Summary
Vi beskriver dissekering och ex vivo kultur av mus embryonala hud. Odlingssystemet upprätthåller ett luft-vätskegränssnitt över vävnadsytan och tillåter avbildning på ett inverterat mikroskop. Melanoblasts, en komponent i utvecklings huden, är fluorescerande låta sitt uppträdande som skall iakttas med hjälp av konfokalmikroskopi.
Abstract
Melanoblasts är neurallisten härledda prekursorer av melanocyter; de celler som ansvarar för framställning av pigment i huden och håret. Melanoblasts migrerar genom epidermis hos embryot, där de därefter koloniserar utvecklings hårsäckar 1,2. Neural crest cell migration studerats in vitro men in vivo-metoder fortfarande inte väl utvecklad, speciellt i däggdjurssystem. Ett alternativ är att använda ex vivo organotypisk kultur 3-6. Kultur av mus embryonala hud kräver upprätthållandet av en luft-vätska gränssnitt (ALI) över ytan av vävnaden 3,6. Högupplöst levande avbildning av mus embryonala hud har försvårats av bristen på en bra metod som inte bara underhåller denna ALI men också tillåter den kultur som ska inverteras och därmed förenligt med kort arbetsavstånd objektiv och mest konfokala mikroskop. I denna artikel beskrivs de senaste förbättringarna till en method som använder ett gaspermeabelt membran för att övervinna dessa problem och tillåter hög upplösning konfokal avbildning av embryonal hud i ex vivo-kultur 6. Genom att använda en melanoblast specifik Cre-rekombinas uttrycker mus linje i kombination med R26YFPR reporter linjen har vi möjlighet att fluorescerande märka melanoblast befolkningen inom dessa hud kulturer. Tekniken möjliggör levande avbildning av melanoblasts och observation av deras beteende och interaktion med den vävnad där de utvecklas. Representativa resultat med för att påvisa förmågan att leva-bild 6 kulturer parallellt.
Introduction
Traditionellt embryonala hud har odlats genom att dissekera från musen embryot och montering på ett polykarbonat Nuclepore membran. Membranet är sedan flyta på odlingsmedium, och upprätthåller därmed en luft-vätske-gränssnitt över ytan av den utveckla vävnads 3,4. Denna teknik har använts för att analysera melanoblast beteende genom att fixera vävnaden och bedöma melanoblast fördelning med användning av β-galaktosidas som markör 7. Vi har utvecklat en metod som gör det möjligt för levande avbildning av fluorescerande melanoblasts i ex vivo hud kultur 6. Här beskriver vi metoden i detalj från dissektion, att installera, att leva konfokal avbildning och inkluderar några nya förbättringar.
Melanoblasts är de embryonala prekursorer till melanocyter, de celler som producerar pigment i hår och hud. Melanoblasts uppstår i neurallisten intill neuralröret på runt embryonala dag 9 (E9) i utvecklings musen embryo. Därefter de vandrar längs en dorsolaterala väg mellan ektoderm och utvecklings somites. Vid E12.5 de flyttar från dermis till epidermis där de föröka sig och fortsätta sin vandring. Den primära hårsäcken mönster börjar bildas i överhuden vid E14.5 och E15.5 melanoblasts är lokalisera dessa folliklar. För en genomgång av melanoblast / melanocyt utveckling ser Thomas & Erickson (2008) 1. För att märka melanoblast befolkningen har vi kombinerat Tyr :: CREB djur som uttrycker Cre-rekombinas driven av musen tyrosinas promotorn 8 med R26YFPR djur som uttrycker gula fluorescerande protein (YFP) villkorligt från ROSA26 locus 9.
Vi beskriver en metod att odla embryonala hud och fånga bilder med ett inverterat konfokalmikroskop. Den är anpassad form den ursprungliga metod som beskrivits i Mort et al. (2010) 6. FöreliggandeMetoden gör det möjligt att avbilda i en 6-brunnsformat och tar bort beroendet av Nuclepore membran och på matrigel att stödja odlingen. Istället för användning av ett litet block av 1% agaros för att stabilisera den embryonala hud. Ta bort beroendet matrigel är viktigt särskilt i situationer där svaret av embryonala hud till lösliga tillväxtfaktorer är i fokus för studien. Vår ursprungliga metoden har redan använts för att få nya insikter i melanoblast utveckling 10-13, och vi räknar med att de förbättringar som vi beskriver här kommer att göra det mer kraftfullt som en experimentell teknik särskilt där flera parallella kulturer är ett krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbete har utförts i enlighet med institutionens riktlinjer på licens från Storbritanniens inrikesministerium (projektlicensnummer PPL 60/3785 och 60/4424).
1. Förberedelse
- Märk melanoblasts i framkallnings huden genom att kombinera en lämplig Cre-rekombinas som uttrycker mus-linje med en fluorescerande reporter mus linje. Tyr :: Crea, Tyr :: CREB 8 och Wnt1 :: Cre-14 har använts med framgång som Cre-uttryckande linjer och R26YFPR 9 som reporter linje.
- Bered odlingsmediet i en huv med laminärt flöde; komplettera Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med (1% volym / volym penicillin / streptomycin), 10% volym / volym fetalt kalvserum och 0,584 g / L L-glutamin.
- Den levande avbildningsapparat beskrivs i figur 1 Sterilisera avbildning kammare basen genom att torka ner med 70% etanol. Sterilisera skären, bildklipp, och O-ringar genom att blöt overnight i 70% etanol. Använd ett sterilt lock från en 6-brunnars platta som locket hos kammaren.
- Bottenytan av avbildningskammaren består av en TÖLP membran hålls på plats medelst en O-ring (Figur 1). Börja med en 35 mm gasgenomtränglig TÖLP maträtt. Placera skålen över avbildning kammaren och skär ut gasen membran med en enda kantad rakblad. Skjut O-ringen över membranet för att fästa den till avbildning kammaren.
- De avbildnings klipp (6 totalt) klämma den embryonala huden på plats (Figur 1) före användning måste fyllas med 1% agaros. Bered en 2% lösning av agaros med sterilt dH 2 O från mikrovågsugnen och kylning till 60 ° C. Mix 1:01 med 10 ml odlingsmedium (se steg 2) som förvärmts till 60 ° C. Stå de 6 avbildnings klipp i en steril 6-brunnar. Droppa den 1% agaros-lösning in i centrum av varje klämma med hjälp av en fin pastette och låt svalna. Tillsätt 1 ml kall steril PBS till varje brunn för att förhindra att engarose från att torka ut. De avbildnings klipp kan lagras i flera timmar i PBS.
- För att utföra den känsliga separation av embryonal hud och för att hantera den dissekerade vävnaden använda 'hår fastnar metod "såsom beskrivs i al. Kashiwagi et 3 Istället för att använda en pinne en bambu kebab spettet kan användas. Gör ett litet snitt i den platta änden av spettet med en enda kantad rakblad och sätt in en mjuk tandborste borst. Trimma spett, så att den är ca 15 cm i längd.
- Använd ett konfokalmikroskop med en fullständig miljökammare eller stadium övre kammaren tillhandahåller 5% CO2 i luft. Prewarm mikroskop scenen till 37 ° C under åtminstone 1 h före avbildning. Detta hjälper till att förhindra prov avdrift orsakad av expansion av scenkomponenter när de värms upp.
- Förbered en multi-läge ställs in med hjälp av mikroskop kontroll programvara så att man kan snabbt och enkelt handla om mitten av varje kultur för att inrätta en försökst.
2. Förfarande
- Mate mössen och utse den första dagen efter coitum som dag E0.5. Vid dag E14.5, gallra honan genom cervikal dislokation och exponera kroppshåligheten genom att göra ett litet medellinjesnitt, att dra isär huden mot huvudet och svansen och sedan skära det underliggande bukhinnan och pealing tillbaka till endera sidan av kroppen. Dissekera livmodern i kall steril PBS genom att hålla fast med pincett och snipping längs mesometrium med hjälp av kirurgisk sax. Håll livmodern på is fram till användning. För en detaljerad beskrivning se Shea et al. (2007) 15.
- Dissekera embryon från livmodern genom att först skära längden av livmoderväggen med kirurgisk sax för att frigöra decidua och sedan dissekera embryona från decidua genom att dra dem isär med två par av fin pincett. Screen för fluorescerande reporteruttryck (om nödvändigt).
- Cull embryon genom dekapitering innan dissekering. Subsequently avlägsna svansen och bakbenen och sedan frambenen med hjälp av en enda edged rakblad. Behåll vävnad för genotypning vid behov.
- Gör ett snitt i ventrum nära mittlinjen på ett rostro-kaudal riktning. Använda hår pinnar som beskrivs i steg 1,6, noggrant retas bort huden från underliggande bindväv roterande embryot vid samma tidpunkt. Ta inte bort huden helt utan lämna den fäst längs den ventrala kanten längst bort från första snittet.
- Det är viktigt att inte låta huden blir skruvas upp eftersom det då är svårt att montera. För att förhindra detta, platta ut huden genom att använda hår pinnar (dermal sidan upp) på ytan av en torr petriskål och sedan skära bort från embryot stammen med en enda kantad rakblad. Den dermala sidan kan särskiljas från den epidermala sidan genom noggrann observation av föreningspunkten mellan den dissekerade vävnaden och embryot innan huden avlägsnas. Det område av den dissekerade vävnaden ärca 0,5 mm 2 när dissekera en E14.5 embryo.
- Placera ett avbildningsklippet på toppen av huden så att agarosen vidrör dermala sidan av vävnaden. Låt stå i 60 sekunder och sedan omsorgsfullt retas kanterna av vävnaden upp sidorna av klämman. Vänd klippet och använda hår pinnar för att platta ut huden och ta bort eventuella luftbubblor, var noga med att röra vid ytan av vävnaden (i området som ska avbildas) så lite som möjligt.
- Använd silkessutur tråd för att binda huden till avbildnings klippet med två enkla thumb knutar på vardera sidan av det bildgivande klämma så att de dra åt och dra huden in i spåret nära toppen av klippet. Vänd klippet, tryck inne i bildbehandling insatsen och plats i basen. Fyll insatsen med ~ 5 ml odlingsmedium (se steg 1.2). Figur 1 beskriver sammansättningen av avbildningskammaren.
- Upprepa protokoll för de återstående 5 prover.
3. LiveImaging
- Den avbildning kammare har samma mått som en vanlig 6-brunnar. Använd en lämplig skivinsatsen att montera kammaren på scenen av det konfokala mikroskopet.
- En automatiserad skede krävs för att bilden odlingarna parallellt. Definiera sex positioner för att avbilda i konfokal programvara. De exakta inställningar kommer att bero på förmågan hos mikroskopet användas. Typiskt ett litet z-stack (3-5 z-positioner med hänsyn till eventuellt skede avdrift) används i var och en av de 6-ställningarna och en z-stack fångas varje 2 min under 18-24 timmar. För levande bildprogram är det i allmänhet fördelaktigt att använda en bredare än optiskt optimala Pinhole inställning för att minska lasereffekten och antalet z-profiler som krävs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar representativa resultat från ett tidsförlopp experiment med hjälp av embryonala hud från Tyr :: CREB x R26YFPR embryon vid E14.5. 6 embryonala hud kulturer avbildas av konfokalmikroskopi varje 2 min i 18 timmar. Den freeware bildanalysmjukvarupaket ImageJ användes för att analysera beteendet av YFP-märkta melanoblasts i sex filmer. De melanoblasts var automatiskt spåras med hjälp av wrMTrck plugin utvecklats av Jesper Søndergaard Pedersen ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) spårnings Resultaten visas i figur 2. Filmer 1-3 är representativa för experimentet och motsvara paneler A och G. De visar den genomlysning, YFP och sammansatta vyer respektive. Den vandrande melanoblast befolkning är utomordentligt aktiv. Celler rör sig nästan hela tiden och bara pausa när de är på väg att dela med miltosis. Det är också möjligt att följa utvecklingen av den primära hårsäcken mönster över odlingsperioden i den överförda ljuskanal (figurerna 3A-3X och Movie 1).
.. Figur 1 Utrustning och installation A: Den levande avbildning kammare bas består av en klar plexiglas hölje med identiska yttermått till en 6-väl odlingsskål. Den innehåller sex hål där de 6 enskilda kammar församlingar kan Slot B:. Varje insats består av 4 delar; ett avbildningsklämma, ett bildåtergivningslägg, en TÖLP membran och en O-ring. Klippet och insatsen är svarvade ur svart acetyl plast, fann vi att ha den lägsta autofluorescens av de plaster som vi testade. O-ringen är tillverkad av PVC-ettd används för att spänna fast TÖLP membranet på botten av insatsen som bildar den luft-vätskegränssnittet (ALI). Avbildningsklämma (svart acetyl) har flera hål för att medge cirkulation av odlingsmediet C:. Den centrala axeln hos klämman är fylld med 1% agaros före användning för att ge en fast plan yta, som att montera på huden. Huden är ansluten till klämman med suturtråd innan den skjuts in i insatsen, sandwiching huden mellan agarosen och TÖLP membran. Insatsen är sedan fylld med odlingsmedium D:. Att dissekera och manipulera embryonala huden en tandborste borst monteras in i en skåra i den platta änden av en bambu kebab spett. Ett par hår pinnar kan användas i kombination med fin pincett för att dissekera embryonala hud och montera i avbildning kammaren E:.. Fotografier av de komponenter som anges i AC Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa resultat av 6 filmer som spelats in parallellt. AF: Tracking resultat från 6 filmer som spelats in parallellt för att visa funktionerna i systemet. Varje film spelades in vid 2-min tidpunkter för totalt 18 timmar (se filmer 1-3 för motsvarande filmen av paneler A och G). Positionerna för cellerna i ramen en av filmen visas och spårningsresultaten lagras ovanpå GL:. Sammanfattning av spårningsresultat ritas som nollas spårningsinformation.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Figur 3 Bilderna är från tidsförlopp filmer av hårsäcken utveckling och för en melanoblast genomgår mitos AX:.. Selected, beskurna bilder från film 1 Primära hårsäckar blir synliga under perioden av huden kultur 0-18 tim.. En LUT tillämpades på bilderna A'-X. ": Selected, beskurna bilder från Movie 2 Representant bilder av melanoblasts migrerar i utvecklings epidermis och en enskild cell (se pil i A. ') Genomgår mitos (pil i T') . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Representativa resultat av det transmitterade ljuset kanal från en 18-hr tidsförlopp experiment. </ Strong> Den primära hår-follikelstimulerande mönster, men inte självklart i början av filmen, blir mer framträdande eftersom kulturen fortskrider.
Film 2: . Representant resultat av YFP kanal från en 18-hr tidsförlopp experiment Den melanoblast befolkning är en mycket dynamisk och vandrande befolkning. Sällsynta stationära celler är vanligtvis genomgår mitos (se figur 3).
Film 3: . Representant resultat av den sammansatta kanalen från en 18-hr tidsförlopp experiment Den melanoblast befolkning kan ses att migrera inom utvecklings epidermis och interagera med utvecklings hårsäckarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metod att odla embryonala hud som är egenhet mottaglig för live-cell imaging på inverterade konfokala mikroskop. Metoden innehåller de senaste förbättringarna som gör 6 kulturer som ska avbildas parallellt och tar bort beroendet av matrigel och Nuclepore membran av den ursprungliga metoden 6. Den avgörande tekniska skillnaden från liknande tekniker är användningen av ett gaspermeabelt TÖLP membran för att upprätta en luftvätskegränsytan och även för att fungera som ett täckglas. Vi har lyckats fortsätta kulturerna med kontinuerlig konfokal avbildning i upp till 48 timmar. Den höga upplösningen och utmärkt signal-brusförhållande av konfokala bilder tillåter spårning automatiserad cell analysera melanoblast beteende i de resulterande tidsförlopp filmer.
Med denna teknik är det möjligt att undersöka dynamiken hos melanoblast dispersal och studera deras samspel med epidermis och i utvecklings hårsäckar. Den kritiska steps i protokollet är att genomföra en noggrann dissektion som inte skadar utvecklings epidermis och att montera hudprover dermala sida mot agaros utan veck eller sträckor. Det förfarande som beskrivs i detta dokument fungerar bäst mellan E13.5 och E15.5. Innan E13.5 huden är mycket bräcklig och efter E15.5 det är relativt tjock och svår att tränga genom konfokalmikroskopi. Funktionerna i mikroskop som används är också mycket viktiga. Vi använder vanligtvis en Nikon A1R konfokalmikroskop utrustad med Nikons egenutvecklade perfekt fokus systemet (PFS). Använda PFS kraftigt minskar antalet dåliga filmer som orsakas av scenen drift, liknande system finns för andra plattformar.
En nackdel med denna teknik är kravet på specialiserad kultur utrustning. Designen är dock enkel och kammaren kan lätt monteras av en liten teknisk verkstad. Sammanfattningsvis presenterar vi en enkel metod som bör vara av stor nytta för studies av embryonala hud utveckling och melanoblast beteende. Man räknar med att tekniken även kan modifieras för andra scenarier där en luft-vätske-gränssnittet är ett krav för framgångsrik odling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av grundfinansiering från det medicinska forskningsrådet. Vi är tacksamma till Craig Nicol för att förbereda tekniska ritningar. Vi är tacksamma för Matthew Pearson och Paul Perry för deras avbildning stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. Turksen, K. 289, Humana Press. 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), Cambridge, England. 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
