Summary
我々は、マウス胚の皮膚の切開およびex vivoでの文化について説明します。培養系は、組織表面を横切って気液界面を維持し、倒立顕微鏡でイメージングを可能にする。メラノブラスト、現像皮膚の成分は、それらの蛍光挙動は、共焦点顕微鏡を用いて観察することを可能に標識される。
Abstract
メラノブラストは、メラニン細胞の神経堤に由来する前駆体である;皮膚及び毛髪における顔料の製造に関与する細胞である。メラノブラストは、彼らはその後、発展途上毛包1,2にコロニーを形成する胚の表皮を通って移動。神経堤細胞の移動が盛んにin vitroで検討されているが、in vivo法でまだよく、特に哺乳動物系では、開発されていない。一つの選択肢は、ex vivoでの器官培養3-6を使用することです。マウス胎児の皮膚の培養組織3,6の表面を横切って気液界面（ALI）のメンテナンスを必要とします。マウス胎児の皮膚の高解像度ライブイメージングは、このALIを維持だけでなく、文化が反転し、したがって、短い作動距離の対物レンズと、ほとんどの共焦点顕微鏡と互換性があることを可能にするだけでなく、良い方法がないことによって妨げられてきた。この記事では、メタへの最近の改善について説明しますこれらの問題を克服し、ex vivoで培養中の胚の皮膚6の高分解能共焦点イメージングを可能にするガス透過性膜を使用して外径。 R26YFPRレポーターラインと組み合わせるメラノブラスト特定のCreリコンビナーゼ発現するマウスラインを使用して、我々は、蛍光これらの皮膚の培養内メラノブラストの人口にラベルを付けることができます。技術はメラノブラスト、彼らが開発している組織と彼らの行動や相互作用の観察のライブイメージングを可能にする。代表的な結果を並列に6の文化をイメージ生きる能力を実証するために含まれる。
Introduction
伝統的に、胚皮膚は、マウスの胚から解剖し、ポリカーボネートヌクレポア膜上に搭載することによって培養されています。次いで、膜をこのように発達中の組織3,4の表面にわたって空気-液体界面を維持し、培養培地に浮遊される。この技術は、組織を固定し、マーカ7のようにβ-ガラクトシダーゼを用いたメラノブラスト分布を評価することによってメラノブラスト挙動をアッセイするために使用されている。私たちは、ex vivoで皮膚培養6における蛍光標識されたメラノブラストのライブイメージングを可能にする方法を開発した。ここでは、共焦点イメージングを生きるために、セットアップに、解剖から詳細に方法を説明し、いくつかの最近の改善が含まれています。
メラノブラストは、メラノサイトの胚性前駆体、髪や肌に色素を産生する細胞である。メラノブラストは、発達中のマウス（e）で胎生9（E9）付近で神経管に隣接した神経堤で発生mbryo。その後彼らは、外胚葉と発展体節間の背側の経路に沿って移動する。 E12.5で彼らは増殖し、その移行を続行表皮に真皮から移動する。主な毛包のパターンはE14.5で表皮に形成し始めるとE15.5のメラノブラストすることにより、これらの卵胞にローカライズされています。メラノブラスト/メラノサイト開発のレビューのためにトーマス·エリクソン（2008年）1を参照してください。メラノブラストの人口を標識するために、我々は、Tyrを組み合わせている::条件付きでROSA26遺伝子座 9から黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現R26YFPR動物とマウスチロシナーゼプロモーター8によって駆動のCre-リコンビナーゼを表現CREB動物。
私たちは、倒立型共焦点顕微鏡を用いて培養、胚、皮膚や撮影画像にする方法を説明します。それは、モートらに記載の元の方法。（2010年）6形に構成されている。現在この方法は、6 - ウェルフォーマットで画像化を可能にし、ヌクレポア膜上や文化を支援するマトリゲルへの依存を削除します。代わりに、胚の皮膚を安定させるために1％アガロースの小ブロックを用いた。マトリゲルへの依存を削除しても、特に水溶性の成長因子に対する胚の皮膚の応答が研究の焦点である状況では重要である。当社独自の方法では、すでにメラノブラスト開発10月13日に新たな洞察を得るために使用されており、我々は我々がここで説明する改善が複数の並列文化が要件で、特に実験手法として、それがより強力になると予想している。
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Protocol
全ての動物作業は、英国内務省（プロジェクトライセンス番号PPL 3785分の60および4424分の60）によってライセンスの下で施設のガイドラインに準じて行った。
1。準備
- CREB 8とのWnt1 :: Creを 14は、Cre発現ラインとして成功裏に使用されている:: CREA、Tyrの:: Tyrの蛍光レポーターマウス系統との適切なのCreリコンビナーゼを発現するマウス系統を組み合わせて開発した皮膚におけるメラノブラストにラベルを付け、リポーターラインとしてR26YFPR 9。
- 層流フード内の培養液を準備します。 （1％v / vのペニシリン/ストレプトマイシン）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補う、10％v / vのウシ胎児血清および0.584グラム/ LのL-グルタミン。
- ライブイメージング装置は70％エタノールで拭くことにより、撮像チャンバ·ベースを滅菌し、図1に概説されている。 OVを浸漬することによって挿入、撮像クリップ、およびO-リングを滅菌70％エタノール中ernight。チャンバーの蓋として6ウェルプレートから無菌の蓋を使用してください。
- 撮像チャンバーの底面は、O-リング（ 図1）によって適所に保持不器用な人膜からなる。 35ミリメートルのガス透過性のろまディッシュで始まります。イメージングチャンバーの上の皿を置き、片刃かみそりの刃で気体透過膜をカット。イメージング室に固定した膜の上にOリングを押してください。
- 画像クリップ（合計6）が所定の位置に胚性皮膚使用の前に、彼らは1％アガロースで満たされなければならない（ 図1）をクランプします。 60℃に電子レンジと冷却することにより、無菌のdH 2 Oでアガロースの2％溶液を準備しますを10mlの培地との混合1:1（ステップ2を参照）を60℃に予熱滅菌した6ウェルプレート中で6撮像クリップスタンド。微細pastetteを使用して、各クリップの中央に1％アガロース溶液を垂らし冷却する。 αを防止するために各ウェルに1ミリリットル冷滅菌PBSを追加乾燥からgarose。撮像クリップは、PBS中で数時間保存することができる。
- 胚皮膚の繊細な分離を実施することとする代わりに竹のケバブ串を使用できる箸を使用するのでは、柏木ら 3で説明したように解剖し、組織が 「ヘアスティック方式'を使用処理する。片刃カミソリの刃を使用して串の平らな端の小さなスリットを作り、毛柔らかい歯ブラシを挿入します。それは、長さが15cm程度になるように串をトリミング。
- 空気中のCO 2 5％を提供する完全な環境室やステージトップ室と共焦点顕微鏡を使用してください。撮像前に、少なくとも1時間、37℃に顕微鏡ステージを予熱し。これは、ウォームアップ、ステージ構成要素の膨張によるサンプルのドリフトを防ぐことができます。
- 1は、迅速かつ容易にexperimenを設定するために、各文化の真ん中を中心にできるように、顕微鏡の制御ソフトウェアを使用してマルチポジションセットを準備しますT。
2。手順
- マウスを嵌合させ、日E0.5として初日ポスト交尾を指定します。日E14.5で、頚椎脱臼により女性を間引くと、小さな正中切開を作る頭と尾に向けて皮を引き離すと、基になる腹膜を切断し、後身頃の両側に剥がすことで体腔を公開します。ピンセットでしっかりと保持し、外科はさみを使用して子宮間膜に沿って切り取ることで冷滅菌PBSに子宮を解剖。必要になるまで氷上で子宮を保つ。詳細については、シェイら （2007）15を参照してください。
- 第一の微細鉗子二対でそれらを引き離すことによって脱落膜を解放するために、外科用ハサミで子宮壁の長さに切断し、次いで、脱落膜から胚を解剖することによって子宮から胚を解剖する。蛍光レポーター発現（必要な場合）のための画面が表示されます。
- 解剖の前に断頭により胚を間引く。 SUBSequently尾を削除し、手足や片刃カミソリの刃を使用して、その後前肢後肢。必要に応じて、遺伝子型判定のための組織を保持します。
- 吻側 - 尾側方向に正中線に近いventrumに切開する。ステップ1.6で説明した髪スティックを使用して、慎重に同時に胚を回転下にある結合組織から肌を離れていじめる。完全に皮膚を除去ではなく、最初の切開部から腹側のエッジ遠い沿って取り付け、それを放置しないでください。
- それはそれからマウントすることは非常に困難であるようになって肌がめちゃくちゃにさせないことが重要です。これを防ぐには、乾いたシャーレの表面に毛が付いています（真皮側を上にして）を使用して、肌を平らにしてから片刃カミソリの刃を使用して、離れて胚幹から切る。皮膚が除去される前に真皮側を切開し、組織および胚との間の接合部の注意深い観察により表皮側から区別することができる。切開した組織の領域である約0.5mm 2 E14.5胚を解剖。
- アガロースが組織の真皮側に触れているように、皮膚の上に画像クリップを配置します。 60秒間放置した後、慎重にクリップの側面まで組織の縁をいじめることができます。クリップを反転し、毛が肌を平らにし、極力（画像化される領域に）組織の表面に触れるように注意しながら、任意の気泡を除去するためにスティックを使用します。
- 彼らは締めとクリップの上部に近い溝に皮膚を引っ張るように、イメージング·クリップの両側に二つの簡単な親指の結び目を用いた撮像クリップに肌を結ぶために絹の縫合糸を使用しています。クリップを反転、画像挿入とベース内の場所の中に押し込みます。 （ステップ1.2を参照）の培地〜5ミリリットルで挿入を埋める。 図1は、撮影室のアセンブリの概要を説明します。
- 残りの5個のサンプルのプロトコルを繰り返します。
3。ライブイメージング
- 撮像チャンバは、標準的な6ウェルプレートと同じ寸法を有する。共焦点顕微鏡のステージ上のチャンバを取り付けるために、適切なプレートインサートを使用してください。
- 自動化されたステージは、並行して培養物をイメージするために必要です。共焦点ソフトウェアイメージへの6つの位置を定義します。正確な設定は、使用される顕微鏡の能力に依存します。典型的には、小さなzスタックは、（3-5 z位置は、任意のステージのドリフトを考慮するため）6位のそれぞれで使用され、zスタックは、18〜24時間、2分毎に捕捉される。ライブイメージング用途のためには、レーザー出力と必要なz軸部の数を減らすために光学的に最適なピンホールよりも広く設定を使用することが一般に有利である。
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Representative Results
図2は、Tyrからの胚性スキンを使用して時間経過の実験からの代表的な結果を示しています:: CREBは E14.5でR26YFPR胚をX。 6胚性皮膚培養物を18時間ごとに2分、共焦点顕微鏡で画像化した。フリーウェアの画像解析ソフトウェアパッケージImageJの6映画のYFP-標識メラノブラストの挙動を分析した。メラノブラストは自動的に（イェスパーSøndergaardペダーセンが開発したwrMTrckプラグインを使用して追跡したhttp://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html 1-3は 、実験の代表例である。 作品 ）追跡結果を図2に表示され、彼らはそれぞれ、透過光、YFPおよび複合ビューを表示するパネルAおよびGに対応しています。移行メラノブラスト人口は非常にアクティブになります。細胞はほとんど常に移動して、彼らはマイルで割るしようとしている場合にのみ一時停止するtosis。これは、透過光チャネル（ 図3A〜3Xとムービー1）中の培養期間にわたって一次毛包パターンの発生を観察することも可能である。
図1の装置とセットアップA：ライブイメージングチャンバーベースは6ウェル培養皿と同一の外形寸法を有する透明なパースペックス筐体で構成されています。それは6個々のチャンバアセンブリをスロットのできる6つの穴が含まれている、B：各インサートは4のコンポーネントで構成され、。撮像クリップ、撮像インサート、不器用な人の膜、およびO-リング。クリップとインサートは黒アセチルプラスチックから旋盤加工されて、我々は、これは我々がテストしたプラスチックの最低自己蛍光を有することが判明。 O-リングはPVC ANから作られるdは、空気液体界面（ALI）を形成するインサートの底部に不器用な人膜をクランプするために使用される。撮像クリップ（黒アセチル）培地の循環を可能にするいくつかの穴を有するC：クリップの中心軸は、皮膚をマウントするためにその上に固い平坦な表面を提供するために、使用前に1％アガロースが充填されている。皮膚は、アガロースおよび不器用な人膜との間の皮膚を挟んで、インサートに押し込まれる前に、縫合糸とクリップに取り付けられている。インサートは、その後培養液で満たされているD：単独歯ブラシ毛を胚性皮膚を分析し、操作するためには、竹のケバブ串の平らな端にスリットに装着されている。毛髪スティックの対は、胚皮膚を切開し、撮像チャンバ内にマウントする微細鉗子と組み合わせて使用することができるE：ACに詳述の構成要素の写真をクリックして下さいここで、この図の拡大版を表示します。
図2。並列に記録された6本のビデオの代表的な結果。 AF：システムの能力を実証するために、並列に記録されて6本のビデオからのトラッキング結果。各ムービーは（パネルAおよびGの対応する映画の作品1-3を参照）18時間、合計2分の時点で記録した。ムービーのフレームのいずれかでの細胞の位置を示し、追跡結果が上に重畳されるGL：追跡結果のまとめは、ゼロトラッキングデータとしてプロットした。
d/51352/51352fig3.jpg "/>
図3毛包の開発や有糸分裂が起こったメラノブラストの経時映画から代表的な画像AX：選択した、 映画1からフレームをクロップドプライマリ毛包が0-18時間から皮膚培養の期間にわたって目に見えるようになる。 LUTを画像に適用したA'-X '：選択した、 映画2からフレームをクロッピング開発表皮と、個々のセルに移行するメラノブラストの代表的な画像は、（Aの矢印を参照してください。'）有糸分裂（Tの矢印'）を受けている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
映画の1： 18-HRタイムラプス実験からの透過光チャネルの代表的な結果。 </ strong>は、一次毛包パターン培養が進むにつれて、映画の開始時に明らかにされていないが、より顕著になる。
映画2： 。18-HRタイムラプス実験からYFPチャンネルの代表的な結果メラノブラストの人口は非常に動的かつ渡り鳥集団である。希少な静止細胞は通常（ 図3を参照）有糸分裂が起こっている。
映画3： 。18-HRタイムラプス実験からのコンポジットチャネルの代表的な結果メラノブラストの人口は、発展途上表皮内で移動して、発展途上毛包と対話するために見ることができます。
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Discussion
私たちは、倒立型共焦点顕微鏡をONに生細胞イメージング従順特殊性である文化、胚、皮膚への方法を記載している。この方法は、6文化が並行して画像化し、マトリゲルと元のメソッド6のヌクレポアメンブレンへの依存を削除することを可能にする最近の改善が含まれています。類似の技術からの重要な技術的違いは、空気液体界面を確立するとともに、カバースリップとして作用するガス透過性膜不器用な人の使用である。我々は成功し、最大48時間の連続共焦点イメージングと文化を維持している。共焦点画像のSN比、高解像度と優れた信号は、自動化された細胞追跡、結果のタイムラプスムービーでメラノブラストの行動を分析することができます。
この技術を使用すると、それはメラノブラスト分散の動態を調査し、表皮および現像毛包との相互作用を研究することが可能である。重要なSTプロトコルでのEPSは、発展途上表皮を傷つけず、ねじれたりストレッチすることなく、アガロースに対する皮膚サンプル真皮側をマウントするために慎重に解剖を実施することである。このホワイトペーパーで説明する手順は、E13.5およびE15.5の間で最適に動作します。 E13.5前に皮膚は非常に壊れやすく、E15.5の後、それは、共焦点顕微鏡によって浸透する比較的厚いと難しいです。使用顕微鏡システムの能力も非常に重要である。私たちは通常、ニコン独自の完璧なフォーカスシステム（PFS）を搭載したニコンA1R共焦点顕微鏡を使用しています。 PFSを使用すると、大幅にステージドリフトによる不正な映画の数を減らすことができ、同様のシステムは、他のプラットフォームで使用できます。
この技術の一つの欠点は、特殊な培養装置のための要件である。しかしデザインはシンプルで、室内には簡単に任意の小さな技術的なワークショップで組み立てることができた。要約すると、我々はstudieのための広範な使用のものであるべきである簡単な方法を提示胚皮膚の開発とメラノブラスト行動のS。これは、技術はまた、気液界面が成功した培養のための要件である他のシナリオのために改変され得ることが予想される。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
仕事は医学研究評議会からのコア資金によってサポートされていました。我々は技術的な図面を製造するためのクレイグニコルに感謝しています。我々は彼らのイメージングをサポートするためのマシュー·ピアソン、ポール·ペリーに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
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