Summary
Espectroscopia de decomposição induzida por laser realizada em órgão fina e tecido do tumor detectado com sucesso elementos naturais e gadolínio injetado artificialmente (Gd), emitidos a partir de nanopartículas à base de Gd. Imagens de elementos químicos atingiu uma resolução de 100 um e sensibilidade quantitativa sub-mM. A compatibilidade da instalação com microscopia óptica padrão enfatiza seu potencial para fornecer várias imagens de um mesmo tecido biológico.
Abstract
A espectroscopia de emissão de plasma induzido por laser foi aplicado para a análise elementar de amostras biológicas. Espectroscopia de desagregação induzida por laser (LIBS) realizada em secções finas de tecido de roedor: rins e do tumor, permite a detecção de elementos inorgânicos, tais como (i) de Na, Ca, Cu, Mg, P, e Fe, presente naturalmente no corpo e (ii) Si e D'us, detectada após a injeção de nanopartículas à base de gadolínio. Os animais foram sacrificados 1 a 24 horas após a injecção intravenosa de partículas. Um varrimento bidimensional da amostra, realizada por meio de um micrométrica 3D-platina motorizada, permitiu que o feixe de laser de infravermelho a explorar a superfície com uma resolução lateral inferior a 100 μ m. Imagens química quantitativa de elemento Gd dentro do órgão foram obtidos com sensibilidade sub-mM. LIBS oferece um método simples e robusto para estudar a distribuição de materiais inorgânicos sem qualquer labeli específicong. Além disso, a compatibilidade da instalação com microscopia óptica padrão enfatiza seu potencial para fornecer várias imagens do mesmo tecido biológico com diferentes tipos de resposta: elementares, moleculares ou celulares.
Introduction
O grande desenvolvimento de nanopartículas para aplicações biológicas incitou a melhoria paralela de técnicas analíticas para a sua quantificação e formação de imagens de amostras biológicas. Normalmente, a detecção e o mapeamento das nanopartículas em órgãos são feitos por fluorescência ou microscopia confocal. Infelizmente, estes métodos requerem a rotulagem das nanopartículas por um corante do infravermelho próximo que pode alterar a biodistribuição das nanopartículas, em especial para as nanopartículas de muito pequenas, devido às suas propriedades hidrofóbicas. A detecção de nanopartículas rotulados, e especialmente as muito pequenas nanopartículas (tamanho <10 nm), pode, assim, interferir com a sua biodistribuição em toda a escala do corpo, mas também a nível de tecidos e células. O desenvolvimento de novos dispositivos capazes de detectar nanopartículas sem qualquer rotulagem oferece novas possibilidades para o estudo do seu comportamento e cinética. Além disso, o papel de elementos vestigiais tais como ferro e cobre em doenças cérebro umd doenças neurodegenerativas, como Alzheimer 1, Menkes 2,3, ou Wilson 4 sugerem o interesse de estudar e localizar esses elementos em tecidos.
Várias técnicas têm sido utilizadas para fornecer mapeamento elementar ou microanálise de materiais diferentes. Em seu artigo de revisão publicado em 2006, R. lobinski et al. Forneceu uma visão geral das técnicas padrão disponíveis para microanálise elementar em meio biológico, um dos ambientes mais desafiadores para as ciências analíticas 5. A microssonda de electrões, que é constituído por energia dispersiva de microanálise de raios X de um microscópio electrónico de transmissão, pode ser aplicado a numerosos estudos se a concentração do elemento é suficiente (> 100-1.000 mg / g). Para alcançar limites de detecção mais baixos, foram utilizadas as seguintes técnicas:
- microssonda feixe de íons através das partículas induzida emissão de raios X μ-PIXE (1-10 mg / g) 6
- synchrotron microanálise radiação μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- espectrometria de massa de iões secundários SIMS (0,1 ug / g) 8
- ablação a laser em espectrometria de massas LA-ICP-MS (até 0,01 mg / g) 9,10
As técnicas acima mencionadas proporcionam resolução micrométrica, como mostrado na Tabela 1 extraiu-se a partir de lobinski et al.
Reconstrução 3D de investigações 2D de série também pode ser proposto para a reconstrução de tecidos mais profundos 11. No entanto, todos os dispositivos e sistemas exigem profissionais qualificados, ambos moderados para equipamentos de alto custo e experimentos de longa duração (normalmente mais de 4 h para um mM 100 x 100 mm para μ-SXRF de 10 mm x 10 mm para LA-ICP-MS ) 12. Em conjunto, esses requisitos tornam microanálise elementar muito restritivo e incompatível com sistemas de imagem óptica convencional,A microscopia de fluorescência ou microscopia não linear. Um outro ponto que se pode mencionar aqui é que a capacidade de medição quantitativa ainda é bastante limitada e depende da disponibilidade dos padrões laboratoriais de correspondência de matriz. Quanto mais generalização do uso de microanálise elementar em processos da indústria, geologia, biologia e outros domínios de aplicações irá gerar avanços conceituais e tecnológicos significativos.
O objectivo da presente manuscrito é propor soluções para mapeamento elementar quantitativa (ou microanálise elementar) em tecidos biológicos com uma instrumentação mesa compatível com microscopia óptica convencional. A nossa abordagem é baseada na espectroscopia de decomposição induzida por laser (tecnologia LIBS). Em LIBS, um pulso de laser é focado na amostra de interesse para criar a composição e centelha do material. A radiação emitida atómica no plasma é subsequentemente analisados por um espectrómetro e os elemenTal concentração pode ser recuperada com medidas de calibração realizados previamente 13,14. As vantagens de LIBS incluem sensibilidade (mg / g para quase todos os elementos), compacidade, preparação muito básico amostra, ausência de contato com a amostra, a resposta instantânea e precisamente localizada (micro) análise de superfície. No entanto, a aplicação da imagem química de tecido permanece um desafio uma vez que a ablação a laser dos tecidos devem ser finamente controlado para realizar mapas com uma elevada resolução espacial, juntamente com o intervalo de sensibilidade em ug / g 15,16.
Com esta solução, a adjunção de marcadores ou agentes de rotulagem não é necessário, o que permite a detecção de elementos inorgânicos directamente no seu ambiente nativo em tecidos biológicos. O instrumento LIBS desenvolvido em nosso laboratório oferece uma resolução atual inferior a 100 mm, com uma sensibilidade estimada para Gd abaixo de 35 mg / g, o equivalente a 0,1 mM 16, que permite queo mapeamento de grandes amostras (> 1 cm 2) dentro de 30 min. Além disso, o software caseiro facilita a aquisição e exploração dos dados. Este instrumento é usado para detectar, mapear e quantificar a distribuição de tecido de gadolínio de nanopartículas à base de (Gd), 17 - 18, em rins e amostras de tumor de animais de pequeno porte, de 1 a 24 horas após a injecção intravenosa das partículas (tamanho <5 nm) . Elementos inorgânicos, que são intrinsecamente contidos em um tecido biológico, tais como Fe, Ca, Na e P, foram também detectadas e gravadas.
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Protocol
1. Biológica Preparação de Amostras
Todos os experimentos descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê do CECCAPP (Lyon, França) (autorização # LYONSUD_2012_004) Animal Care e Use, e os experimentos foram realizados sob a supervisão de pessoas autorizadas (L. Sancey, DDPP autorização # 38 05 32).
- Adicionar 1 ml de H 2 O para 100 umol de nanopartículas à base de gadolínio (Gd), aguardar 15 minutos e adicionar 20 ul de HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, CaCl2 20 mM para 100 ul de H2O e 80 ul da solução primária de nanopartículas à base de Gd para obter uma solução de 200 mL em 40 mM prontos para injetar (Cidade: Villeurbanne, em laboratório).
- Injectar a solução de nanopartículas de Gd 200 mL por via intravenosa em roedores portadores de tumor anestesiados (Cidade: Lyon Sud (Oullins), a 15 km do laboratório).
- 1-24 horas após a injeção, sacrificar os ratos umad colocar as amostras biológicas em isopentano resfriado por nitrogênio líquido. Conservar as amostras a - 80 ° C (Cidade: Lyon Sud (Oullins), a 15 km do laboratório).
- Corte da amostra (Cidade: geralmente Grenoble, a 100 km do laboratório, vou tentar ter um acesso em Lyon Sud) em 100 slides m de espessura e colocar os slides biológicos em pratos de plástico específicos (Petri). Armazenar a -80 ° C.
Nota: pratos de plástico são, basicamente, uma amostra de polímero muito puro. Eles são utilizados para evitar a interferência com os elementos contidos no tecido.
2. Preparação de Amostras para Calibração
- Prepare frascos com doses crescentes de nanopartículas à base de Gd em água (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 pM, 5 pM, 10 pM, 50 uM, 100 uM, 500 pM, 1 mM e 5 mM).
- Coloque um pi-gota de cada solução espaçados regularmente por 3 mm em placas de Petri 5.
- Seca à temperatura ambiente durante 20 min.
3. LIBS Experiment
- Inicialização da Configuração LIBS
- Configurações de laser. Depois de ligar os instrumentos, esperar 10-20 min para pulso estabilização energia do laser e resfriamento da câmera ICCD até -20 ° C. Ajuste a energia de pulso com o atenuador.
Nota: Os parâmetros do laser ideais para tecidos de mapeamento são 5 ns duração de pulso, 1.064 nm de comprimento de onda e energia de pulso de cerca de 4 mJ. O laser usa é um típico Nd: YAG nanossegundo. - LIBS Configurações. Definir a posição do laser de focagem (em relação à superfície da amostra) para se obter o diâmetro da cratera menor (cerca de 50 um ou inferior).
Nota: Isto corresponde a um impulso de laser de focalização 100 um abaixo da superfície da amostra. - Configurações espectrômetro. Use o espectrômetro de Czerny-Turner combinado com um 1200 linhas / mm grade e uma câmera de resolução ICCD temporais alta. Controlar todos esses dispositivos por computador. Defina o valor de fenda de entrada para 40 mM. Defina a faixa espectral reGarding o elemento a ser analisado. Utilizar a faixa espectral abrangendo 325-355 nm para a detecção Gd com elevada sensibilidade, bem como Na, Ca e Cu. Defina os parâmetros ICCD com um atraso de 300 ns, um portão de 2 ms, e um ganho de 200.
- Configurações de laser. Depois de ligar os instrumentos, esperar 10-20 min para pulso estabilização energia do laser e resfriamento da câmera ICCD até -20 ° C. Ajuste a energia de pulso com o atenuador.
- Medição Mapping
- Colocar a amostra biológica em porta-amostras de LIBS motorizados.
- Ajuste a altura da amostra de acordo com a posição do foco do laser.
- Tire uma foto de alta resolução da fatia da amostra.
- Coloque o módulo de mapeamento do software de aquisição de LIBS para realizar um mapa com tipicamente 100 x 100 pontos de medição espaçados por uma resolução de cerca de 100 mm.
- Comece a aquisição. A partir deste ponto de automatizar tudo; o movimento seqüência, bem como a gravação de espectro e poupança. 40 minutos são necessários para um mapeamento de 10.000 pontos (equivalente a 1 cm2 por resolução de 100 um). Reagrupar todos os espectros registrados em um mesmo arquivo.
- Quando finished, dê uma segunda fotografia da fatia de amostra
- Medição Calibração
Com os mesmos parâmetros experimentais, medir as amostras de calibração (para detalhes de preparação, ver secção 2). Executar um mapa ou ficha 25 espectros (obtido a partir de locais de medição na parte do centro da gota) em cada uma das gotas de calibração.
4 LIBS Análise de Espectro:. Construção de Química Images
- Grave todos os espectros LIBS a partir do mapeamento de tecidos e carregá-los na análise de software LIBS. Subtraia a linha de base para cada espectro e construir as imagens químicas com escala de intensidade relativa usando uma cor falsa.
Nota: Um algoritmo recupera intensidades de linhas específicas, como D'us, Cu, Na, ou Ca. - Realizar a mesma operação no espectro medido a partir da amostra de calibração para permitir o cálculo das curvas de calibração (relação entre a intensidade e a concentração) e de construção aqmapa quantitativas ou imagem para D'us (ou outro elemento de interesse).
- Aplicar os tratamentos adequados para as imagens de produtos químicos, tais como a interpolação ou de alisamento. Salve os mapas de intensidade ou concentração em formato de imagem (bitmap).
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Representative Results
Como mostrado na Figura 1, o feixe de um laser Nd: YAG do comprimento de onda fundamental de 1,064 nm foi focado verticalmente para baixo sobre a fatia de tecido através de uma lente de quartzo de 50 mm de distância focal. A energia de pulso foi de 4 mJ e taxa de repetição de 10 Hz. A fim de evitar a geração de plasma no ar, o feixe de laser foi centrada em torno de 100 mm abaixo da superfície da amostra. No plasma do ar foi observada nesta condição. Durante as experiências, a amostra foi movido por um motor passo a passo, a fim de gerar um plasma em apenas uma posição sobre a amostra (tiro individual). A observação microscópica das crateras gerados no substrato mostrou uma cratera diâmetro inferior a 50 um. O plasma gerado foi trabalhada por um par de lentes para a entrada de uma fibra óptica ligada na outra extremidade a um espectrógrafo Czerny-sintonizador equipado com uma grelha de 1200 linhas por mm (rematar a 300 nm). Uma câmara ICCD foi montado sobre o plano focal de saída do espectrógrafopara registar o espectro. Durante as medições, a altura da superfície da amostra (no que diz respeito à posição do foco do laser) é monitorizado utilizando o método trigonométrico com um feixe incidente obliquamente a partir de uma baixa potência cw diodo de laser na superfície da amostra e uma câmara CCD do monitor. O ICCD foi desencadeada pela Q-interruptor do laser e os 400 ns e 2 ms foram criados, respectivamente, para os parâmetros de atraso e portão. Durante um mapeamento, a amostra foi deslocado por um deslocamento de 100 mm depois de cada tiro de laser. Um espectro foi gravado para cada tiro laser. Software caseiro desenvolvido em LabVIEW o ambiente controlado a totalidade do equipamento e deixou-se realizar sequência automatizada para examinar a área de interesse da amostra de tecido com resolução lateral específica.
Exemplo de espectros de tiro único, registada em diferentes regiões de tecido renal após uma injecção IV de nanopartículas à base de Gd é mostrado na Figura 2. As nanopartículas foram sintetizados como described em Mignot et al 17. Resumidamente, as nanopartículas são compostas de uma matriz de polissiloxano, segurando DOTAGA-Gd 3 + quelatos na sua superfície. Eles são desenvolvidos para (i) de imagem multi-modal de como eles podem ser utilizados em MRI, imagiologia nuclear e imagiologia por fluorescência, separadamente ou simultaneamente, e (ii) a função terapêutica como radiossensibilizador (isto é, aumentando localmente a eficiência da radioterapia) 18. A faixa espectral utilizada (286-320 nm) permite detectar elementos diferentes, como Gd, Ca, Fe, Si e Al. O espectro azul foi registada na região central do rim (a medula), o espectro vermelho correspondia à membrana do rim (cápsula) e o espectro de verde para a zona periférica (córtex). É também de salientar que os GD, Si, Al, Ca, Fe e intensidades são amplamente variável em diferentes regiões, o que sugere uma grande heterogeneidade dessas concentrações elementos dentro do tecido. Basicamente D'us e Si foram contendo no Gd-base ded nanopartículas, Fe era específica para os vasos sanguíneos, Ca da própria amostra biológica.
As amostras de tecido foram analisadas fatia ponto por ponto, movendo-se a amostra na posição X e Y. Resolução lateral estava perto de 100 mm. Um espectro single foi gravado para cada posição (medição de tiro). Intensidades de linhas foram extraídos a partir dos espectros utilizando uma subtracção do fundo. As imagens químicos foram então construídas a partir das intensidades. Um exemplo é mostrado na Figura 3 para o Gd, Si e Fe. As linhas utilizadas para construir estas imagens químicos são mostrados na Tabela 2. A análise foi correlacionada com a fotografia colorida de a amostra biológica antes do ensaio para melhorar a localização e o mapeamento dos diferentes elementos. No rim, os sinais de Gd e de Si foram co-localizados, mas esta co-localização não se encaixa com a distribuição do Fe, indicando uma distribuição específica.
Similar resultados foram obtidos com as amostras de tumor. Um exemplo de medição sobre o tecido tumoral SQ20B é mostrado na Figura 4. Neste caso, o mapa química de Gd, mostrados com uma escala de cores falsas, foi sobreposta à imagem de luz natural. Para esta medição, análise quantitativa foi realizada para recuperar a concentração de gadolínio local (consulte o procedimento na seção de protocolo). Para esta experiência, as nanopartículas foram administradas directamente no tumor, o qual foi removido 1 hora depois da injecção e cortado para a análise. Como pode ser visto na Figura 4, as partículas difusas no tecido a partir do ponto de injecção, no centro do tumor para a periferia. 1 hora depois da injecção, cerca de metade do volume do tumor continha algumas partículas. Esse mapeamento pode ajudar a fornecer informações sobre o protocolo terapêutico. Para uma eficácia óptima do tratamento, as nanopartículas deve difundir dentro de todo o tumor; depois de 1 hora, só half do tumor continha algumas partículas, o que sugere que um tempo mais longo de difusão seria necessária para uma difusão óptima e, portanto, um tratamento eficaz.
Tabela 1. Principal espacialmente resolvido técnicas analíticas para a imagem latente elementar química. (Lobinski et al. 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Apresentação Figura 1. Esquemática da instalação experimental LIBS utilizada. (15 Lema-Ros et al.).
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Figura 2. LIBS espectros de disparo único obtido em três regiões diferentes do tecido renal. Estas regiões são a medula (parte central do rim), a cápsula de vermelho e o córtex no verde. Spectra foram deslocados verticalmente para maior clareza.
Figura 3. LIBS mapeamento elementar de D'us, Si e Fe em uma fatia de rato renal preparados de acordo com as condições especificadas no texto. A intensidade escala de imagens químicas é expressa em uma unidade arbitrária. Uma fotografia de luz natural, também é mostrado na parte superior esquerda da figura.
Tabela 2. Linhas espectrais utilizados para a detecção de Gd, Si e Fe no rim do rato (linhas atómicos estão marcados I e linhas iónicos são rotulados II).
Figura 4. LIBS mapeamento quantitativo de D'us dentro de um pedaço de tecido do tumor. A escala de cores falsas vai de 0,1 mm (verde) a 20 mM (violeta).
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Discussion
Aplicado a amostra biológica, a técnica permite a imagem química, isto é, o mapeamento e quantificação, de Gd e Si a partir de nanopartículas à base de Gd injectados em diferentes órgãos. A partir das configurações principais críticos, o controlo das propriedades de laser (comprimento de onda, a energia do pulso, centradas, e de estabilidade) é crítico para uma ablação de tecido preciso e fino (ou seja, uma resolução de mapeamento), bem como para a sensibilidade. Trabalhando em alta energia fornece uma sensibilidade melhor, mas, infelizmente, gera resolução espacial degradada. Além disso, o tipo de espectrômetro utilizada deve ser verificada com cuidado. Basicamente, uma investigação de banda larga (por exemplo, usando um espectrômetro echelle), vai permitir uma grande variedade de espécies elementares, mas com baixa sensibilidade, utilizando um espectrômetro de Czerny-Turner (equipado com um ICCD ou PMT) permitirá detectar menos elementos, mas com muito mais sensibilidade. Todas as definições escolhidas da gama de comprimentos de onda sondados devem ser ajustados ao pINALIDADE da investigação.
No que respeita à própria amostra biológica, da sua espessura e dureza também pode interferir com a qualidade do espectro. Uma amostra muito fina seriam totalmente pulverizado e o suporte de amostra seria atacada também pela tiro laser, ao passo que uma amostra muito espessa pode sofrer de sua in-homogeneidade da sua constituição que será repercutido no in-homogeneidade da quantidade de pulverizado matéria (presença de navios de grande porte etc.) A partir do estudo elementar, a escolha do suporte pode ser previsto; por exemplo, se o elemento analisado é de Si, a amostra deve ser depositado em plástico puro mas o vidro deve ser evitado, uma vez que contém grandes quantidades de silício. Da mesma forma, a amostra pode ser preparado e fixados em condições específicas para evitar qualquer componente do fixador para contaminar o nível do elemento estudado.
Esta técnica pode ser muito útil para a análise de amostras pré-clínicos. LIBS could permitir a detecção de elementos metálicos anormais, tais como Fe e Cu, em particular em amostras de cérebro. Uma limitação particular com Fe deve ser o alto teor de Fe da hemoglobina; amostra, preparada com cuidado e avaliação de um ensaio de calibração é obrigatória. No campo da biotecnologia aplicada à biologia ou medicina, LIBS pode permitir a detecção de qualquer composto ou partícula que contém um elemento específico, tais como Au, Gd, Cu, etc
A instrumentação de bancada é totalmente compatível com o padrão de microscopia óptica, o que mostra o seu grande potencial de uso em Biologia e Medicina como uma ferramenta para a observação complementar de elementos metálicos de rastreio. Este tipo de imagem elementar, combinando resolução lateral elevada (<50 mm), com baixos limites de detecção (na gama de mg / kg), envolve geralmente elevado nível de equipamento exigido, tal como microanálise radiação sincrotrão (SXRF) ou ablação a laser acoplado indutivamente spectro massatria (LA-ICP-MS), tornando-se muito restritivas e incompatíveis com sistemas de imagens microscópicas disponíveis no mercado. A instrumentação LIBS não é muito caro, dependendo da resolução e sensibilidade necessária (preço entre 100 e 200 k €). Actualmente de 1 cm 2 da amostra poderiam ser analisadas dentro de 30-40 minutos; este tempo de aquisição não pode mudar, após a adição de outras técnicas microscópicas, tais como detecção de fluorescência e de imagem de cor da amostra. A corrente de resolução espacial de 100 um já mostra a eficácia para o mapeamento de tecidos biológicos. No entanto, esta resolução pode ser significativamente melhorada usando um microscópio óptico em vez de uma simples lente para focar o pulso de laser de ablação. Resolução Micrometer pode teoricamente ser alcançado, embora a sensibilidade vai cair, como menos material será feita a ablação. O aumento da resolução de 10 um permitiria uma localização exacta de nanopartículas de ser observado ao nível da célula.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio financeiro do Labex-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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