, bevor er in den Einsatz geschoben wird, zwischen denen die Haut zwischen der Agarose und lummox Membran angebracht. Der Einsatz wird dann mit Kulturmedium gefüllt D:. Um zu sezieren und zu manipulieren, die embryonale Haut eine einzige Zahnbürste Borsten in einen Schlitz in dem flachen Ende eines Bambus Kebab-Spieß montiert. Ein Paar von Haar-Sticks können in Kombination mit einer feinen Pinzette zur embryonalen Haut zerlegen und montieren in der Imaging-Kammer werden E:.. Fotografien der Komponenten in AC detailliert Bitte klicken hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse der sechs Filme parallel aufgezeichnet. AF: Tracking-Ergebnisse aus sechs Filme parallel aufgezeichnet werden, um die Fähigkeiten des Systems zu demonstrieren. Jeder Film wurde in 2-Minuten-Zeitpunkte für insgesamt 18 Stunden aufgezeichnet (siehe 3.1 Filme für den entsprechenden Film von Platten A und G). Die Positionen der Zellen in einem Rahmen des Films gezeigt und die Tracking-Ergebnisse sind auf der Oberseite überlagerten GL:. Zusammenfassung der Verfolgungsergebnisse aufgetragen als Verfolgungsdaten auf Null gesetzt.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Abbildung 3 Repräsentative Bilder von Zeitraffer-Filmen der Haarfollikel Entwicklung und einer Melanoblasten Mitose AX:.. Ausgewählte, beschnitten Rahmen von Film 1 Primär Haarfollikel über den Zeitraum der Hautkultur 0-18 Stunden sichtbar werden.. Eine LUT wurde auf die Bilder angewendet A'-X. ": Ausgewählte, beschnitten Rahmen von Movie 2 Repräsentative Bilder der Melanoblasten Migration in den Entwicklungs Epidermis und einer einzelnen Zelle (siehe Pfeil in A. ') Mitose (Pfeil in T') . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: Repräsentative Ergebnis der Durchlichtkanal von einem 18-Stunden-Zeitraffer-Experiment. </ Strong> Der Haupt Haarfollikel Muster, obwohl zu Beginn des Films nicht zu erkennen ist, wird mehr im Vordergrund als die Kultur fortschreitet.
Movie 2: . Vertreter Ergebnis der YFP-Kanal von einem 18-Stunden-Zeitraffer-Experiment Die Melanoblasten Bevölkerung ist eine sehr dynamische und Migrationsbevölkerung. Seltene stationären Zellen sind in der Regel Mitose (siehe Abbildung 3).
Movie 3: . Vertreter Ergebnis der Composite-Kanal von einem 18-Stunden-Zeitraffer-Experiment Die Melanoblasten Bevölkerung gesehen werden kann, innerhalb der Entwicklung Epidermis migrieren und interagieren mit den Entwicklungs Haarfollikel.
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Discussion
Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut, die Besonderheit zugänglich Live-Cell-Imaging auf invertierten konfokalen Mikroskopen ist. Das Verfahren umfasst die jüngsten Verbesserungen, die sechs Kulturen parallel abgebildet werden und beseitigt die Abhängigkeit von Matrigel und Nuclepore Membranen der ursprünglichen Methode 6 ermöglichen. Der entscheidende technische Unterschied von ähnlichen Techniken ist die Verwendung einer gasdurchlässigen Membran lummox, eine Luftschnittstelle Flüssigkeit herzustellen und auch als Deckglas handeln. Wir haben erfolgreich die Kulturen kontinuierlich mit konfokaler Abbildung für bis zu 48 h aufrechterhalten. Die hohe Auflösung und hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnis der konfokalen Bildern ermöglicht automatisierten Zellverfolgung zu Melanoblasten Verhalten in den resultierenden Zeitraffer-Filme zu analysieren.
Mit dieser Technik ist es möglich, die Dynamik des Melanoblasten Ausbreitung zu untersuchen und deren Wechselwirkungen mit der Epidermis und den Entwicklungs Haarfollikel. Die kritische steps in dem Protokoll sind eine sorgfältige Präparation, die nicht die Entwicklung Epidermis nicht beschädigt und die Hautproben dermale Seite gegen die Agarose ohne Knicke oder Strecken zu montieren. Die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren funktioniert am besten zwischen E13.5 und E15.5. Vor E13.5 die Haut ist sehr empfindlich und nach E15.5 es ist relativ dick und schwer zu durchdringen durch konfokale Mikroskopie. Die Fähigkeiten des Mikroskopsystem verwendet werden, sind ebenfalls sehr wichtig. Wir verwenden in der Regel eine Nikon A1R konfokalen Mikroskop mit proprietären perfekte Fokus-System von Nikon (PFS) ausgestattet. Mit PFS die Anzahl der schlechten Filmen von der Bühne Drift verursacht stark reduziert, sind ähnliche Systeme für andere Plattformen verfügbar.
Ein Nachteil dieser Technik ist das Erfordernis spezialisierter Kulturtechnik. Doch das Design ist einfach und die Kammer könnte leicht von einem kleinen technischen Werkstatt zusammengebaut werden. Zusammenfassend stellen wir eine einfache Methode, die von den breiten Einsatz für studie sein solltes der embryonalen Entwicklung und Haut Melanoblasten Verhalten. Es wird erwartet, dass die Technik auch für andere Situationen, in denen ein Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche ist eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Kultur modifiziert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde durch die Grundfinanzierung von der Medical Research Council unterstützt. Wir sind dankbar, dass Craig Nicol für die Herstellung von technischen Zeichnungen. Wir sind dankbar, dass Matthew Pearson und Paul Perry für ihre Imaging-Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
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