Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fremstilling af primær Myogenic precursorcelle / myoblast kulturer fra Basal hvirveldyr afstamninger

Published: April 30, 2014 doi: 10.3791/51354
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

Summary

In vitro kultur systemer har vist sig uundværlig for vores forståelse af hvirveldyr myogenese. Dog stadig meget at lære om nonmammalian skeletmuskulatur udvikling og vækst, især i basal taxa. En effektiv og robust protokol for at isolere voksne stamceller i dette væv, de myogene præcursorceller (MPL), og opretholdelse af deres selv-fornyelse, proliferation og differentiering i en primær kultur indstilling giver mulighed for at identificere bevarede og divergerende reguleringsmekanismer hele slægter hvirveldyr.

Abstract

På grund af den iboende vanskelighed og tid, der med at studere den myogene program in vivo dyrkningssystemer primære afledt fra de bosiddende voksne stamceller skeletmuskulatur, de myogene præcursorceller (MPCs), har vist sig uundværlig for vores forståelse af pattedyr skeletmuskulatur udvikling og vækst. Især blandt den basale systematiske enheder af Hvirveldyr dog data er begrænsede, der beskriver de molekylære mekanismer, der styrer den selv-fornyelse, proliferation og differentiering af Middelhavspartnerlandene. Af særlig interesse er potentielle mekanismer der ligger til grund evne basal hvirveldyr at gennemgå betydelig postlarval skelet myofiber hyperplasi (dvs. benfisk) og fuldt regeneration efter vedhæng tab (dvs. halepadder padder). Derudover kan anvendelsen af ​​dyrkede myoblaster støtte i forståelsen af ​​regenerering og reprisen af ​​myogenic program og forskellene mellem dem. Tildette formål har vi beskriver i detaljer, en robust og effektiv protokol (og variationer deri) til isolering og vedligeholdelse af Middelhavspartnerlandene og deres afkom, myoblaster og umodne myorør i cellekultur som en platform for at forstå udviklingen af ​​myogenic program, begyndende med mere basale hvirveldyr. Udnytte modelorganismen status zebrafisk (Danio rerio), rapporterer vi om anvendelsen af denne protokol til små fisk af karpefisk clade Danioninae. I tandem, kan denne protokol udnyttes til at realisere en bredere komparativ tilgang ved at isolere Middelhavspartnerlandene fra den mexicanske Axolotl (Ambystomamexicanum) og endda gnavere. Denne protokol er nu almindeligt anvendt i at studere myogenese i flere fiskearter, herunder regnbueørred, laks, og guldbrasen 1-4.

Introduction

Betydelig forståelse af pattedyr myogenese er opnået gennem sammenfatning af denne proces i både primær mus (Mus musculus) myoblast kulturer og velbeskrevet muse-cellelinie, C2C12 5.. Begyndende i 1950'erne 6, har disse kulturer ført til megen fremgang i forståelsen af murinemyogenic program og i forlængelse heraf myogenese i andre hvirveldyr. Derudover har encellede myofiber eksplantation teknikker steget ud forståelse af samspillet mellem satellit celler og omkringliggende myofibre 7-9. Cellekulturer særligt attraktivt for undersøgelser af myogenese grund af den korte tid fra forløber for differentieret celle 10, relativt lette transfektion for RNAi 11-14 transgene 15,16 og overekspression undersøgelser 14,17,18 in vitro ekspansion efterfulgt af in vivo-transplantation 18-20, og endda compArison af myogene prækursorceller og deres regulerende agenter over taxa 21,22. Mens forskelle på grund af den kunstige miljø af kulturen systemet er blevet beskrevet 5,23, har disse in vitro systemer vist sig at være uundværlig for vores dissektion af de indviklede program regulerer dannelsen af flercellede, terminalt differentieret myofibersfrom mononukleære proliferative stamceller kendt som myosatellite celler (MSC) blandt pattedyr.

Uden for klassen Mammalia dog bevarelse og / eller divergens af mekanismer, der styrer myogenese er dårligt forstået, hovedsagelig på grund af vanskeligheden ved dyrkning myogene prækursorceller (MPCs) og myoblaster fra forskellige taxa. Faktisk har primære myoblast kulturer kun blevet beskrevet i tre fugle 24-26, et krybdyr 27, et par padder 28-30, og nogle fisk 1,3,4,31-33. Kontinuerlig myogene cellelinjer fra veandre end gnavere 34-36 rtebrates er endnu mere sjældent, med den eneste ikke-pattedyr myogene cellelinie er afledt af japansk vagtel (Cortunix japonica), QM7 37. Trods mange forsøg på immortalisering, en teleost myogenic cellelinie fortsat undvigende og en protokol til effektiv transfektion af disse celler blev først offentliggjort i år 15. Således er klare og godt optimeret protokoller for dyrkning af primære Middelhavspartnerlandene og myoblaster fra en række af hvirveldyr meget nødvendig for at ikke blot yderligere udvide vores viden om udviklingen af ​​myogenic program, men at ansætte magt sammenlignende fysiologi at gøre gennembrud i behandling af humane skeletmuskel sygdomme og lidelser.

Mens litteraturen indeholder mange rapporter om MPC / myoblast isolation 38-49, er det almindeligt for forfattere til at beskrive protokoller for sådanne isolationer i korte, ofte ufuldstændige, formater. Endvidere er de mest lærerige protokoller reported er udviklet til mus 50-53, og nogle af disse er afhængige af Antibody Selection 54,55 eller fluorescens transgener 56,57, hvilket gør disse protokoller ubrugelige eller upraktiske inderste ikke-gnavere udnyttet af muskel biologer. Med lidt kendt om piscine, padder og krybdyr myogenese, en detaljeret og grundig protokol, der er beskrevet med audiovisuelle vejledning og med demonstreret effektivitet i fjernt beslægtede arter ville være mest nyttigt til feltet.

Først beskrevet af Powell og kolleger i 1989 58 blev følgende protokol oprindeligt udviklet til at isolere Middelhavspartnerlandene og myoblaster fra laksefisk fisk (nemlig regnbueørred, Oncorhynchus mykiss, og atlanterhavslaks, Salmo salar) og nogle større karpefisk (dvs. guldfisk, Carassiusauratusauratus) . I 2000 Fauconneau og Paboeuf optimeret en primær myoblast kultur for regnbueørred 59, og minoroptimizations made denne protokol anvendelige i flere mindre minnows af Danioninae clade (zebrafisk, Danio rerio, og kæmpe danio, Devario aequipinnatus) 32 på grund af de mange genetiske værktøjer til rådighed for zebrafisk arbejde og dermed dens nære slægtninge. Benfisk er attraktive organismer til undersøgelse på grund af deres afvigende vækststrategi (i hvert fald i de fleste arter). Store laksefisk, ligesom de fleste fisk, vokser tidsubegrænset, med vækstpotentiale uhindret af en asymptote ved udløb, selv i alderdommen 60-62. I modsætning til zebrafisk, store danionins såsom kæmpe danio 63 og moustached Danio display vækstpotentialer typiske for benfisk, hvilket gør deres direkte sammenstilling en ideel platform for forståelse om MPC celle skæbne valg spiller en rolle i skeletmuskulatur hyperplasi kontra hypertrofi.

Ligeledes har vi vist, at denne protokol kan bruges med mus og axolotls med relativt høje celle udbytte og viaBility indeks. Halepadder salamandre, såsom den mexicanske Axolotl (Ambystomamexicanum), besidder den bemærkelsesværdige evne til at regenerere væv, herunder hele lemmer og hale 64-66. Denne egenskab gør disse padder interessante modeller af skeletmuskelsvind og aldring. Anvendelse af protokollen beskrevet nedenfor, kan der foretages en lignende fremgangsmåde som man har gjort i mange fiskearter, der giver en endnu bredere komparativ kontekst for sådanne undersøgelser. Som mange virkelig sammenlignende biologer pris på, de mest meningsfulde fremskridt i grundlæggende biologi og translationel biomedicin kan foretages, når data analyseres inden det bredeste spektrum (her, hele hvirveldyr afstamning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Statement: Alle forsøg med hvirveldyr, der er beskrevet heri, blev godkendt på forhånd af Institutional Animal Care og brug Udvalg for University of Alabama i Birmingham og er i overensstemmelse med retningslinjer fastlagt af Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health i USA Institut for Sundhed og Human Services.

1.. Til kultur

  1. Forbered basismediet som følger: 9 mM NaHCO3 (1,51 g pr 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g pr 2 L) i DMEM (13,48 g / L; 26,96 g pr 2 L).
    1. Bestem pH og juster til 7,40 med HCl eller NaOH.
    2. Bestem osmolalitet og justeres til ~ 300 mOsm med NaCl (hvis nødvendigt).
    3. Filtersteriliser ved anvendelse af (2) 1 L vakuum sterilisering systemer og opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys i op til 2-3 måneder.
      BEMÆRK: Se tabel 1 og 2 for komplet reagens, værktøj, Forbrugerehjælpematerialer og udstyr information.
  2. Forbered poly-L-lysin-behandlede plader ved at opløse 5 mg af γ-bestrålede poly-L-lysin (> 300.000 MW) i 50 ml ultrarent sterilt vand. Bland forsigtigt ved inversion i 10 minutter ved stuetemperatur for at sikre fuld opløsning af lysin polymerer.
  3. Afpipetter den nødvendige mængde af poly-L-lysin opløsningen i hver brønd ifølge pladetypen (tabel 3). Lad pladerne stå i laminær strømning i 5 minutter.
  4. Dernæst fjerner poly-L-lysin-opløsning og vaskes to gange med sterilt vand. Lad pladerne lufttørre i laminar flow hætte i 20 minutter.
  5. Opnå 1 mg laminin (Engelbreth-Holm-Swarm oprindelse) og opløses i 50 ml af en base medium til en slutkoncentration på 20 ug / ml. Anvend laminin opløsning til poly-L-lysin-behandlede cellekultur plader ved 2 ug / cm 2. (Se tabel 3 for forskellige pladestørrelser)
  6. Bland forsigtigt opløsningen til at sikre full godt dækning. Seal plader med laboratorie tape og sted i kuvøse i 24 timer. Inkubatoren bør indstilles til passende temperatur for arter, der anvendes (se tabel 7), og ingen yderligere gasser skal tilføjes til inkubatoren.
    BEMÆRK: Laminin skal have lov til at holde sig til pladerne i 24 timer før såning celler. Undladelse af dette vil resultere i dårlig til ingen celleadhærens.
  7. Forbered medier som beskrevet i tabel 4. Komplet medier er bedst forberedt dag i brug.
  8. Som forberedelse til væv isolation, samle følgende elementer og autoklave: 300-500 ml bægerglas (s); glaspetriskåle; skalpel håndtag; pincet (fin og grov); dissektion saks; og flere ark vandafvisende autoklave papir.
    BEMÆRK: For hver person, der bistår med dissektion proces, (2) skalpel håndtag, (1) pincet (type, afhængigt af personlige præferencer), (1) dissektion saks og (5-10) ark vandafvisende autoklave papir ertilstrækkelige.
  9. Ud over de autoklaverede ovenstående punkter, samle 70% ethanol, og en vægtbalance sterile 50 ml koniske rør (antal afhænger af størrelsen af ​​kultur) og is.

2.. Tissue Dissektion

  1. Inden du begynder, skal du sikre, at et tilstrækkeligt lager af fisk.
    BEMÆRK: Den alder af fisk, der skal anvendes, er af afgørende betydning. Mens fisk af to forskellige arter kan være af lignende vægte, vil en yngre fisk af én art besidder flere Middelhavspartnerlandene end en ældre fisk af en anden art. Som en generel regel, yngre fisk, især når man arbejder med laksefisk, er bedst. For danionins kan fiske lige så gammel som et år udnyttes optimalt, mens laksefisk i alderen 4-6 måneder eller yngre (op til 15 g) er optimale.
  2. For hver 5 g væv, der skal udskæres, portion 25 ml isoleringsmedium i et sterilt 50 ml konisk rør.
  3. Afvejes, optage masse og antal røret (r). Anbring rørene på is.
  4. Afliv 2-3 fiskpå et tidspunkt ved nedsænkning i> 300 mg / l natrium bicarbonatpufret tricaine methanesulfonate. Tillad opercular bevægelse for at ophøre i> 5 minutter og derefter submerse fisk i 70% ethanol (indeholdt i sterile bægerglas) i 30 sekunder.
  5. Fjern fisk fra 70% ethanol og placere på vandafvisende autoklave papir. Direkte bag gællelåg bruge en skalpel til at lave en overfladisk, overfladisk snit. Fjern skalaer og hud ved at tage fat i huden på den førnævnte snit og trække ind mod hale af fisk.
  6. Efter fjernelse hud, udskære epaxial, hurtigt glycolytic "hvide" muskel i fisk fra begge sider (for at undgå den langsomme-oxidative »røde« muskel beliggende nær den laterale linie) og sted i isolation medium. Kassér resten af ​​fisken som krævet institution.
    BEMÆRK: Selv om det er fuldt ud muligt at kultur Middelhavspartnerlandene oprindelse fra rød muskel, har næsten hver publikation ved hjælp teleost Middelhavspartnerlandene udnyttede celler isoleret fra den epaxial myotome.
  7. Gentag trin 2,4-2,6, indtil en tilstrækkelig mængde af muskel opnås. Under dissektion sikre, at poolet muskelvæv forbliver på is for at opretholde cellernes levedygtighed.

3.. Mekanisk Dissociation

  1. Hæld en tube 25 ml / 5 g af muskelvæv i et glas petriskål. Brug to skalpel håndtag med påsat # 10 skalpelblade, hakkekød væv til en gylle eller puré konsistens. A "back-og-tilbage" bevægelse for at trække i skalpelblade forbi hinanden fungerer bedst.
    BEMÆRK: Selvom væv homogenisatorer kan virke hensigtsmæssigt, vil antallet af levedygtige celler reduceres drastisk, hvis ikke afskaffet.
  2. Ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette og serologisk pipette, fjerne opslæmmede væv og erstatte i den oprindelige konisk rør.
  3. Gentag trin 3,1-3,2 indtil alle væv i alle rør er blevet dissocieret mekanisk.
  4. Centrifuger væv i 5 minutter ved 300 xg og 10 ° C.
  5. Follgrund centrifugering, kassere de 25 ml medier supernatanten med en 25 ml serologisk pipette, vakuum aspirator, eller ved omhyggelig dekantering.
  6. 25 ml vaskemedium til hvert rør, resuspender væv, og recentrifuge som ovenfor.
  7. Vask to gange med vask medium, fjernelse af supernatanten hver gang.

4.. Enzymatisk Dissociation

  1. Under trin 3.4, forberede collagenaseopløsning ved at kombinere 0,22 g af type IV collagenase og 44 ml af uædle medium (eller tilstrækkelig mængde på 0,11 g/0.22 ml).
  2. Rør i et bæger i 10-15 minutter ved 4 ° C. Filtersteriliser med en 50 ml sprøjte og et 0,45 um sprøjtefilter.
    BEMÆRK: Mere end en sprøjte filter kan være nødvendig, afhængig af præparatet collagenase. Collagenase fra andre end Worthington Biokemisk leverandører udgør mere besvær under filtrering. Collagenase bruges til at adskille peptidbindinger i kollagen, udgør endomysium. Detfordøjelse vil fjerne det beskyttende barriere af myofibre.
  3. For hvert gram af muskelvæv, resuspender væv i en 0,2% collagenaseopløsning. Til 5 g af muskelvæv, tilsættes 10 ml collagenaseopløsning og 15 ml basemedium.
  4. Tilsæt 10 ul af PSF per ml collagenaseopløsning / base medium (fx 250 pi til 25 ml). Sikre, at vævet er godt suspenderet, da dette vil påvirke effektiviteten af ​​den enzymatiske fordøjelse.
  5. Inkuber muskelvæv i collagenase i 60 minutter ved 18 ° C under forsigtig vipning. Afhængig af graden af ​​mekanisk dissociering, og arter, kan collagenasefordøjelse forlænges til 90 minutter, selvom dette kan påvirke cellernes levedygtighed.
  6. Efter collagenase fordøjelse centrifugeres koniske rør ved 300 xg i 5 minutter ved 12 ° C. Bortkast supernatanten og resuspender væv i 25 ml vaskemedium.
  7. Recentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 126; C. Gentag med vaskemedium en anden gang.
  8. Efter vask væv to gange, resuspenderes muskelvæv i 25 ml vaskemedium og tritureres med en 10 ml serologisk pipette, indtil væv / medium homogenat passerer ind og ud af pipetten med relativ lethed. 5-10 triturationer er normalt tilstrækkeligt.
    1. Gentag med en 5 ml serologisk pipette og derefter en 16 gauge metal kanyle fastgjort til en sprøjte.
  9. Centrifuge koniske rør ved 300 xg i 5 minutter ved 12 ° C. Dekanteres supernatanten.
  10. Under ovennævnte fem minutter centrifugering forberede trypsinfordøjelse opløsning ved at kombinere 0,25 g trypsin med 5 ml basismedie.
  11. Der omrøres ved 4 ° C i 10-15 minutter og filtreres sterilisere med en 20 ml sprøjte og 0,45 um sprøjtefilter.
  12. Hent koniske rør, og 100 pi af trypsinopløsning og 4,9 ml dissociation medium til hver 1 g af muskelvæv til alle rør. For example, tilsættes 500 pi trypsinopløsning og 24,5 ml dissociation medium til 5 g af muskelvæv.
    BEMÆRK: Trypsin er en serinprotease, der vil adskille myogene precursorceller fra basal lamina.
  13. Resuspender væv i trypsin / dissociation medium godt. Inkuber i 20 minutter ved 18 ° C.
  14. Efter den første trypsin inkubation centrifugerør koniske rør ved 300 x g i 1 min ved 12 ° C.
  15. Neutralisere trypsin ved at kombinere supernatanterne med isolation medium ved en koncentration på 1 rumfang supernatant til 4 volumener isolation medium. Opbevares ved 4 ° C under den anden trypsin fordøjelse.
  16. Til den resterende pellet af væv Gentag trin 4,12-4,15 kombinere supernatanten efter trin 4.15 med supernatanten / isolation medium fra den første trypsinfordøjelse.
  17. Alternativ: collagenase og trypsin spaltninger kan kombineres for at maksimere celleudbytter. <ol>
  18. For at gøre dette, udriv collagenase fordøje bruge en metal kanyle (6 i længden og 16 gauge virker bedst) er fastgjort til en 20 ml sprøjte, indtil homogenatet nemt passerer gennem kanylen.
  19. Til homogenatet tilsættes 500 pi trypsin-opløsning (fremstillet i trin 4.10), og der inkuberes ved 18 ° C i 20 minutter.
  20. Efter inkubering centrifugeres koniske rør ved 300 xg i 1 minut ved 12 ° C.
  21. Neutralisere trypsin ved at kombinere supernatanterne med isolation medium ved en koncentration på 1 rumfang supernatant til 4 volumener isolation medium.
  22. Opbevares ved 4 ° C under den anden trypsin fordøjelse.
  23. Fortsæt med trin 4.18 som med standard protokol.
  • Doser den endelige supernatant / isolation medium blandingen i 50 ml koniske rør og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 12 ° C.
  • Fjern supernatanterne pas på ikke at forstyrre cellenpellets. Der afpipetteres 2 ml komplet medium i hvert rør, opløse hver celle pellet.
  • Kombiner celler suspenderet i komplet medium i et 50 ml konisk rør.
  • Skyl hvert rør med 1 ml komplet medium, der kombinerer med puljen af ​​celler resuspenderet tidligere.
  • Tritureres med en metal kanyle og sprøjte 5-10 gange.
  • Filtreres cellesuspensionen gennem en 100 um cellefilter, skylning med komplet medium.
  • Foretage cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter.
  • Tilsæt tilstrækkeligt komplet medium til 50 ml og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 15 ° C.

    • 5.. Optælling, fortynding, og såning af celler

    1. Efter den endelige centrifugering i trin 4.25, fjernes supernatanten ved forsigtig dekantering eller med en serologisk pipette. Resuspender cellepelleten i 5 ml komplet medium.
    2. Med celler fuldt resuspenderet, fjerne 20 ul; Af cellesuspensionen og anbringes i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    3. Tilsæt 5 ul Trypan blåt farvestof og vent 5 minutter. Ved hjælp af et hæmocytometer, bestemme antallet af levedygtige celler.
    4. Ved beslutsomhed, fortyndes celler til den nødvendige koncentration. Teleost Middelhavspartnerlandene er bedst podes ved 150.000-200.000 celler pr cm2. For en seks-brønds plating strategi fortynding celler 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 per ml understøtter tilstrækkelig proliferation og differentiering.
    5. Hent poly-L-lysin-behandlet, laminin-belagte plader og frøceller. (Se tabel 5 for plade-specifik fortyndinger og plating mængder.) NB: Tabel 6 viser det gennemsnitlige antal celler isoleret per gram muskelvæv isoleret fra forskellige teleost arter. Regnbueørred (O. mykiss) udviser færre Middelhavspartnerlandene per gram af muskelvæv end at gøre zebrafisk (D. rerio) og vil således kræve flere fisk til at isolere fra for korrekt såning.
    6. Seal plader med laboratorie tape og sted i isnende inkubator ved en passende temperatur. Middelhavspartnerlandene fra alle arter, der er anført her (gem for mus) kan inkuberes under normale atmosfæriske forhold uden kuldioxid (CO 2) tilskud. (Se tabel 7).
    7. Alternativ: Nogle laboratorier har vedtaget en protokol, der opfordrer til at lade Middelhavspartnerlandene til at klæbe til kultur substrater i 40 minutter.
      1. Derefter skylles plader med vask medier for at fjerne eventuelle løst tilknyttet og ikke-klæbende celler. Advarsel: Dette trin er meget vigtigt at undgå "non-specifikke" vedhæftning af andre celler (f.eks fibroblaster) til kultur substrater.
      2. Tilføj komplette medier og placere celler i inkubatoren og omsorg for som beskrevet nedenfor.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Fireogtyve timer efter såning, myogene præcursorceller (MPCs) skal være synlig fastgjort til laminin substrat (se figur 1a og 1d). Efter såning, celler (MPCs) vedtage en spindel-lignende form, indikerer denne celletype (figur 1) og er MYOD1 + (Figur 2). I Danio arter, Middelhavspartnerlandene synes at være mere kompakt med mindre bipolære processer end at gøre Middelhavspartnerlandene fra Oncorhynchus og Salmo arter. Men over fire dage med kultur, Middelhavspartnerlandene fra alle piscine arter undersøgte vedtage tilsvarende morfologi og ser tydeligt ligesom myoblaster (figur 1b og 1e). Komplette medier bør fjernes, og MPL skal vaskes to gange med vaskemedium. Myofibroblasts kan forurene myogene kulturer og umiddelbart kan skelnes fra MPCs / myoblaster ved deres stjerne-lignende morfologi (versus spindel formen af ​​myoblast). Vask af pladerne kraftigt improves fjernelsen af ​​sådanne fibroblaster.

    I de arter, der er beskrevet her (se tabel 7), producerer dagligt medieændringer de bedste resultater. MPL og afkom (myoblaster og fremspirende myorør) skal vaskes en gang eller to gange før tilsætning af friske komplette medier. Alternativt kan medieændringer reduceres til hver anden dag efter at cellerne har nået den endelige myoblast etape (ca. dag 4 i kultur). Myorør bør indgå inden for 2-3 dage (figur 1c og 1f) og være myogenin + (figur 2), især når dyrket i differentiering medium (se nedenfor). Mens perioder af uger til måneder er blevet rapporteret i flere pattedyrarter, behøver piscine Middelhavspartnerlandene og myoblaster ikke at tolerere sådanne perioder. Celler formere for de første seks dage af kultur (figur 3), med efterfølgende differentiering mellem dag 7 og 9-11 af kultur. Bagefter celler ældning eller enpoptose.

    Den myogenic natur Middelhavspartnerlandene og deres afkom isoleres ved hjælp af denne protokol er blevet fastlagt 3,32,33 baseret på genekspression. I modsætning til pattedyr dyrkningssystemer, spredning af Middelhavspartnerlandene og afkom myoblast er relativt lavt i de første dage af kultur (i forhold til systemer, der anvender primære murine myoblaster eller C2C12), med hurtige stigninger detekteres som cellerne danner umodne myorør i dagene 6-9 af kultur i Danio arterne 32.. Rapporter fra regnbueørred har udnyttet en differentiering medium (almindelig i pattedyrs myoblast kulturer, men ikke påkrævet i piscine systemer), og angiver, at sprednings-indeks falder som forventet med myotube dannelse 33.. I vores hænder, kan de resulterende myorør forblive i kultur i op til 9-11 dage (Danio arter) og 11-13 dage (Oncorhynchus-arter), før cellulær ældning eller apoptose opstår.

    Reagens Company (Preferred mod Alternate) Katalognummer (Preferred v. Alternate) Mængde pr Kultur
    γ-bestrålede poly-L-lysin Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (høj glucose) Sigma-Aldrich (Cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Natriumbicarbonat (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1,51 g
    HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9,53 g
    Antibiotika / antimycotikum Thermo Scientific (SIGMA-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 ml
    Gentamicinsulfat Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 ml
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 ml
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 ml
    Collagenase (type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0,44 g
    Trypsin (fra bugspytkirtlen) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g

    Tabel 1.. Detaljeret reagenslisten med foretrukne producent og katalognummer.

    Forbrugsmaterialetype Værktøj Udstyr
    Cellekulturplader Pincet (Grov) Serologisk Pipetteenhed
    Sterile 50 ml koniske rør Pincet (Fin) pH Meter
    Laboratory Tape Skalpel håndtag Nedkøling Inkubator (Echotherm)
    0,2 um Vacuum Sterilisation Systems Skalpelblade (# 10, # 11) Laminar Flow Hood
    Vandafvisende Autoklave Paper Kirurgiske Saks Vakuummanifold
    Serologiske pipetter Glaspetriskåle Microosmolality Meter
    12-16 G kanyler med Luer Låse

    Tabel 2. Hjælpematerialer, værktøjer og nødvendigt udstyr til cellekultur.

    Pladestørrelse cm2 pr Well Poly-L-lysin * Laminin **
    6 brønde 9.5 1,6 ml 1
    24 brønde 1.9 0,32 0.2
    48 brønde 0.95 0.16 0.1
    96 brønde 0,32 0.06 0.03
    * 0,1 mg / ml koncentration ** Koncentration 0,020 mg / ml

    Tabel 3. Optimeret mængder til overtrækning celle dyrkningsplader med poly-L-lysin og laminin.

    Reagens Isolation Vaske Dissociation Komplet
    Base Medium 419,25 ml 395,40 ml 297.00 ml 178,00 ml
    PSF * 5,00 ml 4,00 ml 3,00 ml 2,00 ml
    Gentamicinsulfat ** 0,75 ml 0,60 ml - -
    Donor Equine Serum 75.00 ml - - -
    Kalvefosterserum *** - - - 20.00 ml
    * PSF: penicillin / streptomycin / fungizon cocktail (100x); ** 50 mg / ml koncentration; *** Karakteriseret

    Tabel 4. Forskellige medier forberedelser til isolering og dyrkning af myogene præcursorceller (MPCs).

    <td> 9.5
    Pladestørrelse cm2 pr Well Udvanding Plating Volume
    6 brønde 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 1 ml
    24 brønde 1.9 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 250 pi
    48 brønde 0.95 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 150 pi
    96 brønde 0,32 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 50-100 ul

    Tabel 5. Anbefalede fortyndinger og plating mængder efter celledyrkningsplade godt størrelse.

    Arter Gennemsnitlig # celler / g væv
    Danio rerio 6.400.000
    Danio dangila 1.783.000
    Devario aequipinnatus 1.797.000
    Oncorhynchus mykiss 66.800

    . Tabel 6 Gennemsnitligt antal myogene præcursorceller isoleret fra 1 gram af muskelvæv fra forskellige teleost arter: Danio rerio (zebrafisk), Daniodangila (moustacheddanio) Devario aequipinnatus (kæmpe danio) og Oncorhynchus mykiss (regnbueørred).

    Arter Temperatur
    Danio / Devario spp. 26 - 28 ° C
    Oncorhynchus / Salmo spp. 10 * - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * Lavere temperaturer støtter lavere opformeringsrater.

    Tabel 7.. Anbefalet inkubationstemperaturer for piscine og padder myogenic precursor celler (MPCs).

    Figur 1
    Figur 1.. Repræsentative lyse felt billeder af Middelhavspartnerlandene (længst til venstre), myoblaster (i midten), og begyndelsen myorør (længst til højre) fra to arter, regnbueørred (Oncorhynchus mykiss, øverst) og zebrafisk (Danio rerio, nederst).

    Figur 2
    Figur 2.. Repræsentant immuncytokemiske farvning af middelhavspartnerlandene (a, c) og myorør (b, d) isoleret og dyrket fra gigantiske Danio (Devario aequipinnatus, øverst) og regnbueørred (Oncorhynchus mykiss, nederst). I kultur, myoblaster er MYOD1 + positive (a, c)som visualiseret ved hjælp af kommercielt tilgængelige MYOD1 + antistoffer (Danio: C-20, Santa Cruz Biotechnology, ørred: NB100-80.899, Novus Biologicals). Derudover, som myoblaster differentiere, de udtrykker myogenin (b, d), som visualiseret ved hjælp af kommercielt tilgængelige myogenin antistoffer (Danio: M-225, ørred: SC-567, begge fra Santa Cruz Biotechnology).

    Figur 3
    Figur 3.. Repræsentative celleproliferationssygdomme data ved hjælp af BrdU at måle celle opformeringsrater over tid i kulturen. Data fra Middelhavspartnerlandene isolerede og dyrkede fra gigantiske Danio 67.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den myogene programmet, uanset undersøgte arter kan lettest studeres gennem et in vitro system. Faktisk ved isolation, myogene præcursorceller (MPCs) i fisk eller myosatellite celler (MSC) i pattedyr let ind i denne stærkt regulerede proces, der involverer proliferation, tilbagetrækning cellecyklus, og terminal differentiering af myoblaster og sammensmeltningen af ​​disse myoblaster i spirende myotuber. Den generelle mangel på transgene gen reporter stammer af piscine arter (måske med undtagelse af zebrafisk 67 og regnbueørred 69) begrænser in vivo arbejde MPC / MSC aktivering, proliferation og differentiering, og dermed in vitro-system præsenteres her, er en attraktiv platform for studier i fiskearter.

    Vellykket kultur MPC / MSC, uanset arten, er meget afhængig af a) streng opmærksomhed sterilitet; b) grundig mekanisk dissociation af skeletmuskulatur tspørgsmål; og c) optimering af enzymatisk fordøjelse. Under de indledende trin af muskelvæv isolation, skal der udvises stor omhu for at sikre, at den nødvendige mængde af væv udskæres uden forurening. Det er af yderste vigtighed, at fisk (eller nogen dyr bliver udnyttet, for den sags skyld), desinficeres i 70% ethanol og tilstrækkelig tid. I vores hænder 30 sekunder fungerer bedst; kortere perioder kan resultere i forurening og længere, tab af væv integritet og cellelevedygtighed. Ethanol kan bruges som et fiksativ, så skal man være omhyggelig for ikke at dehydrere fisken før dissektion. Dissektion kan udføres uden for en laminar strømning cellekultur hætte; men vi anbefaler, at denne proces gøres inden en hætte til at minimere enhver potentiel bakteriel eller svampeangreb.

    Mens den mekaniske dissociation beskrevet ovenfor kan virke rå og / eller kedelig i starten, er det afgørende at den isolation procedure. To store skalpelblade, trækkes forbihinanden i en glidende bevægelse (som vist i videoen protokol), giver de bedste resultater. Når du er færdig, skal konsistensen af homogenatet være, at en gylle eller puré, og let opsamles med en bred-boring serologisk pipette (dvs. 25 ml). Simply, jo bedre mekaniske dissociering, jo højere MPC / MSC udbytte og bedre resulterende kultur. Dårlig dissociation vil hæmme enzymatisk fordøjelse og mindske celleudbytte. Selv om det kan være fristende at overveje, brug af elektriske væv homogenisatorer dramatisk sænker cellernes levedygtighed på trods af sin åbenlyse bekvemmelighed, i det mindste med piscine Middelhavspartnerlandene.

    Som med alle protokoller, optimering af proceduren beskrevet ovenfor er det ofte nødvendigt. Dette har vist sig sandt i vores arbejde med flere danionin arter. Resultater fra vores laboratorium viser, at mindre danionins (f.eks zebrafisk) give flere Middelhavspartnerlandene per gram skeletmuskulatur end at gøre større arter (f.eks giant eller moustached Danio). Dette er imidlertid kun realiseres, hvis en højere koncentration af collagenase (0,3%) anvendes sammen med væv fra mindre arter. I vores hænder, en koncentration på 0,2% er passende for laksearter (f.eks regnbueørred, cutthroat ørred [Oncorhynchusclarki], Chinook laks [Oncorhynchustschawytscha]), de større danionins, Axolotl (Ambystomamexicanum) lemmer og hale, og selv mus skeletmuskulatur. Ligeledes skal der drages omsorg for at vælge den relevante collagenase. Det er vores erfaring, type IV collagenase bevarer cellelevedygtighed langt bedre end kollagenaser anbefales til fibrøse væv såsom knogler og muskler (dvs. kollagenase type II) 70. Mens fordøjelsen kan være mere komplet i en kortere periode, er cellemembranreceptor integritet sandsynligvis kompromitteret af øget tryptisk aktivitet i disse forberedelser. Med hensyn til trypsin, har vores laboratorium altid udnyttet grovere trypsin forberedelse purdres fra svin bugspytkirtel, snarere end de "renere forberedelser til rådighed. I vores kultur aktiviteter med forskellige arter, har vi bemærket lidt gavnlige effekt af varierende trypsin koncentrationer.

    Findeling er afgørende for denne protokol. Det både dissocierer den fibrøse matrix af skeletmuskulatur og øger overfladeareal for tryptisk fordøjelse alt imens manuelt forstyrre den strukturelle integritet af myofibre. Ved udførelse af triturationer, er meget lettere end ved hjælp af kanylen og sprøjten straks successivt bruge mindre bore pipetter og kanyler. Fortsætter direkte til tritureringer med en kanyle og sprøjte kan resultere i tilstoppede kanyler og / eller stort tryk påføres celler. Anvendelse trypsinfordøjelse uden tilstrækkelig trituration vil dramatisk reducere celleudbytter.

    Når det er isoleret, kultur processen er ganske ligetil. De fleste udgivelser til dato har udnyttet en protokol with ét medie for både spredning og differentiering 33,71-75, herunder vores egen; Men nyere artikler skrevet af flere franske efterforskere har beskrevet en to medier protokol med separate baserede medier og serum indhold til proliferation og differentiering 33.. Denne 'nyere' protokol mere nøje efterligner dem, der anvendes i kulturen af murine MSC og myoblastsand ser ud til at øge udbredelsen af fase myoblaster tidlige 33 og kan være mere relevant at kontrollere proliferation og / eller differentiering af celler. Men uden en omfattende karakterisering af genekspression, er det vanskeligt at konkludere, om en sådan 'spredning' medier sparer også en mere 'myoblast-lignende "tilstand, end det traditionelle medier metodologi. Tidligere publikationer, der beskriver genekspression, enten ved afskrift eller protein niveau, indberettes ved hjælp det traditionelle medier protokol 3. Alternativt kan en enkelt medier (DMEM beskrevet heri) kan suppleres med forskellige koncentrationer af føtalt bovint serum (FBS): 10% til proliferation og 2% for differentiering.

    Mens efterforskere beskæftiger pattedyrcelledyrkningssystemer kan akklimatiseret til at bruge kuldioxid atmosfærer til dyrkning af disse celler, de iboende forskelle mellem terrestriske og akvatiske gasudveksling opkald til en anden tilgang, når dyrkning piscine eller vand begrænset halepadder celler, herunder Middelhavspartnerlandene. Medier, der er beskrevet her, er bufret med en piperazin-afledte, zwitterioniske organiske forbindelser [HEPES: 4 - (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre] og natriumbicarbonat (NaHCO3). Således er en inkubator med gasinjektion ikke nødvendigt eller påkrævet til dyrkning af disse celler. Endnu vigtigere er, bør sådanne inkubatorer besidder evnen til at køle stedet for varme, da temperaturen nødvendig til kultur piscine og halepadder MPL området mellem 18-26 ° C. Endvidere kan laksefiskvande Middelhavspartnerlandene være cultured ved lavere temperaturer, hvis nødvendigt, hvilket yderligere understreger behovet for en kølende kuvøse. Derudover har vi fundet (som har andre undersøgere, som meddelt tidligere), som forsegling af dyrkningsplader er nødvendigt at bevare cellulær levedygtighed. Simpelthen indpakning grænsefladen mellem kultur låget og plade med standard laboratorium tape er tilstrækkelig til at realisere dette mål.

    Mens passaging af både primære Middelhavspartnerlandene / MSC / myoblaster er almindelig i pattedyrs cellekultur, synes det ikke at være muligt med piscine celler, i det mindste før den sene Mb etape (omkring dag 6 i kultur). Derfor skal et passende antal celler tilstrækkelig til at understøtte spredning og til at nå målene i forsøget podes ved indledningen af ​​kulturen. Yderligere, hvis der opnås mindre end forventet celleudbytter, er det ikke muligt at udbrede celler og derefter replate afkommet senere. Vi har tilskrevet denne egenskab til den øgede afhængighed af extracellular matrix (ECM) i piscine MPC / myoblaster. Alternativt er det muligt, at dette er en artefakt af laminin substrat og dermed yderligere empirisk bestemmelse af ECM komponenter til piscine MPC / Mb proliferation og differentiering er berettiget. Vi gør opmærksom på, dog, at flere af vores samarbejdspartnere har med held fjernet sene myoblaster (~ dag 6 i kultur) fra kultur undergrunden og genudplades disse celler (JM Froehlich og PR Biga, personlig kommunikation).

    Ved hjælp af denne protokol eller en, der ligner den, eksperimenter involverer RT-PCR 3,71-74,76-78, Western blot 32,79-81, immuncytokemi 32,33, proliferationsassays 32,33,59, gentransfektion 15. morfometriske analyse 78, toksikologi screening 82 og kromatin immunoprecipitation (chip, JM Froehlich og PR Biga, upublicerede resultater) er blevet gjort. Men yderligere beskrivelser af yderligere i vitro protokoller, nemlig dem, der involverer passage og klonal formering, er meget tiltrængt. Faktisk Rodgers laboratorium 15 gjort betydelige fremskridt i kulturen i piscine MPCs / myoblaster ved at optimere en protokol for at fremkalde transfektion af regnbue ørred myoblasts. Baseret på denne metode, yderligere undersøgelser, der involverer RNAi eller overekspression af skeletmuskulatur-specifikke mål, især dem, der postuleres at være involveret med livslang vækst baner af teleost fisk, er ikke kun muligt, men kan føre til betydelige fremskridt i akvakultur og biomedicinske områder af videnskaben.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Der er ikke noget at afsløre.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gerne udvide mange tak til Drs. Josep Planas og Juan Castillo for deres professionelle ekspertise inden for udvikling og anvendelse af denne kultur protokol til små fisk og padder. Også tak til de mange personer, der har utrætteligt bistået med dissektion og dissociation af muskelvæv fra mange fisk (både i art og antal), herunder Matthew Opladning, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, og Sinibaldo Romero. Dette arbejde blev støttet af University of Alabama i Birmingham Biologisk Institut startfonde, Center for Protease Research NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 og NDSU Advance FREM NSF Grant # HRD-0.811.239 til PRB. Der blev også leveret af UAB Nutrition Obesity Research Center prisen # P30DK056336, NIH NIDDK. Indholdet er alene forfatternes ansvar og ikke nødvendigvisrepræsenterer de officielle synspunkter NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
    2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
    3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
    4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
    5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
    6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
    7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
    8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
    9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
    10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
    11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
    12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345 (2010).
    13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
    14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
    15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
    16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
    17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
    18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
    19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
    20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
    21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
    22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
    23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
    24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
    25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
    26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
    27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
    28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
    29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
    30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
    31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
    33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
    35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
    36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
    37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
    38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
    39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
    40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
    41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
    42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
    43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
    44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
    45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
    46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
    47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
    48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
    49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
    50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
    51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
    52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
    53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
    54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
    55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
    56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
    57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
    58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
    59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
    60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
    61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
    62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
    63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
    64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
    65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
    66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
    67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
    68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
    69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
    70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
    71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
    72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
    73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
    74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
    75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
    76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
    77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
    78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
    79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
    80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
    81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
    82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
    83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

    Tags

    Basic-protokollen myogenese zebrafisk myoblast cellekultur kæmpe danio moustached Danio myorør proliferation differentiering Danioninae Axolotl
    Fremstilling af primær Myogenic precursorcelle / myoblast kulturer fra Basal hvirveldyr afstamninger
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Froehlich, J. M., Seiliez, I.,… More

    Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter