Summary
Descrevemos a dissecção e ex vivo cultura de rato pele embrionária. O sistema mantém uma cultura de interface ar-líquido através da superfície do tecido e permite imagens em um microscópio invertido. Melanoblastos, um componente da pele em desenvolvimento, são marcadas por fluorescência, permitindo o seu comportamento a ser observada por meio de microscopia confocal.
Abstract
Melanoblastos são a crista neural precursores de melanócitos derivados; as células responsáveis pela produção do pigmento na pele e no cabelo. Melanoblastos migra através da epiderme do embrião onde subsequentemente colonizar o cabelo desenvolver folículos 1,2. Migração das células da crista neural é amplamente estudada in vitro, mas em métodos in vivo ainda não estão bem desenvolvidos, especialmente em sistemas de mamíferos. Uma alternativa é a utilização ex vivo de cultura organotípica 3-6. Cultura de rato embrionário pele requer a manutenção de uma interface ar-líquido (ALI) em toda a superfície do tecido de 3,6. Alta resolução de imagem de live-rato pele embrionária tem sido dificultada pela falta de um bom método que não só mantém este ALI, mas também permite que a cultura seja invertida e, portanto, compatível com lentes objetivas de distância de trabalho curta e microscópios mais confocal. Este artigo descreve as recentes melhorias para a metanfetaminaod que utiliza uma membrana permeável a gás para superar estes problemas e permitir alta resolução de imagem confocal de pele embrionário em cultura ex vivo 6. Ao utilizar um melanoblasto específica Cre-recombinase expressa linha de rato combinado com a linha de repórter R26YFPR que são capazes de marcar por fluorescência da população melanoblasto dentro destas culturas de pele. A técnica permite ao vivo de imagem de melanoblastos e observação de seu comportamento e interações com o tecido em que se desenvolvem. Os resultados representativos são incluídos para demonstrar a capacidade de viver-imagem seis culturas em paralelo.
Introduction
Tradicionalmente pele embrionária foi cultivada por dissecar a partir do embrião do rato e montagem em uma membrana de policarbonato Nuclepore. A membrana é então lançada em meio de cultura, mantendo, assim, uma interface ar-líquido através da superfície do tecido em desenvolvimento 3,4. Esta técnica tem sido utilizada para avaliar o comportamento melanoblasto pela fixação do tecido e a avaliação de distribuição melanoblasto usando β-galactosidase como marcador 7. Nós desenvolvemos um método que permite melanoblastos live-imaging de fluorescente etiquetado em ex vivo cultura pele 6. Aqui vamos descrever o método em detalhes de dissecação, a configuração, a viver de imagem confocal e incluem algumas melhorias recentes.
Melanoblastos são os precursores embrionários dos melanócitos, as células que produzem o pigmento no cabelo e na pele. Melanoblastos surgem na crista neural adjacente ao tubo neural embrionária por volta do dia 9 (E9) no rato em desenvolvimento embryo. Subsequentemente migram ao longo de um percurso entre a dorsolateral ectoderme e somitos desenvolvimento. No E12.5 eles se movem da derme para a epiderme, onde proliferam e continuar sua migração. O padrão primário folículo piloso começa a se formar na epiderme em E14.5 e E15.5 por melanoblastos está localizando a esses folículos. Para uma revisão do desenvolvimento melanoblasto / melanócito ver Thomas & Erickson (2008) 1. A fim de marcar a população melanoblasto combinamos Tyr :: CREB animais que expressam Cre-recombinase, conduzido pelo promotor de rato de tirosinase com 8 animais R26YFPR que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) condicionalmente a partir do locus Rosa26 9.
Nós descrevemos um método para cultura da pele e capturar imagens embrionárias usando um microscópio confocal invertido. É adaptado forma do método original descrito em Mort et al. (2010) 6. O presentemétodo permite a formação de imagens de um formato de 6 poços e elimina a dependência de membranas Nuclepore e em matrigel para suportar a cultura. Em vez disso, utilizando um pequeno bloco de agarose a 1% para estabilizar a pele embrionário. Removendo a dependência de matrigel é importante, especialmente em situações em que a resposta da pele embrionário a factores de crescimento solúveis é o foco de estudo. Nosso método original já foi usado para ganhar novos insights sobre o desenvolvimento melanoblasto 10-13 e nós antecipamos que as melhorias que descrevemos aqui vai torná-lo mais poderoso como uma técnica experimental, especialmente onde várias culturas paralelas são uma exigência.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi executada de acordo com as diretrizes institucionais sob licença pela UK Home Office (número de licença do projeto PPL 60/3785 e 60/4424).
1. Preparação
- Identifique os melanoblastos na pele em desenvolvimento, combinando uma linha de expressar rato Cre-recombinase apropriado com uma linha de rato repórter fluorescente. :: CreA Tyr, Tyr :: CREB 8 e Wnt1 :: Cre 14 têm sido utilizados com sucesso como linhas de Cre-expressando e R26YFPR 9 como uma linha de repórter.
- Preparar o meio de cultura numa câmara de fluxo laminar; complementar de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 1% (v / v de Penicilina / Estreptomicina), 10% v / v de soro fetal de vitelo e 0,584 g / L de L-glutamina.
- O aparelho de imagem ao vivo está descrito na Figura 1 Esterilizar a base da câmara de imagiologia, limpando-se com etanol a 70%. Esterilizar as inserções, clipes de imagem, e O-rings por imersão overnight em etanol a 70%. Use uma tampa estéril a partir de uma placa de 6 poços, como a tampa da câmara.
- A superfície do fundo da câmara de imagem é composto por uma membrana lummox mantido no lugar por um anel em O (Figura 1). Comece com um 35 milímetros gás permeável lummox prato. Coloque o prato sobre a câmara de imagem e cortar a membrana permeável a gás com uma única lâmina de barbear gumes. Empurrar o anel de vedação ao longo da membrana para assegurar que a câmara de imagem.
- Os clipes de imagem (6 no total) fixar a pele embrionária no local (Figura 1) antes do uso, devem ser preenchidos com 1% de agarose. Prepara-se uma solução de 2% de agarose com dH 2 O estéril por microondas e arrefecida a 60 ° C. Mistura a 1:1 com 10 ml de meio de cultura (ver passo 2) pré-aquecido a 60 ° C. Levante os seis clipes de imagens em um estéril 6 bem-placa. Escorrer a solução de agarose a 1% para o centro de cada grampo usando um fino pastette e deixa-se arrefecer. Adicionar 1 ml de PBS estéril frio a cada poço para evitar a umgarose sequem. Os clipes de imagens podem ser armazenadas durante várias horas em PBS.
- Para levar a cabo a separação de pele delicada embrionário e de manipular o tecido dissecado utilizar o 'método vara cabelo ", tal como descrito em Kashiwagi et al. 3 Em vez de usar um pauzinho um kebab espeto de bambu podem ser usadas. Faça um pequeno corte na extremidade plana do espeto usando uma única lâmina de barbear afiada e inserir uma escova de dentes de cerdas macias. Apare o espeto de modo que é de aproximadamente 15 cm de comprimento.
- Usar um microscópio confocal com uma câmara ambiental completo ou fase superior da câmara fornecer 5% de CO 2 no ar. Pré-aquecer o estágio de microscópio de 37 ° C durante pelo menos 1 hora antes da imagiologia. Isso ajuda a impedir a dispersão da amostra causada pela expansão dos componentes do estágio como eles se aquecer.
- Preparar um conjunto multi-posição usando o software de controle do microscópio para que se possa rapidamente e facilmente centralizar no meio de cada cultura para criar uma experimentaçãot.
2. Procedimento
- Companheiro os ratos e designar o primeiro dia pós coitum como o dia E0.5. No dia E14.5, abater a fêmea por deslocamento cervical e expor a cavidade do corpo através de uma pequena incisão na linha média, separando a pele na direcção da cabeça e cauda e, em seguida, o corte do peritoneu subjacente e repicante volta para qualquer um dos lados do corpo. Dissecar o útero em frio PBS estéril, segurando firmemente com uma pinça e cortando ao longo da mesométrio usando uma tesoura cirúrgica. Manter o útero no gelo até ser necessária. Para uma descrição detalhada ver Shea et al. (2007) 15.
- Dissecar de embriões no útero, em primeiro lugar o corte do comprimento da parede uterina com tesouras cirúrgicas para libertar a decídua e dissecando os embriões do decidua por separá-las com os dois pares de pinças finos. Tela para a expressão repórter fluorescente (se necessário).
- Cull embriões por decapitação antes da dissecção. Subsequently retirar a cauda e membros posteriores e depois os membros anteriores usando uma única lâmina de barbear gumes. Reter tecido para genotipagem, se necessário.
- Faça uma incisão na ventrum perto da linha média em uma direção rostro-caudal. Usando as varas do cabelo descritos na etapa 1.6, cuidadosamente provocar longe da pele a partir do tecido conjuntivo subjacente rodar o embrião ao mesmo tempo. Não remova a pele completamente, mas sim deixá-lo ligado ao longo da borda mais distante ventral da primeira incisão.
- É importante não deixar que a pele se tornar asneira, pois é então muito difícil de montar. Para evitar isso, alisar a pele usando os paus de cabelo (lado dérmico para cima) sobre a superfície de uma placa de Petri, seco e, em seguida, cortado a partir do tronco de embriões utilizando uma única lâmina de barbear afiada. O lado dérmico pode ser distinguido do lado epidérmico por observação cuidadosa da junção entre o tecido dissecado e o embrião, antes que a pele é retirada. A área de tecido é dissecadocerca de 0,5 mm 2 quando dissecando o embrião E14.5.
- Coloque um grampo de imagem em cima da pele, de modo que a agarose é tocar o lado dérmico do tecido. Deixar em repouso durante 60 segundos e, em seguida, cuidadosamente provocar as bordas do tecido acima dos lados do clipe. Inverter o grampo e usar o cabelo varas para alisar a pele e remover quaisquer bolhas de ar, tendo o cuidado de tocar a superfície do tecido (na zona que vai ser trabalhada) tão pouco quanto possível.
- Use fio de sutura de seda para amarrar a pele para o clipe de imagiologia utilizando dois nós do polegar simples em qualquer um dos lados do clipe de imagem de modo que apertar e retirar a pele para dentro da ranhura estreita para a parte superior do grampo. Inverta o clipe, empurre para dentro a inserção de imagens e coloque na base. Encha a inserção com ~ 5 ml de meio de cultura (veja o passo 1.2). Figura 1 apresenta a montagem da câmara de imagem.
- Repita Protocolo para os restantes 5 amostras.
3. ViverImagem
- A câmara de imagem tem as mesmas dimensões que uma placa de 6 poços padrão. Use uma placa de inserção apropriado para montar a câmara na fase do microscópio confocal.
- Uma fase automatizada é necessária para a imagem das culturas em paralelo. Definir as seis posições de imagem no software confocal. As definições exactas irão depender da capacidade do microscópio utilizado. Tipicamente, uma pequena pilha z-(3-5 z-posições para ter em conta qualquer variação fase) é usado em cada uma das seis posições e uma pilha z é capturado a cada 2 min durante 18-24 h. Para aplicações de live-imagem geralmente é vantajoso usar uma definição mais ampla do que pinhole opticamente ideal para reduzir a potência do laser e do número de z-seções necessárias.
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Representative Results
A Figura 2 mostra resultados representativos de um experimento de lapso de tempo usando pele embrionária de Tyr :: CREB x embriões R26YFPR em E14.5. 6 culturas de pele embrionários foram fotografadas por microscopia confocal a cada 2 min durante 18 horas. O pacote ImageJ software de análise de imagem gratuito foi usado para analisar o comportamento dos melanoblastos YFP-rotulados nos 6 filmes. Os melanoblastos foram automaticamente rastreados usando o plugin wrMTrck desenvolvido por Jesper Søndergaard Pedersen ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) os resultados de rastreamento são exibidos na Figura 2. Filmes 1-3 são representativos da experiência e correspondem aos painéis A e G. Eles mostram a luz transmitida, YFP e vistas compostas respectivamente. A população melanoblasto migração é extraordinariamente ativa. Células-se quase constantemente e apenas fazer uma pausa quando eles estão prestes a dividir por mitose. Também é possível observar o desenvolvimento do folículo de cabelo padrão primário durante o período de cultura no canal de luz transmitida (Figuras 3A-3X e Filme 1).
.. Figura 1 Equipamentos e configuração R: A base da câmara de imagens ao vivo é composto por uma caixa transparente de acrílico com dimensões externas idênticas a um 6-bem placa de cultura. Ele contém seis furos em que os seis conjuntos individuais câmara podem Slot B:. Cada inserção é composto por 4 componentes; um clipe de imagem, uma inserção de imagem, uma membrana palerma, e um anel-O. O clipe ea inserção são torneados a partir de acetil plástico preto, encontramos o de ter o menor autofluorescência dos plásticos testados. O anel de vedação é feito de um PVCd é usado para prender a membrana lummox para o fundo do inserto que formam a interface de ar líquido (ALI). O clipe de imagem (acetil preto) tem vários furos para permitir a circulação de um meio de cultura C:. O eixo central do clipe é preenchido com agarose a 1% antes da utilização para proporcionar uma superfície plana sobre a qual a empresa de montagem na pele. A pele está ligado ao grampo de fio de sutura antes de ser empurrado para dentro do inserto, intercalando a pele entre a agarose e membrana lummox. A pastilha é então preenchido com meio de cultura D:. Para dissecar e manipular a pele embrionária uma única escova de dentes de cerdas é montado em uma fenda na extremidade plana de um kebab espeto de bambu. Um par de varas do cabelo pode ser usado em combinação com uma pinça fina para dissecar pele embrionário e de montagem na câmara de imagem de E:.. Fotografias dos componentes descritos em CA favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resultados representativos de seis filmes gravados em paralelo. AF: acompanhamento dos resultados a partir dos 6 filmes gravados em paralelo para demonstrar as capacidades do sistema. Cada filme foi registada nos pontos de tempo de 2 min durante um total de 18 h (ver filmes de 1-3 para o filme correspondente dos painéis A e G). As posições das células em um frame do filme são mostrados e os resultados de rastreamento são sobrepostos em cima GL:. Resumo dos resultados de rastreamento plotados como zerado rastreamento de dados.
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Figura 3 Imagens representativas de filmes de lapso de tempo de desenvolvimento do folículo piloso e de melanoblasto sofrer mitose AX:.. Selecionado, cortada quadros de filme 1 folículos pilosos primários tornam-se visíveis ao longo do período de cultura da pele 0-18 horas.. Uma LUT foi aplicado às imagens A'-X. ': Selecionados, cortada quadros de Filme 2 Imagens representativas de melanoblastos migram na epiderme em desenvolvimento e uma célula individual (ver seta em uma.') Passando por mitose (seta em T ') . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: resultado Representante do canal de luz transmitida a partir de 18 horas de time-lapse experimento. </ Strong> O padrão de cabelo folículo primário, embora não seja evidente no início do filme, se torna mais proeminente como a cultura progride.
Filme 2: . resultado Representante do canal YFP de um jovem de 18 hr time-lapse experimento A população melanoblasto é uma população altamente dinâmico e migratória. Células estacionárias Raros são normalmente submetidos a mitose (ver Figura 3).
Filme 3: . resultado representativas do canal a partir de um composto 18-hr lapso de tempo de experiência A população melanoblasto pode ser visto a migrar dentro da epiderme em desenvolvimento e interagir com os folículos capilares em desenvolvimento.
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Discussion
Nós descrevemos um método para a cultura da pele embrionária que é particularidade passíveis de imagem de células vivas para a microscopia confocal invertidos. O método inclui os melhoramentos recentes que permitem seis culturas a ser trabalhada em paralelo e elimina a dependência de matrigel e membranas Nuclepore do método original 6. A diferença fundamental técnica a partir de técnicas similares é a utilização de uma membrana permeável ao gás lummox para estabelecer uma interface líquido de ar e também para actuar como uma lamela. Temos mantido com sucesso as culturas com imagem confocal contínua por até 48 horas. A alta resolução e excelente relação sinal-ruído das imagens confocal permite o rastreamento de células automatizado para analisar o comportamento melanoblasto nos filmes de lapso de tempo resultantes.
Usando esta técnica, é possível investigar a dinâmica de dispersão melanoblasto e estudar sua interação com a epiderme e folículos pilosos em desenvolvimento. A rua críticoeps no protocolo estão a realizar uma dissecção cuidadosa que não danifica a epiderme em desenvolvimento e para montar o lado dérmico amostras de pele contra a agarose, sem dobras ou alongamentos. O procedimento descrito neste artigo funciona melhor entre E13.5 e E15.5. Antes E13.5 a pele é muito frágil e depois E15.5 é relativamente espessa e difícil de penetrar por meio de microscopia confocal. As capacidades do sistema de microscópio utilizado também são muito importantes. Normalmente usamos um microscópio confocal Nikon A1R equipado com o sistema da Nikon proprietário perfeito foco (PFS). Usando PFS reduz significativamente o número de filmes ruins causadas pela fase deriva, sistemas similares estão disponíveis para outras plataformas.
Uma desvantagem desta técnica é a necessidade de equipamento especializado cultura. No entanto, o design é simples ea câmara pode ser facilmente montado por qualquer pequena oficina técnica. Em resumo, apresentamos um método simples que deve ser de grande utilidade para studies do desenvolvimento embrionário pele e comportamento melanoblasto. Prevê-se que a técnica também pode ser modificado para outros cenários onde uma interface ar-líquido é um requisito para a cultura bem sucedida.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado pelo financiamento de base do Conselho de Investigação Médica. Somos gratos a Craig Nicol para preparar desenhos técnicos. Somos gratos a Matthew Pearson e Paul Perry por seu apoio de imagem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
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