Summary
Descriviamo la dissezione e ex vivo della cultura di topo pelle embrionale. Il sistema di coltura mantiene un'interfaccia aria-liquido attraverso la superficie del tessuto e permette l'imaging su un microscopio invertito. Melanoblasts, un componente della pelle in via di sviluppo, sono fluorescente permettendo loro comportamento da osservare mediante microscopia confocale.
Abstract
Melanoblasts sono cresta neurale precursori dei melanociti derivati; le cellule responsabili della produzione del pigmento nella pelle e dei capelli. Melanoblasts migrano attraverso l'epidermide dell'embrione dove successivamente si colonizzano i capelli sviluppare follicoli 1,2. Migrazione neurale delle cellule cresta è ampiamente studiato in vitro, ma in vivo non sono ancora ben sviluppati, soprattutto nei sistemi mammiferi. Una alternativa è quella di utilizzare ex vivo della cultura organotipica 3-6. Cultura di topo pelle embrionale richiede il mantenimento di una interfaccia aria-liquido (ALI) sulla superficie del tessuto 3,6. Alta risoluzione live-imaging topo pelle embrionali è stata ostacolata dalla mancanza di un buon metodo che non solo mantiene questo ALI ma permette anche la cultura di invertire e quindi compatibile con lenti dell'obiettivo a breve distanza di lavoro e microscopi più confocale. Questo articolo descrive i recenti miglioramenti ad un method che utilizza una membrana permeabile ai gas per superare questi problemi e permettere ad alta risoluzione confocale di pelle embrionale in coltura ex vivo 6. Utilizzando un melanoblast specifico Cre-ricombinasi esprimendo linea di topi in combinazione con la linea giornalista R26YFPR siamo in grado di etichettare fluorescente popolazione melanoblast all'interno di queste culture pelle. La tecnica consente live-imaging melanoblasts e osservazione del loro comportamento e le interazioni con il tessuto in cui si sviluppano. Risultati rappresentativi sono inclusi per dimostrare la capacità di vivere-image 6 culture in parallelo.
Introduction
Tradizionalmente pelle embrionale è stato coltivate sezionando dall'embrione mouse e montaggio su Nuclepore membrana di policarbonato. La membrana viene poi collocato sul mezzo di coltura, mantenendo così una interfaccia aria-liquido sulla superficie del tessuto sviluppo 3,4. Questa tecnica è stata utilizzata per saggiare il comportamento melanoblast fissando il tessuto e valutare la distribuzione melanoblast con β-galattosidasi come marcatore 7. Abbiamo sviluppato un metodo che permette melanoblasts live-imaging fluorescente in ex vivo della cultura pelle 6. Qui si descrive il metodo in dettaglio da dissezione, per l'installazione, per vivere confocale e comprende alcuni recenti miglioramenti.
Melanoblasts sono i precursori embrionali dei melanociti, le cellule che producono pigmento nei capelli e la pelle. Melanoblasts sorgono nella cresta neurale adiacente al tubo neurale intorno al giorno embrionale 9 (E9) nel topo sviluppo embryo. Successivamente migrano lungo un percorso dorsolaterale tra l'ectoderma e somiti in via di sviluppo. A E12.5 si muovono dal derma all'epidermide dove proliferano e continuano la loro migrazione. Il follicolo capelli modello primario comincia a formarsi nell'epidermide a E14.5 e E15.5 melanoblasts sono la localizzazione di questi follicoli. Per una rassegna di sviluppo melanoblast / melanociti vedere Thomas & Erickson (2008) 1. Per etichettare la popolazione melanoblast abbiamo combinato Tyr :: CREB animali che esprimono Cre-ricombinasi guidata dal promotore del mouse tirosinasi 8 con animali R26YFPR che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) condizionalmente dal locus Rosa26 9.
Descriviamo un metodo per la cultura della pelle e catturare le immagini embrionali utilizzando un microscopio confocale invertito. E 'adatta forma il metodo originale descritto in Mort et al. (2010) 6. L'attualemetodo permette l'imaging in un formato da 6 pozzetti e rimuove la dipendenza membrane Nuclepore e matrigel a sostenere la cultura. Invece utilizzando un piccolo blocco di 1% agarosio per stabilizzare la pelle embrionale. Eliminare la dipendenza matrigel è importante soprattutto in situazioni in cui la risposta della pelle embrionale di fattori di crescita solubili è al centro di studio. Il nostro metodo originale è già stato utilizzato per acquisire nuove conoscenze in sviluppo melanoblast 10-13 e ci aspettiamo che i miglioramenti descriviamo qui renderà più potente come una tecnica sperimentale specialmente dove più culture parallele sono un requisito.
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Protocol
Tutto il lavoro animale è stato eseguito in conformità con le linee guida istituzionali su licenza dalla UK Home Office (numero di licenza del progetto PPL 60/3785 e 60/4424).
1. Preparazione
- Etichettare le melanoblasts della pelle di sviluppo combinando una linea di topi che esprimono Cre-ricombinasi appropriata con una linea di topi reporter fluorescente. Tyr :: CREA, Tyr :: CREB 8 e Wnt1 :: Cre 14 sono stati utilizzati con successo come linee Cre-esprimono e R26YFPR 9 come linea giornalista.
- Preparare il terreno di coltura in una cappa a flusso laminare; integrare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con (1% v / v penicillina / streptomicina), 10% v / v di siero di vitello fetale e 0,584 g / L di L-glutammina.
- L'apparato di immagini dal vivo è descritto nella Figura 1 Sterilizzare base della camera di imaging strofinando giù con il 70% di etanolo. Sterilizzare gli inserti, clip, immagini e O-ring immergendo overnight in etanolo al 70%. Utilizzare un coperchio sterile da una piastra da 6 pozzetti come il coperchio della camera.
- La superficie inferiore della camera di imaging costituito da una membrana lummox trattenuto da un O-ring (Figura 1). Inizia con un gas piatto lummox permeabile da 35 mm. Posizionare il piatto sopra la camera di imaging e tagliare fuori la membrana permeabile ai gas con una sola lama di rasoio taglio. Spingere l'O-ring sulla membrana per fissarlo alla camera di imaging.
- Le clip di imaging (6 in totale) morsetto pelle embrionale in posizione (Figura 1) prima dell'uso devono essere riempiti con 1% di agarosio. Preparare una soluzione al 2% di agarosio con dH 2 O sterile nell'apparecchiatura a microonde e raffreddamento a 60 ° C. Miscela 1:1 con 10 ml di terreno di coltura (vedere il passo 2) preriscaldato a 60 ° C. Stare i 6 clip di imaging in un 6-pozzetti sterile. Gocciolare la soluzione di agarosio 1% al centro di ogni clip con una multa pastette e lasciare raffreddare. Aggiungere 1 ml di PBS sterile a freddo a ciascun pozzetto per impedire l'unagarose secchi. Le clip imaging possono essere conservati per diverse ore in PBS.
- Per effettuare la delicata separazione di pelle embrionale e manipolare il tessuto sezionato utilizzare il 'metodo bastone capelli' come descritto in Kashiwagi et al. 3 Invece di utilizzare un bastoncino di bambù kebab spiedo può essere utilizzato. Fai una piccola fessura nella parte piatta della spiedino con una singola lama di rasoio taglio e inserire uno spazzolino a setole morbide. Tagliare lo spiedo in modo che sia circa 15 cm di lunghezza.
- Utilizzare un microscopio confocale con una camera ambientale completo o inscenare camera superiore che fornisce 5% di CO 2 nell'aria. Preriscaldare palco microscopio a 37 ° C per almeno 1 ora prima di imaging. Questo aiuta a prevenire la deriva del campione causata dall'espansione dei componenti dello stadio come si riscaldano.
- Preparare un gruppo multi-posizione utilizzando il software di controllo del microscopio in modo che si può centrare rapidamente e facilmente al centro di ogni cultura impostare un sperimentazionet.
2. Procedura
- Mate i topi e designare il primo coitum giorno dopo giorno come E0.5. Al giorno E14.5, abbattere la femmina per dislocazione cervicale ed esporre la cavità del corpo attraverso una piccola incisione mediana, smontando la pelle verso la testa e la coda e poi tagliando il peritoneo sottostante e pealing ritornare a entrambi i lati del corpo. Sezionare l'utero in freddo sterile PBS tenendo saldamente con una pinza e tagliandoli lungo la mesometrium con le forbici chirurgiche. Mantenere l'utero in ghiaccio fino al momento. Per una descrizione dettagliata vedi Shea et al. (2007) 15.
- Sezionare embrioni dall'utero prima tagliando la lunghezza della parete uterina con forbici chirurgiche per rilasciare il decidua e poi sezionare gli embrioni dalla decidua Separandoli con due coppie di pinza sottile. Schermo per l'espressione reporter fluorescente (se necessario).
- Abbattere gli embrioni per decapitazione prima della dissezione. Subsequently rimuovere la coda e posteriori degli arti e poi gli arti anteriori utilizzando una singola lama di rasoio taglio. Conservare il tessuto per la genotipizzazione, se necessario.
- Fare un'incisione nel ventre vicino alla linea mediana in direzione rostro-caudale. Usando i capelli bastoni descritti al punto 1.6, stuzzicare accuratamente via la pelle dal tessuto connettivo sottostante rotazione dell'embrione allo stesso tempo. Non rimuovere la pelle completamente, ma piuttosto lasciarlo attaccato lungo il bordo ventrale più lontana dalla prima incisione.
- È importante non lasciare la pelle diventare avvitato come è poi molto difficile da montare. Per evitare questo, appiattire la pelle usando i bastoni dei capelli (lato dermico up) sulla superficie di una piastra di Petri a secco e poi tagliare dal tronco embrione utilizzando una singola lama di rasoio taglio. Il lato cutanea può essere distinto dal lato epidermica da un'attenta osservazione della giunzione tra il tessuto sezionato e l'embrione prima che la pelle viene rimosso. La superficie del tessuto è sezionatocirca 0,5 mm 2 quando sezionare un embrione E14.5.
- Posizionare una clip di imaging in cima alla pelle in modo che l'agarosio tocchi il lato del tessuto dermico. Lasciare riposare per 60 sec e poi accuratamente provocare gli bordi del tessuto fino ai lati della clip. Invertire la clip e utilizzare i capelli bastoni di appiattire la pelle ed eliminare eventuali bolle d'aria, avendo cura di toccare la superficie del tessuto (nella zona che verrà ripreso) il meno possibile.
- Utilizzare filo di sutura di seta per legare la pelle alla clip di imaging utilizzando due semplici nodi pollice su entrambi i lati del clip di imaging in modo che stringere e tirare la pelle nella scanalatura vicino alla parte superiore della clip. Invertire la clip, spingere all'interno l'inserto di imaging e posto nella base. Riempire l'inserto con ~ 5 ml di terreno di coltura (vedi passo 1.2). Figura 1 illustra il montaggio della camera di imaging.
- Ripetere protocollo per i rimanenti 5 campioni.
3. VivereImaging
- La camera di imaging ha le stesse dimensioni di una piastra da 6 pozzetti standard. Utilizzare un apposito inserto piastra per montare la camera sul palco del microscopio confocale.
- Un palcoscenico automatizzato è tenuto a immagine culture in parallelo. Definire le sei posizioni di immagine nel software confocale. Le impostazioni esatte dipenderanno dalla capacità del microscopio utilizzato. Tipicamente una piccola z-stack (3-5 z-posizioni per tenere conto di qualsiasi deriva stage) viene utilizzato in ciascuna delle 6 posizioni ed un z-stack viene catturato ogni 2 min per 18-24 ore. Per applicazioni live-immagini è generalmente vantaggioso utilizzare una più ampia impostazione pinhole otticamente ottimale per ridurre la potenza del laser e il numero di z sezioni necessarie.
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Representative Results
La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento lasso di tempo con la pelle embrionale da Tyr :: CREB x embrioni R26YFPR a E14.5. 6 colture pelle embrionali sono stati ripresi dalla microscopia confocale ogni 2 min per 18 ore. Il pacchetto software di analisi delle immagini ImageJ del freeware è stato utilizzato per analizzare il comportamento dei melanoblasts YFP-etichettati nei 6 film. I melanoblasts erano tracciati automaticamente utilizzando il plugin wrMTrck sviluppato da Jesper Søndergaard Pedersen ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) i risultati di monitoraggio vengono visualizzati nella Figura 2. Film 1-3 sono rappresentativi della sperimentazione e corrispondono a pannelli A e G. mostrano rispettivamente la luce trasmessa, YFP e viste composite. La popolazione melanoblast migrazione è straordinariamente attiva. Le cellule si muovono quasi sempre e solo una pausa quando sono in procinto di dividere per kmtosis. È anche possibile osservare lo sviluppo del follicolo dei capelli del modello primario nel periodo cultura nel canale luce trasmessa (Figure 3A-3X e film 1).
.. Figura 1 installazione e la A: La base della camera di imaging dal vivo è costituito da una custodia trasparente in perspex con identiche dimensioni esterne ad un piatto di coltura 6-bene. Esso contiene sei fori in cui i 6 singoli gruppi cameristici possono SLOT B:. Ogni inserto è composto da 4 componenti; una clip di imaging, un inserto di imaging, una membrana lummox, ed un O-ring. La clip e l'inserto sono torniti dal nero di plastica acetil, abbiamo trovato questo per avere l'autofluorescenza più basso della plastica che abbiamo testato. L'O-ring è fatto da un PVCd è utilizzato per fissare la membrana lummox sul fondo dell'inserto formare l'interfaccia liquido aria (ALI). La clip di imaging (acetil nero) ha diversi fori per consentire la circolazione del mezzo di coltura C:. L'albero centrale della clip viene riempito con 1% di agarosio prima dell'uso per fornire una superficie piana e stabile su cui montare la pelle. La pelle è attaccato alla clip con filo di sutura prima di essere spinto nell'inserto, accoppiamento della pelle tra l'agarosio e membrana lummox. L'inserto viene poi riempito con terreno di coltura D:. Sezionare e manipolare la pelle embrionale un singolo dente pennello di setola è montato in una fessura nella parte piatta di un bambù kebab spiedino. Un paio di bastoni dei capelli può essere utilizzato in combinazione con una pinza sottile per sezionare la pelle embrionale e montare nella camera di imaging E:.. Fotografie dei componenti descritti in AC cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Risultati rappresentativi di 6 filmati registrati in parallelo. AF: Monitoraggio risultati da 6 filmati registrati in parallelo per dimostrare le capacità del sistema. Ogni film è stato registrato a 2-minimo punti temporali per un totale di 18 h (vedere Film 1-3 per il corrispondente film di pannelli A e G). Le posizioni delle celle in cornice uno dei film sono mostrati ed i risultati di monitoraggio si sovrappongono in cima GL:. Sintesi dei risultati di monitoraggio tracciare azzerato i dati di rilevamento.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Figura 3 Immagini rappresentative di filmati time-lapse di capelli lo sviluppo del follicolo e di un melanoblast mitosi AX:.. Selected, ritagliata fotogrammi dal film 1 follicoli primari diventano visibili durante il periodo della cultura pelle 0-18 ore.. Un LUT è stata applicata alle immagini A'-X. ': Selected, ritagliata fotogrammi da film 2 Immagini rappresentative della melanoblasts migrazione nell'epidermide in via di sviluppo e una singola cella (vedi freccia in A'.) Mitosi (freccia in T ') . cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1: risultato Rappresentante del canale luce trasmessa da un esperimento di time-lapse di 18 ore. </ Strong> Lo schema capelli follicolo primario, sebbene non evidente all'inizio del film, diventa più evidente come la cultura progredisce.
Movie 2: . risultato Rappresentante del canale YFP da un esperimento di time-lapse di 18 ore La popolazione melanoblast è una popolazione altamente dinamico e migratori. Cellule stazionarie rare sono solitamente in mitosi (vedi Figura 3).
Movie 3: . risultato Rappresentante del canale composito da un esperimento di time-lapse di 18 ore la popolazione melanoblast può essere visto a migrare all'interno dell'epidermide in via di sviluppo e interagire con i follicoli piliferi in via di sviluppo.
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Discussion
Descriviamo un metodo per la cultura pelle embrionale che è particolarità suscettibili di imaging per il live-cell su microscopi confocale invertiti. Il metodo include i recenti miglioramenti che permettono di 6 culture di essere ripreso in parallelo e rimuove la dipendenza matrigel e membrane Nuclepore del metodo originale 6. La differenza fondamentale tecnico da tecniche simili è l'uso di una membrana permeabile ai gas lummox stabilire un'interfaccia liquido aria e anche agire come un coprioggetto. Abbiamo mantenuto con successo le culture con continuo confocale per un massimo di 48 ore. L'alta risoluzione ed eccellente rapporto segnale rumore delle immagini confocale permette il monitoraggio delle cellule automatizzato per analizzare il comportamento melanoblast nelle conseguenti film time-lapse.
Usando questa tecnica è possibile studiare le dinamiche di melanoblast dispersione e studiare la loro interazione con l'epidermide e dei follicoli piliferi in via di sviluppo. La st criticaeps nel protocollo sono di effettuare una accurata dissezione che non danneggia l'epidermide in via di sviluppo e per montare la parte cutanea campioni di pelle contro l'agarosio senza pieghe o tratti. La procedura descritta in questo articolo funziona meglio tra E13.5 e E15.5. Prima E13.5 la pelle è molto fragile e dopo E15.5 è relativamente spessa e difficile da penetrare mediante microscopia confocale. Le capacità del sistema microscopio utilizzato sono molto importanti. Usiamo tipicamente un microscopio confocale Nikon A1R dotato di sistema di Nikon proprietaria perfetta messa a fuoco (PFS). Utilizzando PFS riduce notevolmente il numero di brutti film causate da stadio deriva, sistemi analoghi sono disponibili per altre piattaforme.
Uno svantaggio di questa tecnica è il requisito di apparecchiature coltura specializzata. Tuttavia il design è semplice e la camera potrebbe essere facilmente montato da qualsiasi piccolo laboratorio tecnico. In sintesi vi presentiamo un metodo semplice che dovrebbe essere di un uso ampio di Studis di sviluppo embrionale pelle e comportamento melanoblast. Si prevede che la tecnica potrebbe anche essere modificato per altri scenari in cui una interfaccia aria-liquido è un requisito per cultura successo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di base del Medical Research Council. Siamo grati a Craig Nicol per la preparazione di disegni tecnici. Siamo grati a Matthew Pearson e Paul Perry per il loro sostegno imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
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