Summary
We beschrijven de dissectie en ex vivo cultuur van muis embryonale huid. De cultuur systeem houdt een lucht-vloeistof-interface over het weefsel oppervlak en maakt beeldvorming op een omgekeerde microscoop. Melanoblasten, een component van de ontwikkeling huid, worden fluorescerend gemerkte waardoor hun gedrag wordt waargenomen met behulp van confocale microscopie.
Abstract
Melanoblasten zijn de neurale lijst afkomstig voorlopers van melanocyten; de cellen die verantwoordelijk zijn voor de productie van pigment in huid en haar. Melanoblasten migreren door de epidermis van het embryo waar ze vervolgens koloniseren de ontwikkelende haarzakjes 1,2. Neurale lijst cel migratie wordt uitgebreid bestudeerd in vitro maar in vivo methoden zijn nog niet goed ontwikkeld, vooral in zoogdiersystemen. Een alternatief is om ex vivo organotypische cultuur 3-6 gebruiken. Cultuur van muis embryonale huid vereist handhaving van een lucht-vloeistof-interface (ALI) over het oppervlak van het weefsel 3,6. Hoge resolutie voor live-beeldvorming van muis embryonale huid is belemmerd door het ontbreken van een goede methode die niet alleen onderhoudt deze ALI, maar maakt het ook mogelijk de cultuur te worden omgekeerd en derhalve verenigbaar met korte werkafstand objectieven en meest confocale microscopen. Dit artikel beschrijft de recente verbeteringen naar een method die gebruik maakt van een gas-permeabel membraan om deze problemen te overwinnen en een hoge-resolutie confocale beeldvorming van embryonale huid in ex vivo cultuur 6. Door het gebruik van een melanoblast specifieke Cre-recombinase uiten muis lijn gecombineerd met de R26YFPR reporter lijn kunnen we fluorescent labelen de melanoblast bevolking binnen deze huid culturen. De techniek maakt levend beeldvorming van melanoblasten en observatie van hun gedrag en interacties met het weefsel waarin ze zich ontwikkelen. Representatieve resultaten zijn opgenomen om de mogelijkheid om live-beeld 6 culturen in parallel aan te tonen.
Introduction
Traditioneel embryonale huid is gekweekt door het ontleden van de muis embryo en montage op een polycarbonaat Nuclepore membraan. Het membraan wordt vervolgens geïntroduceerd op kweekmedium zo tot een lucht-water grensvlak over het oppervlak van de ontwikkelende weefsels 3,4. Deze techniek is gebruikt om melanoblast gedrag assay door de vaststelling van het weefsel en beoordelen melanoblast verspreiden via β-galactosidase als merker 7. We hebben een methode die live beeldvorming van fluorescent gelabelde melanoblasten in ex vivo huid cultuur 6 laat ontwikkeld. Hier beschrijven we de methode in detail uit dissectie, te installeren, te confocale beeldvorming wonen en ook enkele recente verbeteringen.
Melanoblasten zijn de embryonale voorlopers van melanocyten, de cellen die pigment produceren haar en huid. Melanoblasten voordoen in de neurale naast de neurale buis op ongeveer embryonale dag 9 (E9) in de ontwikkelende muizen embryo. Vervolgens trekken ze langs een dorsolaterale pad tussen het ectoderm en het ontwikkelen van somieten. Bij E12.5 ze van de dermis naar de epidermis, waar ze groeien en hun migratie voort te zetten. De primaire haarzakje patroon begint te vormen in de epidermis op E14.5 en E15.5 melanoblasten zijn lokaliseren deze follikels. Voor een overzicht van melanoblast / melanocyten ontwikkeling zien Thomas & Erickson (2008) 1. Om melanoblast populatie label wij Tyr combined :: CREB dieren Cre-recombinase gedreven door de muis tyrosinase promotor 8 met R26YFPR dieren geel fluorescerend eiwit (YFP) voorwaardelijk uitdrukking van de ROSA26 locus 9 drukken.
We beschrijven een methode om cultuur embryonale huid en foto's maken met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. Het aangepaste vorm van de oorspronkelijke werkwijze mort et al. beschreven. (2010) 6. De huidigewerkwijze maakt beeldvorming in een 6-well formaat en verwijdert de afhankelijkheid Nuclepore membranen en Matrigel de cultuur ondersteunen. In plaats daarvan gebruik van een klein blok van 1% agarose aan de embryonale huid te stabiliseren. De afhankelijkheid Matrigel verwijderen is belangrijk, vooral in situaties waarin de reactie van de embryonale huid oplosbare groeifactoren is de focus van de studie. Onze oorspronkelijke methode is al gebruikt om nieuwe inzichten in melanoblast ontwikkeling 10-13 te winnen en we verwachten dat de verbeteringen die we hier beschrijven het krachtiger zal maken als een experimentele techniek vooral wanneer meerdere parallelle culturen zijn een vereiste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling onder licentie gebruikt door het Britse Home Office (project licentie nummer PPL 60/3785 en 60/4424).
1. Bereiding
- Label de melanoblasten in het ontwikkelen van de huid door het combineren van een passende Cre-recombinase uiten muis lijn met een fluorescerende reporter muis lijn. Tyr :: CreA, Tyr :: CREB 8 en Wnt1 :: Cre 14 zijn met succes gebruikt als Cre expressie lijnen en R26YFPR 9 als verslaggever lijn.
- Bereid het kweekmedium in een laminaire stroming kap; aangevuld Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met (1% v / v penicilline / streptomycine), 10% v / v foetaal kalfsserum en 0.584 g / L L-glutamine.
- De live-imaging apparaat is geschetst in figuur 1 Steriliseer de beeldvorming kamer basis door te vegen naar beneden met 70% ethanol. Steriliseer de inserts, imaging clips, en O-ringen door het weken overnight in 70% ethanol. Gebruik een steriele deksel van een 6-wells plaat als deksel van de kamer.
- Het bodemoppervlak van de beeldvorming kamer bestaat uit een lummox membraan plaats gehouden door een O-ring (figuur 1). Begin met een 35 mm gasdoorlaatbare lummox gerecht. Zet de schaal in de beeldvorming kamer en knip de gas-permeabel membraan met een enkel gescherpt scheermesje. Schuif de O-ring over het membraan naar het veilig om de beeldvorming kamer.
- De imaging-clips (6 in totaal) klem de embryonale huid op zijn plaats (figuur 1) vóór gebruik moeten worden gevuld met 1% agarose. Bereid een oplossing van agarose met steriele dH 2 O 2% van de magnetron en afkoelen tot 60 ° C. Mix 01:01 met 10 ml kweekmedium (zie stap 2) voorverwarmd tot 60 ° C. Staan de 6 beeldvorming clips in een steriele 6-wells plaat. Druppel de 1% agarose oplossing in het midden van elke clip met een fijne pastette en laat afkoelen. Voeg 1 ml koude steriele PBS aan elk putje om de voorkoming van eengarose uitdroogt. De beeldvorming clips kunnen worden opgeslagen aantal uren in PBS.
- Voor het uitvoeren van de gevoelige scheiding van embryonale huid en voor het behandelen ontleed weefsel gebruiken 'haar stok methode zoals beschreven in Kashiwagi et al.. 3 In plaats van een eetstokje bamboe kebab spies worden gebruikt. Maak een kleine spleet in het platte uiteinde van de spies met een enkele edged scheermesje en plaats een zachte tandenborstel varkenshaar. Trim de spies, zodat het ongeveer 15 cm in lengte.
- Gebruik een confocale microscoop met een volledige milieu-kamer of ensceneren bovenste kamer die 5% van CO 2 in de lucht. Voorverwarmen de microscoop stadium 37 ° C gedurende ten minste 1 uur vóór beeldvorming. Dit helpt om monster drift door uitzetting van het podium componenten te voorkomen als ze opwarmen.
- Bereid een multi-positie ingesteld met besturingssoftware van de microscoop, zodat men snel en gemakkelijk te centreren op het midden van elke cultuur het opzetten van een experimentelet.
2. Procedure
- Mate de muizen en wijzen de eerste dag na de coïtus als de dag E0.5. Op dag E14.5, ruiming de vrouwelijke door cervicale dislocatie en de lichaamsholte bloot door een kleine incisie, elkaar trekken van de huid naar de kop en staart en vervolgens snijden van de onderliggende peritoneum en pellen naar beide zijden van het lichaam. Ontleden de baarmoeder in koud steriele PBS door stevig vast met een pincet en knippen langs de mesometrium behulp van chirurgische schaar. Houd de baarmoeder op ijs tot vereist. Voor een gedetailleerde beschrijving zie Shea et al.. (2007) 15.
- Ontleden embryo van de baarmoeder door eerst snijden van de lengte van de baarmoederwand met chirurgische schaar om de decidua ontgrendelen en het ontleden van de embryo's uit de decidua door ze trekken elkaar twee paar fijne pincet. Scherm voor fluorescentie reporter expressie (indien nodig).
- Cull embryo's door onthoofding voorafgaand aan dissectie. Subsequently verwijder de staart en achterpoten en dan de voorpoten met behulp van een enkel gescherpt scheermesje. Behouden weefsel voor genotypering indien nodig.
- Maak een insnijding in de ventrum nabij de middellijn in een rostro-caudaal. De haar stokken in stap 1.6 beschreven, voorzichtig plagen weg de huid van het onderliggende bindweefsel roteren van de embryo tegelijk. De huid niet volledig te verwijderen, maar laat het liever bevestigd langs de ventrale rand van het verst van de eerste incisie.
- Het is belangrijk niet te laten de huid wordt verpest als het is dan heel moeilijk te monteren. Om dit te voorkomen, vlakken de huid met het haar stokken (dermale kant boven) op het oppervlak van een droge petrischaal en vervolgens weggesneden uit het embryo stam met een gescherpt scheermesje. De dermale zijde kan worden onderscheiden van de epidermale naast zorgvuldige observatie van de verbinding tussen de ontleed weefsel en het embryo voordat de huid wordt verwijderd. Het gebied van de ontleed weefselongeveer 0,5 mm 2 bij het ontleden van een E14.5 embryo.
- Een imaging clip bovenop de huid, zodat de agarose raakt de dermale kant van het weefsel. Laat gedurende 60 seconden te gaan staan en vervolgens zorgvuldig te plagen de randen van het weefsel op de zijkanten van de clip. Keren de clip en gebruik het haar steekt te vlakken de huid en verwijder eventuele luchtbelletjes, zorg ervoor dat het oppervlak van het weefsel te raken (in het gebied dat zal worden afgebeeld) zo min mogelijk.
- Gebruik zijden hechtdraad om de huid te binden aan de beeldvorming clip met behulp van twee eenvoudige duim knopen aan weerszijden van de imaging-clip, zodat ze vast en trek de huid in de groef dicht bij de top van de clip. Keren de clip, duw in de beeldvorming insert en plaats in de basis. Vul het inzetstuk met ~ 5 ml kweekmedium (zie stap 1.2) Figuur 1. Schetst de montage van de beeldvorming kamer.
- Herhaal dit Protocol voor de resterende 5 monsters.
3. LeefImaging
- De beeldvorming kamer heeft dezelfde afmetingen als een standaard 6-wells plaat. Gebruik een geschikte plaat insert om de kamer te monteren op het podium van de confocale microscoop.
- Een geautomatiseerde fase vereist beeld de kweken parallel. Definieer de zes posities op de foto in de confocale software. De precieze instellingen afhangen van het vermogen van de gebruikte microscoop. Typisch een klein z-stack (3-5 z-posities om eventuele fase drift) wordt gebruikt in elk van de 6-posities en een z-stapel wordt opgevangen om de 2 min gedurende 18-24 uur. Voor levende imaging toepassingen is het algemeen voordelig een breder dan optisch optimaal pinhole instelling gebruiken om laservermogen en het aantal z-profielen vereist verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont representatieve resultaten van een time lapse experiment met behulp van embryonale huid tegen Tyr :: Creb x R26YFPR embryo's in E14.5. 6 embryonale huid kweken werden afgebeeld door confocale microscopie elke 2 min gedurende 18 uur. De freeware beeldanalyse softwarepakket ImageJ werd gebruikt om het gedrag van de YFP-gelabeld melanoblasten in 6 films analyseren. De melanoblasten waren automatisch gevolgd met behulp van de wrMTrck plugin ontwikkeld door Jesper Søndergaard Pedersen ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) de tracking resultaten worden weergegeven in figuur 2. Movies 1-3 zijn representatief voor het experiment en komen overeen met de panelen A en G. Zij tonen respectievelijk het doorgelaten licht, YFP en composiet uitzicht. De migratie melanoblast bevolking buitengewoon actief. Cellen verplaatsen bijna constant en alleen pauzeren als ze ongeveer te delen door mitosis. Het is ook mogelijk om de ontwikkeling van de primaire haarfollikel patroon over de kweekperiode van het doorgelaten licht kanaal (Figuren 3A-3X en Film 1) waarnemen.
.. Figuur 1 Apparatuur en setup A: De live beeldvorming kamer basis bestaat uit een heldere perspex behuizing met dezelfde buitenafmetingen een 6-well cultuur schotel. Het bevat zes gaten waarin de 6 individuele kamer assemblages kunnen sleuf B:. Elke insert bestaat uit 4 onderdelen; een imaging clip, een beeldvormende insert, een lummox membraan, en een O-ring. De clip en de insert zijn gedraaid van zwart acetyl plastic, vonden we dit aan de laagste autofluorescentie van de kunststoffen die we getest hebben. De O-ring is gemaakt van PVC eend wordt gebruikt om de lummox membraan klemmen aan de onderkant van het inzetstuk die de lucht vloeistof interface (ALI). De imaging-clip (zwart acetyl) heeft verschillende gaten zodat circulatie van kweekmedium C:. De centrale as van de clip is gevuld met 1% agarose voor gebruik om een stevige vlakke ondergrond waarop de huid monteren bieden. De huid wordt alvorens te worden geduwd in de insert, daartussen de huid tussen de agarose en lummox membraan naar de clip met hechtdraad bevestigd. De inzet is dan gevuld met kweekmedium D:. Te ontleden en manipuleren van de embryonale huid een tandenborstel varkenshaar wordt in een gleuf in de platte kant van een bamboe kebab spies gemonteerd. Een paar haar stokken kan worden gebruikt in combinatie met fijne tang embryonale huid ontleden en houder van de beeldkamer E.. Foto's van de componenten beschreven in AC Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Representatieve resultaten van 6 films die zijn opgenomen in parallel. AF: Tracking resultaten vanaf 6 films die parallel aan de mogelijkheden van het systeem te demonstreren. Elke film werd opgenomen in 2-minuten tijdstippen voor een totaal van 18 uur (zie Films 1-3 voor de overeenkomstige film panelen A en G). De posities van de cellen in een kader van de film worden getoond en de trackingresultaten gesuperponeerd bovenop GL. Samenvatting van de traceerresultaten uitgezet als nulpunt bijhouden van gegevens.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Figuur 3 Vertegenwoordiger beelden van time-lapse filmpjes van haarfollikel ontwikkeling en van een melanoblast ondergaat mitose AX:.. Geselecteerde, bijgesneden frames van Film 1 Primary haarzakjes zichtbaar over de periode van de huid cultuur 0-18 uur geworden.. Een LUT werd toegepast op de beelden A'-X. ': Geselecteerde, bijgesneden frames van Movie 2 Vertegenwoordiger beelden van melanoblasten migreren in de ontwikkelingslanden opperhuid en een individuele cel (zie pijl in een.') Ondergaat mitose (pijl in T ') . Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1: Vertegenwoordiger gevolg van het doorgelaten licht kanaal van een 18-hr time-lapse experiment. </ Strong> de eerste haar-follikel patroon, hoewel niet duidelijk bij het begin van de film, wordt prominenter als cultuur vordert.
Film 2: . Vertegenwoordiger gevolg van de YFP kanaal van een 18-hr time-lapse experiment De melanoblast bevolking is een zeer dynamische en trekkende bevolking. Zeldzame stationaire cellen gewoonlijk mitose ondergaan (zie figuur 3).
Film 3: . Representatieve resultaten van het samengestelde kanaal een 18-hr time-lapse experiment De melanoblast populatie blijkt te migreren in de ontwikkeling epidermis en interactie met de ontwikkeling van haarfollikels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een methode om cultuur embryonale huid die bijzonderheid vatbaar is voor live-cell imaging op omgekeerde confocale microscopen. De werkwijze omvat recente verbeteringen waarmee 6 culturen te beelden parallel en verwijdert de afhankelijkheid van Matrigel en Nuclepore membranen van de oorspronkelijke methode 6. Het cruciale technische verschil met soortgelijke technieken is het gebruik van een gas-permeabel membraan lummox een lucht-water grensvlak stellen en ook om als een dekglaasje. We hebben met succes handhaafde de culturen met doorlopende confocale beeldvorming voor maximaal 48 uur. De hoge resolutie en een uitstekende signaal-ruisverhouding van de confocale beelden maakt geautomatiseerde cell tracking om melanoblast gedrag analyseren in het resulterende time-lapse filmpjes.
Met deze techniek is het mogelijk de dynamiek van melanoblast dispersie onderzoek en studie van hun interactie met de epidermis en de ontwikkeling van haarfollikels. De kritische steps in het protocol zijn voor het uitvoeren van een zorgvuldige dissectie dat de ontwikkelingslanden opperhuid niet beschadigt en de huid monsters dermale zijmontage tegen de agar zonder knikken of stukken. De in dit document beschreven procedure werkt het beste tussen E13.5 en E15.5. Voor E13.5 de huid is zeer kwetsbaar en na E15.5 is relatief dik en moeilijk te penetreren door confocale microscopie. De mogelijkheden van de gebruikte microscoop zijn ook erg belangrijk. We gebruiken meestal een Nikon A1R confocale microscoop uitgerust met Nikon's eigen perfecte focus systeem (PFS). Met PFS vermindert het aantal slechte films door fase drift, soortgelijke systemen zijn beschikbaar voor andere platformen.
Een nadeel van deze techniek is de vereiste gespecialiseerde cultuur apparatuur. Het ontwerp is echter eenvoudig en de kamer kan gemakkelijk worden gemonteerd door een kleine technische workshop. Samengevat presenteren we een eenvoudige methode die brede toepassing voor Studie moets van de embryonale ontwikkeling huid en melanoblast gedrag. Verwacht wordt dat de techniek ook kan worden aangepast voor andere scenario's waarin een lucht-water grensvlak is een vereiste voor een succesvolle kweek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door de basisfinanciering van de Medical Research Council. We zijn dankbaar voor Craig Nicol voor het bereiden van technische tekeningen. We zijn dankbaar voor Matthew Pearson en Paul Perry voor hun beeldvorming ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. Turksen, K. 289, Humana Press. 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), Cambridge, England. 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
