Summary
我们描述了小鼠胚胎皮肤的解剖和体外培养。培养系统保持一个气 - 液界面在整个组织表面，并允许成像于倒置显微镜。黑素细胞中，显影皮肤的成分，被荧光标记的允许使用共聚焦显微镜观察其行为。
Abstract
黑素细胞是黑素细胞衍生的前体神经嵴;细胞负责产生色素在皮肤和头发。黑素细胞经过胚胎，他们随后殖民开发毛囊1,2的表皮迁移。神经嵴细胞的迁移是广泛的研究在体外 ，但体内的方法仍然没有得到很好的发展，特别是在哺乳动物系统。一种替代方法是使用体外器官型培养3-6。小鼠胚胎皮肤培养需要一个气-液界面（ALI）的跨组织3,6的表面的维护。高分辨率实时成像的小鼠胚胎的皮肤已经受到阻碍，缺乏一个很好的方法，它不仅保持了这个ALI的也可以让文化被倒置，因此，短工作距离物镜，最共聚焦显微镜兼容的。本文介绍了最新改进的甲基OD使用的气体透过膜，以克服这些问题，并允许胚胎皮肤中体外培养6的高分辨率共焦成像。通过使用黑素细胞特异性表达Cre重组酶表达小鼠线结合R26YFPR记者一行，我们能够这些皮肤文化中，以荧光标记的黑素细胞的人口。该技术允许实时成像黑素细胞，并观察他们的行为，并与他们发展组织的相互作用。代表性的成果包括以展示能力，生活图像6文化并行。
Introduction
传统胚胎皮肤已经培养了来自小鼠胚胎解剖和安装在聚碳酸酯核孔膜。然后将膜漂浮在培养基中，从而保持一个气-液界面在发展中国家组织3,4的表面上。这一技术已被用于固定组织，并评估用β-半乳糖苷酶作为标记7黑素细胞分布测定黑素细胞的行为。我们已经开发出一种方法，可以让在体外培养皮肤的6个现场成像的荧光标记的黑素细胞。在这里，我们描述的方法在细节上剥离，设置，住聚焦成像，其中包括最近的一些改进。
黑素细胞是黑素细胞的胚胎前体，产生色素在头发和皮肤细胞。黑素细胞起源在邻近神经管的神经嵴在胚胎周围每天9（E9）在发育中的小鼠émbryo。随后，他们沿着外胚层和开发体节之间的背侧途径迁移。在E12.5他们从真皮层移动到它们增殖并继续他们的迁移表皮。初级毛囊格局开始形成本地化是这些毛囊在表皮在E14.5和E15.5黑素细胞。对于黑素细胞/黑素细胞发展的综述参见托马斯＆埃里克森（2008年）1。以标签的黑素细胞的人口，我们结合酪氨酸::动物CREB表达Cre重组酶的小鼠酪氨酸酶启动子8与R26YFPR动物表达黄色荧光蛋白（YFP）有条件地从ROSA26轨迹9驱动。
我们描述的方法来使用倒置共聚焦显微镜培养胚胎皮肤和采集图像。它适于形式在莫特等人描述的原始方法（2010）6。本方法使成像在6孔格式和消除了对核孔膜和基质胶上的依赖，以支持培养。代替用1％琼脂糖的一个小块，以稳定胚胎皮肤。去除基质胶上的依赖是很重要的特别是当胚胎皮肤的可溶性生长因子的响应是研究的重点。我们原来的方法已经被用来获得新的见解黑素细胞发展10-13和我们预期，我们在这里描述的改进将使其更加强大的实验技术特别是在多个并行的文化是一个要求。
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Protocol
由英国内政部（项目许可证编号PPL三千七百八十五分之六十〇和四千四百二十四分之六十〇）按照许可制度的指引下进行的所有动物的工作。
1。准备
- 通过结合荧光报道鼠标线适当Cre重组酶表达小鼠线标记在显影皮肤的黑素细胞。 酪氨酸:: CREA，酪氨酸:: CREB 8和WNT1 ::酶Cre 14已被成功地用作Cre的表达株系和R26YFPR 9当记者一行。
- 准备在层流罩的培养基;补充的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）与（1％体积/体积青霉素/链霉素），10％体积/体积的胎牛血清和0.584克/ L的L-谷氨酰胺。
- 实时成像设备在图1中概述了通过擦拭下用70％乙醇消毒成像室基部。由OV浸泡消毒刀片，影像剪辑，和O型圈ernight在70％乙醇中。从6孔板中使用的无菌盖的所述腔室的盖子。
- 成像腔室的底部表面由通过一个O形环（ 图1）保持在适当位置一个lummox膜。先从35毫米透气性lummox菜。将培养皿在成像腔和切出的气体渗透膜用单刃剃刀片。将O型圈在膜将其固定到成像室。
- 成像剪辑（共6个）夹紧胚胎皮肤到位（ 图1），他们必须充满1％琼脂糖后再使用。通过微波，冷却至60°C。准备琼脂糖用无菌DH 2 O的2％溶液混合1点01分，用10ml培养基（见步骤2）预热至60℃。站在6影像片段在无菌6孔板。滴落的1％琼脂糖溶液倒入用细pastette每个片段的中心，并允许冷却。加入1毫升冷的无菌PBS至各孔，以防止一从晒出garose。摄像剪辑可以存储几个小时的PBS中。
- 开展胚胎皮肤的细腻分离和处理的解剖组织使用的头发粘法“作为柏木等 3所描述而不是使用筷子竹烤肉串可以使用。做一个小切口在使用单刃刀片的扦子的平端插入一个柔软的牙刷的刷毛。修剪所述扦子，以便它的长度为15cm左右。
- 使用共聚焦显微镜采用了全环境 室或舞台顶室提供5％CO 2的空气中。 Prewarm显微镜载物台至37℃至少1小时前成像。这有助于防止因膨胀阶段元器件的样本漂移，因为它们升温。
- 使用显微镜的控制软件准备了多套位置，这样一方面可以快速，轻松地集中在每一种文化的中间设立一个experimen万吨。
2。程序
- 交配的小鼠和指定的第一天交配后的一天E0.5。在E14.5天，通过颈脱位法宰杀阴和通过一个小的中线切口，拉开朝向头部和尾部的皮肤，然后切割底层腹膜和敲打回到身体的两侧暴露的体腔。解剖子宫放入冷水无菌PBS用钳子夹住坚决和使用手术剪沿系膜及剪断。保留子宫置于冰上，直到需要。有关详细说明见Shea 等。（2007）15。
- 通过首先切割子宫壁与外科剪刀的长度，以释放蜕膜然后解剖从蜕膜的胚胎通过它们拉开有两对细镊子解剖从子宫胚胎。屏幕为荧光报道表达式（如果需要）。
- 前宰杀解剖胚胎斩首。替补equently拆下尾，并用单刃剃刀片后肢然后前肢。如果需要保留的组织进行基因分型。
- 使在ventrum靠近中线的rostro脚方向的切口。用卷发棒在步骤1.6中所述，小心地挑逗远离底层的结缔组织的同时转动胚胎皮肤。不要完全去除皮肤，而是让它沿着从第一切口腹缘最远连接。
- 重要的是不要让皮肤变得搞砸了，因为它是那么很难安装是非常重要的。为了防止这种情况，用卷发棒（皮肤的一面朝上），干燥的培养皿的表面变平的皮肤，然后切离胚胎躯干使用单刃刀片。真皮侧可以从表皮侧通过仔细观察的解剖组织和胚胎之间的交界处被识别的皮肤被移除之前。的解剖组织的面积为大约0.5mm 2的解剖胚胎E14.5时。
- 放置成像夹在皮肤上的顶部，以使琼脂糖接触到组织的真皮侧。静置60秒，然后小心地挑逗组织了夹子的两侧边缘。颠倒的剪辑，并使用发粘变平的皮肤和除去任何气泡，小心触摸到组织的表面（在将要成像的面积）尽可能少。
- 用丝线缝合线用两个简单的拇指结对成像夹两侧的皮肤绑成像片段，让他们拧紧和拉扯皮肤进沟接近剪辑的开头。颠倒的片段，推成像插入并装在基座内。用约5ml培养基的填充插入件（参见步骤1.2）。 图1概括成像室的组装。
- 重复协议的其余5个样品。
3，活成像
- 成像腔室具有相同的尺寸为标准6孔板中。使用适当的板插入到安装在室内的共聚焦显微镜的阶段。
- 一种自动化的阶段是必需的，以图像中的平行的培养物。定义了六个位置到图像中的共聚焦软件。确切的设置将取决于所使用的显微镜的能力。通常是一个小的z栈（3-5 z轴位置以考虑任何阶段漂移）用于在每一个6位的和的z栈被捕获每2分钟为18-24小时。用于活成像应用中，通常有利的是使用一种比旋光最佳针孔设定较宽，从而降低激光器功率和所需的z部分的数目。
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Representative Results
图2显示了从一个时间间隔实验使用来自酪氨酸胚胎皮肤代表性结果:: CREB x R26YFPR胚胎在E14.5。 6胚胎皮肤培养物的共聚焦显微镜成像，每2分钟18小时。免费软件图像分析软件包的ImageJ用于分析在6电影的YFP标记的黑素细胞的行为。在黑素细胞是使用wrMTrck插件由帕尼SøndergaardPedersen的开发（自动跟踪http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ）的跟踪结果显示在图2中 。 影1-3为代表的实验和对应于面板A和G，分别显示透射光，YFP和复合的看法。在黑素细胞迁移人口显得格外活跃。电池的举动几乎不断，只有当他们即将通过英里划分暂停tosis。另外，也可以观察到超过在所述透射光路（ 图3A-3X和电影1）培养期间初级毛囊图案的发展。
。图1设备和设置答：实时成像室群包括一个明确的有机玻璃外壳具有相同的外部尺寸为6孔培养皿中。它包含了六个洞，其中6个人腔组件可以插槽B：每个刀片包括4个组成部分;摄像剪辑，成像刀片，一个lummox膜，和一个O形环。剪辑和插入从黑色乙酰塑料车床加工，我们发现这有我们测试的塑料的最低自发荧光。 O形圈是由聚氯乙烯制成的d被用于夹紧lummox膜到插入件形成空气液体界面（ALI）的底部。成像夹（黑色乙酰基）有几个孔，以便循环培养液中的C：剪辑的中心轴使用，以提供在其上安装的皮肤坚实平坦的表面之前充满1％琼脂糖。皮肤被附加到与缝合线的夹推入插入，夹在琼脂糖和lummox膜之间的皮肤之前。插入，然后充满培养基D：要解剖和操纵胚胎皮肤单个牙齿刷毛装成竹烤肉串的平端的缝隙。一对卷发棒可以用在用细镊子结合解剖胚胎皮肤和成像室安装E：在交流中详述的组件的照片请点击此处查看这个数字的放大版本。
图2中记录的并行6电影代表性的结果。 AF：跟踪结果从记录在平行于演示系统的能力6电影。每部电影被记录了在2分钟的时间点，共18小时（见电影1-3面板A和相应的电影G）。将细胞在电影的帧1的位置被示出和跟踪结果被叠加在顶部GL。的跟踪结果总结绘制成零的跟踪数据。
d/51352/51352fig3.jpg“/>
图3从毛囊发育和AX的黑素细胞有丝分裂发生的时间推移电影代表图像：。选择，从电影1帧裁剪初级毛囊变得过度的皮肤文化从0-18小时期间内可见。的LUT应用于图像A'-X'：选中，剪裁帧从电影2黑素细胞中的显影表皮和个体细胞迁移的代表性的图像（见箭头在甲'）进行有丝分裂（箭头T'） 。 请点击此处查看此图的放大版本。
电影1：从一个18小时的时间推移实验透射光通道的代表结果。 </ STRONG>初级毛囊的模式，虽然不是明显的在影片的开始，变得更加突出，因为文化的进步。
电影2：从一个18小时的时间推移实验YFP通道的代表结果的黑素细胞的人口是一个高度动态和流动人口。罕见的静止细胞通常处于有丝分裂（参见图3）。
电影3：从一个18小时的时间推移实验的复合信道的代表性的结果的黑素细胞群体可以看出，在显影表皮内迁移和与显影毛囊交互。
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Discussion
我们描述一个方法来培养胚胎的皮肤是特殊性服从活细胞成像的共聚焦倒置显微镜。该方法包括近期的改进，允许6文化进行成像的并行和消除了对基质胶与原方法的6核孔膜的依赖。从类似的技术的关键技术的区别在于使用具有透气性的lummox膜的建立空气液体界面并且还充当盖玻片。我们已经成功地保持了连续的共焦成像的培养长达48小时。高分辨率和出色的信号发送到共焦图象的信噪比允许自动细胞跟踪分析中所得到的时间推移电影黑素细胞的行为。
使用这种技术，可以进行调查黑素细胞扩散的动力学和研究它们的相互作用与表皮和发展中国家的头发毛囊。关键的ST在协议的EPS是进行了认真的解剖，不损伤表皮开发和安装的皮肤样本真皮侧对琼脂糖无扭结或延伸。在本文中描述的过程E13.5和E15.5之间效果最好。 E13.5以前皮肤很脆弱，E15.5之后就比较厚和硬，激光共聚焦显微镜渗透。所用的显微镜系统的能力也是很重要的。我们通常使用尼康A1R共聚焦显微镜配备了尼康独有的完美的对焦系统（PFS）。使用PFS大大减少所造成的阶段漂移坏电影的数量，类似的系统可用于其他平台。
这种技术的缺点之一是为专门培养设备的要求。但是设计简单和室可以通过任何一个小的技术研讨会很方便地组装。综上所述，我们提出了要对科仪广泛使用的一种简单方法s胚胎皮肤的发育和黑素细胞的行为。可以预料，该技术也可以修改为其他方案中的空气 - 液体界面是用于培养成功的必要条件。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由医学研究委员会的核心资金支持。我们感谢克雷格·尼科尔编制技术图纸。我们感谢马修·皮尔逊和保罗·佩里为他们的影像支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
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