Summary
La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltura primaria consente l'identificazione di meccanismi di regolazione conservati e divergenti tutta i lignaggi vertebrati.
Abstract
A causa della difficoltà intrinseca e ora coinvolto con lo studio del programma miogenico in vivo, sistemi di coltura primarie derivate da cellule staminali adulte residenti del muscolo scheletrico, le cellule precursori mioblaste (PPM), si sono rivelati indispensabili per la nostra comprensione dello sviluppo dei mammiferi muscolo scheletrico e crescita. Soprattutto tra i taxa basali di vertebrati, tuttavia, i dati sono limitati descrive i meccanismi molecolari che controllano l'auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione di PPM. Di particolare interesse sono i potenziali meccanismi che sottendono la capacità dei vertebrati basali a subire notevoli postlarval scheletrico myofiber iperplasia (cioè i pesci teleostei) e piena rigenerazione in seguito alla perdita appendice (cioè urodèle anfibi). Inoltre, l'utilizzo dei mioblasti in coltura potrebbe aiutare nella comprensione della rigenerazione e la ripresa del programma miogenico e le differenze tra loro. Atal fine, si descrive nel dettaglio un protocollo robusto ed efficiente (e le variazioni in esso) per isolare e mantenere PPM e la loro progenie, mioblasti e miotubi immaturi, in coltura cellulare come piattaforma per comprendere l'evoluzione del programma miogenico, a cominciare dal più vertebrati basali. Sfruttando il modello di status organismo del pesce zebra (Danio rerio), si segnala l'applicazione di questo protocollo per piccoli pesci del clade ciprinidi Danioninae. In tandem, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare un approccio comparativo più ampio isolando PPM dal axolotl messicano (Ambystomamexicanum) e anche roditori da laboratorio. Questo protocollo è ora ampiamente utilizzato nello studio myogenesis in diverse specie di pesci, tra cui la trota iridea, salmone e orate 1-4.
Introduction
Notevole comprensione della miogenesi mammiferi è stato ottenuto attraverso la ricapitolazione di questo processo in entrambe mouse principale (Mus musculus) culture mioblasti e la linea cellulare derivata da topo ben descritto, C2C12 5. A partire dal 1950 6, queste culture hanno portato a molto progresso nella comprensione del programma murinemyogenic e, per estensione, miogenesi in altri vertebrati. Inoltre, monocellulari tecniche myofiber espianto hanno aumentato fuori comprensione delle interazioni tra le cellule satelliti e fibre muscolari che circondano 7-9. Colture cellulari sono particolarmente interessanti per le indagini di myogenesis a causa del poco tempo da precursore delle cellule differenziate 10, relativa facilità di trasfezione per RNAi 11-14, transgenici 15,16 e iperespressione studi 14,17,18, l'espansione in vitro seguita da trapianto in vivo 18-20, e anche compArison di cellule precursori miogeniche e ai loro agenti di regolazione tutta taxa 21,22. Mentre le differenze dovute all'ambiente artificiale del sistema di coltura sono stati descritti 5,23, questi sistemi in vitro hanno dimostrato di essere indispensabile al nostro dissezione del programma intricato regolamentano la formazione di multinucleate, myofibersfrom terminalmente differenziate mononucleate cellule progenitrici proliferative conosciuti come myosatellite cellule (MSC) tra i mammiferi.
Al di fuori della classe Mammalia, tuttavia, la conservazione e / o divergenza di meccanismi che controllano myogenesis sono capiti male, soprattutto a causa della difficoltà di coltura di cellule precursori mioblaste (PPM) e mioblasti da diversi taxa. Infatti, colture primarie di mioblasti sono stati descritti solo in tre uccelli 24-26, un rettile 27, un paio di anfibi 28-30, e alcuni pesci 1,3,4,31-33. Linee cellulari continue miogeniche da vertebrates diversi roditori 34-36 sono ancora più rari, con l'unica linea non-mammiferi miogenico delle cellule essendo derivata da quaglia giapponese (Cortunix japonica), QM7 37. Nonostante i molti tentativi di immortalization, una linea cellulare miogenico teleosteo rimane sfuggente e un protocollo per la trasfezione efficiente di queste cellule è stato pubblicato solo quest'anno 15. Quindi, sono molto necessari protocolli chiari e ben ottimizzato per la coltura PPM primari e mioblasti da una varietà di vertebrati, non solo per espandere ulteriormente la nostra conoscenza dell'evoluzione del programma miogenico, ma di utilizzare il potere della fisiologia comparata a fare progressi in il trattamento di malattie muscolari scheletriche ei disturbi umani.
Mentre la letteratura contiene molte segnalazioni di MPC / mioblasti isolamento 38-49, è comune per gli autori per descrivere i protocolli per tali isolamenti in breve, spesso incompleti, formati. Inoltre, i protocolli più istruttivi pronti contro termineVALIDITA sono stati sviluppati per i topi 50-53, e alcuni di questi contare su selezione di anticorpi 54,55 o transgeni fluorescenza 56,57, rendendo questi protocolli inutilizzabile o impraticabili intimi specie di non roditori utilizzati dai biologi muscolari. Con poco conosciuto su piscine, anfibi, rettili e miogenesi, un protocollo dettagliato e approfondito, descritta con una guida audiovisiva e con efficienza dimostrata in specie lontanamente imparentati, sarebbe più utile per il campo.
In primo luogo descritto da Powell e colleghi nel 1989 58, il seguente protocollo è stato inizialmente sviluppato per isolare PPM e mioblasti da pesci salmonidi (vale a dire, trota iridea, Oncorhynchus mykiss, e salmone atlantico, Salmo salar) e alcuni ciprinidi più grandi (ad esempio pesci rossi, Carassiusauratusauratus) . Nel 2000, Fauconneau e Paboeuf ottimizzati una cultura mioblasti primario per la trota iridea 59, e minoroptimizations made che il protocollo utilizzabile in diversi pesciolini piccoli del clade Danioninae (zebrafish, Danio rerio, e Danio giganti, Devario Aequipinnatus) 32 a causa dei molti strumenti genetici disponibili per il lavoro zebrafish e quindi i suoi parenti stretti. Pesci teleostei sono organismi interessanti per lo studio a causa della loro strategia di crescita divergente (almeno nella maggior parte delle specie). Grandi salmonidi, come la maggior parte dei pesci, crescono indeterminato, con un potenziale di crescita illimitato da parte di un asintoto alla scadenza, anche in età 60-62. A differenza di zebrafish, grandi danionins come il danio gigante 63 e potenziali di crescita visualizzazione Danio baffuti tipici dei pesci teleostei, rendendo la loro diretta giustapposizione una piattaforma ideale per capire se la scelta del destino cellulare MPC svolge un ruolo nella iperplasia muscolo scheletrico contro l'ipertrofia.
Allo stesso modo, abbiamo dimostrato che questo protocollo può essere utilizzato con topi e axolotl, con rendimento relativamente elevato cellulare e viabindici ility. Salamandre urodèle, come l'axolotl messicano (Ambystomamexicanum), possiedono la straordinaria capacità di rigenerare i tessuti, anche di interi arti e code di 64-66. Questa caratteristica rende questi anfibi interessanti modelli di atrofia muscolare scheletrico e l'invecchiamento. Utilizzando il protocollo descritto di seguito, un approccio simile può essere effettuata come è stato fatto in molte specie di pesce, fornendo un contesto comparativo ancora più ampia per tali studi. Come molti biologi veramente apprezzare comparativi, i progressi più significativi nel campo della biologia di base e traslazionale biomedicina possono essere fatte quando i dati vengono analizzati all'interno dello spettro più ampio (qui, l'intera stirpe dei vertebrati).
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Protocol
Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione sugli animali vertebrati qui descritti è stato approvato in via preliminare dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Alabama a Birmingham ed è coerente con le linee guida stabilite dal Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health degli Stati Uniti Dipartimento di Salute e Servizi Umani.
1. Preparazione per la Cultura
- Preparare il terreno base come segue: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g per 2 L) in DMEM (13,48 g / L; 26,96 g per 2 L).
- Determinare il pH e regolare a 7,40 con HCl o NaOH.
- Determinare osmolalità e regolare a ~ 300 mOsm con NaCl (se necessario).
- Filtro sterilizzare con (2) sistemi di sterilizzazione 1 L di vuoto e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per un massimo di 2-3 mesi.
NOTA: vedere tabelle 1 e 2 per la completa reagenti, strumenti, consumAbles, e di informazione.
- Preparare-L-lisina trattati poli piastre sciogliendo 5 mg di γ-irradiati poli-L-lisina (> 300.000 mw) in 50 ml di acqua ultrapura sterile. Mescolare delicatamente per inversione per 10 minuti a temperatura ambiente, assicurando la piena dissoluzione dei polimeri lisina.
- Pipettare la quantità necessaria di poli-L-lisina soluzione in ogni pozzetto, secondo il tipo di placca (Tabella 3). Lasciare le piastre a stare in cappa a flusso laminare per 5 minuti.
- Quindi, rimuovere poli-L-lisina soluzione e lavare due volte con acqua sterile. Lasciare le piastre di aria secca in cappa a flusso laminare per 20 minuti.
- Ottenere 1 mg di laminina (origine Engelbreth-Holm-Swarm) e sciogliere in 50 ml di terreno base ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Applicare la soluzione laminina alle piastre di coltura cellulare poli-L-lisina trattati a 2 mg / cm 2. (Cfr. tabella 3 per le diverse dimensioni della piastra)
- Agitare delicatamente la soluzione per assicurare full bene la copertura. Sigillare le piastre con nastro adesivo di laboratorio e posto in incubatrice per 24 ore. L'incubatore deve essere impostato a temperatura appropriata per specie utilizzata (vedi Tabella 7), e nessun gas aggiuntivi devono essere aggiunti alla incubatrice.
NOTA: laminina deve poter aderire alle piastre per 24 ore prima della semina di cellule. In caso contrario, si provocherebbe un calo di alcuna adesione cellulare. - Preparare il supporto come descritto nella Tabella 4. Supporto completo sia meglio preparato il giorno di utilizzo.
- In preparazione per l'isolamento dei tessuti, assemblare i seguenti elementi e autoclave: 300-500 bicchiere ml (s); Piatti di vetro Petri; gestisce bisturi; pinze (fine e grossolano); forbici dissezione; e diversi fogli di carta autoclave acqua-repellente.
NOTA: Per ogni persona che assiste con il processo di dissezione, (2) maniglie bisturi, (1) pinza (tipo a seconda delle preferenze personali), (1) forbici dissezione, e (5-10), fogli di carta autoclave idrorepellente sonosufficiente. - Oltre agli elementi sopra autoclave, assemblare etanolo al 70%, un bilanciamento del peso, provette coniche da 50 ml sterili (numero dipende dalla dimensione della cultura), e ghiaccio.
2. Dissezione dei tessuti
- Prima di iniziare, assicurarsi che uno stock sufficiente di pesce è disponibile.
NOTA: L'età del pesce da utilizzare è di importanza critica. Mentre i pesci di due specie diverse possono essere di pesi simili, un pesce più giovane di una specie si possiedono più PPM di un pesce più vecchio di un'altra specie. Come regola generale, i pesci più giovani, soprattutto quando si lavora con salmonidi, sono i migliori. Per danionins, il pesce vecchio di un anno può essere utilizzata in modo ottimale, mentre i salmonidi di età 4-6 mesi o più giovani (fino a 15 g) sono ottimali. - Per ogni 5 g di tessuto che deve essere sezionato, aliquota di 25 ml di terreno di isolamento in un tubo da 50 ml sterile.
- Pesare, massa record e il numero del tubo (s). Mettere le provette su ghiaccio.
- Euthanize 2-3 pescialla volta per immersione in> 300 mg / L di sodio bicarbonato tamponata tricaine metansolfonato. Consentire movimento dell'opercolo cessare per> 5 minuti e poi immergere pesce in etanolo al 70% (contenuto nei contenitori sterili) per 30 secondi.
- Rimuovere il pesce dal 70% di etanolo e mettere su carta autoclave idrorepellente. Direttamente dietro la opercoli, usare un bisturi per fare un superficiale, poco profonda incisione. Rimuovere le squame e la pelle afferrando la pelle alla incisione di cui sopra e tirare verso la coda del pesce.
- Dopo la rimozione della pelle, asportare il epaxial, fast-glicolisi muscolare 'bianco' del pesce da entrambi i lati (evitando il muscolo lento-ossidativo 'rosso' si trova vicino alla linea laterale) e il luogo in terreno di isolamento. Scartare il resto del pesce come richiesto dalla istituzione.
Cellule Mentre è del tutto possibile PPM cultura provenienti da muscolo rosso, quasi ogni pubblicazione utilizzando teleosteo MPC ha utilizzato isolati dal epaxial m: NOTAyotome. - Ripetere i passaggi 2,4-2,6 fino ad ottenere una sufficiente quantità di muscolo. Durante la dissezione, assicurarsi che il tessuto muscolare pool rimane sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare.
3. Dissociazione meccanica
- Versare un tubo di 25 ml / 5 g di muscoli in una piastra di Petri di vetro. Utilizzando due bisturi manici con allegato # 10 lame bisturi, trita tessuto una consistenza fangosa o purea. Un movimento "avanti e indietro" di tirare le lame di bisturi passato vicenda funziona meglio.
NOTA: Mentre omogeneizzatori tessuto possono sembrare del caso, il numero di cellule vitali sarà drasticamente ridotto, se non abolita. - Usando una pipetta 25 ml sierologica e pipetta sierologica, rimuovere il tessuto impastato e sostituire nel tubo conico originale.
- Ripetere i passaggi 3.1-3.2 finché tutti i tessuti in tutte le provette è stato dissociato meccanicamente.
- Tessuto Centrifugare per 5 minuti a 300 xg e 10 ° C.
- Follcentrifugazione causa, eliminare i ml 25 di media surnatante con una pipetta 25 ml sierologica, aspiratore, o da un attento decantazione.
- Aggiungere 25 ml di mezzo di lavaggio per ogni tessuto tubo, risospendere e recentrifuge come sopra.
- Lavare due volte con mezzo di lavaggio, rimuovendo il supernatante ogni volta.
4. Enzimatica dissociazione
- Durante la fase 3.4, preparare la soluzione collagenasi unendo 0,22 g di tipo IV collagenasi e 44 ml di terreno di base (o quantità sufficiente a 0.11 g/0.22 ml).
- Mescolare in un becher per 10-15 minuti a 4 ° C. Filtro sterilizzare con una siringa da 50 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron.
NOTA: Più di un filtro a siringa può essere necessario, a seconda della preparazione collagenasi. Collagenase ottenuto da fornitori diversi Worthington Biochemical pone maggiori difficoltà durante la filtrazione. Collagenase viene utilizzata per dissociare legami peptidici in collagene che costituiscono l'endomisio. Questodigestione rimuoverà la barriera protettiva delle miofibre. - Per ogni g di tessuto muscolare, risospendere il tessuto in una soluzione di collagenasi allo 0,2%. Per 5 g di tessuto muscolare, aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi e 15 ml di terreno base.
- Aggiungere 10 ml di FPF per ml di collagenasi soluzione a medio / base (ad esempio, 250 ml a 25 ml). Assicurarsi che il tessuto è ben sospeso, in quanto questo influenzerà l'efficienza della digestione enzimatica.
- Incubare il tessuto muscolare in collagenasi per 60 minuti a 18 ° C con dolce dondolio. A seconda del grado di dissociazione meccanica e specie, collagenasi digestione può essere esteso a 90 minuti, anche se questo può influenzare la vitalità cellulare.
- Seguendo tubi digestione collagenasi, centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere tessuto in 25 ml di terreno di lavaggio.
- Recentrifuge a 300 x g per 5 minuti a 126; C. Ripetere con mezzo di lavaggio una seconda volta.
- Dopo tessuto lavaggio due volte, risospendere tessuto muscolare in 25 ml di mezzo di lavaggio e triturare con 10 ml pipetta sierologica finché il tessuto / medio omogenato passa dentro e fuori della pipetta con relativa facilità. 5-10 triturazioni di solito è sufficiente.
- Ripetere con 5 ml pipetta sierologica e poi una cannula metallica 16 attaccato ad una siringa.
- Provette per centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Decantare il surnatante.
- Durante la centrifugazione sopra di 5 minuti, preparare la soluzione tripsina digestione combinando 0,25 g di tripsina con 5 ml di terreno base.
- Agitazione a 4 ° C per 10-15 minuti e filtro sterilizzare con una siringa da 20 ml e 0,45 micron filtro a siringa.
- Recuperare provette coniche e aggiungere 100 ml di soluzione di tripsina e 4,9 ml di mezzo di dissociazione per ogni 1 g di tessuto muscolare di ogni tubo. Per example, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina e 24,5 ml di dissociazione medio per 5 g di tessuto muscolare.
NOTA: La tripsina è una serina proteasi che separerà cellule precursori miogenici dalla lamina basale. - Tessuto Risospendere in tripsina / dissociazione medie dimensioni, ben. Incubare per 20 minuti a 18 ° C.
- Seguendo la prima incubazione tripsina, provette coniche centrifugare a 300 xg per 1 min a 12 ° C.
- Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento. Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina.
- Per il pellet residuo di tessuto, ripetere i passaggi 4,12-4,15, combinando il supernatante seguente passo 4.15 con il fluido supernatante / isolamento dalla prima digestione tripsina.
- ALTERNATIVA: Le digestioni collagenasi e tripsina possono essere combinati per massimizzare le rese delle cellule. <ol>
- A tale scopo, triturare la collagenasi digest utilizzando una cannula metallica (6 in lunghezza e 16 gauge funziona meglio) attaccato ad una siringa da 20 ml fino omogenato passa facilmente attraverso la cannula.
- Per l'omogeneizzato, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina (preparato nella fase 4.10) e incubare a 18 ° C per 20 minuti.
- Seguendo le provette di incubazione, centrifugare conici a 300 xg per 1 minuto a 12 ° C.
- Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento.
- Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina.
- Procedere con il punto 4.18 come con il protocollo standard.
5. Conteggio, diluizione e semina delle cellule
- Dopo la centrifugazione finale nel passo 4,25, rimuovere il surnatante da un'attenta decantazione o con una pipetta sierologica. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di terreno completo.
- Con le celle completamente risospese, rimuovere 20 pl; Della sospensione cellulare e posto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 5 ml di Trypan colorante blu e attendere 5 minuti. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule vitali.
- Su determinazione, diluire celle alla concentrazione necessaria. Teleosteo PPM sono meglio seminati a 150.000-200.000 cellule per cm 2. Per una strategia sei pozzetti placcatura, diluendo cellule a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 per ml supporta proliferazione e differenziazione sufficiente.
- Recupera-L-lisina poli-trattati, piatti laminina rivestite e cellule di semi. (Vedi Tabella 5 per diluizioni specifico targa e volumi di placcatura.) Nota: La tabella 6 illustra numero medio di cellule isolate per grammo di tessuto muscolare isolati da varie specie di teleostei. La trota iridea (O. mykiss) esporre un minor numero di PPM per grammo di tessuto muscolare che fare zebrafish (D. rerio) e verrà quindi richiederà più pesce per isolare da per una corretta semina.
- Sigillare piastre con nastro laboratorio e posto in incubatrice refrigerazione alla temperatura appropriata. PPM di tutte le specie qui elencate (salvo per i topi), possono essere incubate in condizioni atmosferiche normali senza anidride carbonica (CO 2) integrazione. (Vedi Tabella 7).
- ALTERNATIVA: Alcuni laboratori hanno adottato un protocollo che richiede permettendo PPM di aderire al substrato di coltura per 40 minuti.
- Poi risciacquare piastre con mezzi di lavaggio per rimuovere eventuali cellule debolmente attaccate e non aderenti. Attenzione: Questo passaggio è molto importante per evitare l'adesione "non-specifico" di altre cellule (ad esempio fibroblasti) alla substrati cultura.
- Aggiungi mezzi di comunicazione completi e cellule posto in incubatrice e la cura per come di seguito dettagliato.
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Representative Results
Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule precursori miogeniche (PPM) devono essere visibili attaccato al substrato laminina (vedi figure 1a e 1d). Dopo la semina, le cellule (PPM) adottano una forma mandrino-like, indicativa di questo tipo di cellule (figura 1) e sono MyoD1 + (Figura 2). Nelle specie Danio, PPM sembrano essere più compatto, con piccoli processi bipolari che fanno PPM da Oncorhynchus e Salmo specie. Tuttavia, più di quattro giorni di cultura, PPM di tutte le specie piscine esaminate adottano simili morfologie e guardare distintamente come mioblasti (figure 1b e 1d). Supporti completi dovrebbero essere rimossi, e MPC devono essere lavati due volte con mezzo di lavaggio. Miofibroblasti possono contaminare culture miogenici e sono facilmente distinguibili dalle PPM / mioblasti dalla loro morfologia simile ad una stella (contro la forma del mandrino del mioblasti). Lavaggio delle piastre notevolmente improves la rimozione di tali fibroblasti.
Nella specie qui descritte (cfr. tabella 7), i cambiamenti dei media quotidiana producono i migliori risultati. PPM e progenie (mioblasti e miotubi nascenti) devono essere lavati una volta o due volte prima dell'aggiunta di mezzi freschi completi. In alternativa, le modifiche di supporto possono essere ridotti per ogni altro giorno dopo che le cellule hanno raggiunto la fase mioblasti definitivo (circa 4 giorni di coltura). Miotubi dovrebbero costituire entro 2-3 giorni (figure 1c e 1f) e possono essere miogenina + (Figura 2), in particolare quando coltivate in terreno di differenziamento (vedi sotto). Mentre i periodi di settimane o mesi sono stati segnalati in diverse specie di mammiferi, PPM piscine e mioblasti non sembrano tollerare tali periodi di tempo. Cellule proliferano per i primi sei giorni di coltura (Figura 3), con conseguente differenziazione tra 7 e 9-11 giorni di coltura. In seguito, le cellule senescenza o unpoptose.
Il miogena di MPC e la loro progenie isolati usando questo protocollo è stato determinato 3,32,33 basato su espressione genica. A differenza dei sistemi di coltura mammiferi, proliferazione di PPM e mioblasti progenie è relativamente bassa durante i primi giorni della cultura (rispetto ai sistemi che utilizzano mioblasti murini primari o C2C12), con un rapido aumento rilevati come le cellule formano miotubi immature durante i giorni 6-9 della cultura in Danio specie 32. Rapporti da trota iridea hanno utilizzato un mezzo di differenziazione (comune nelle culture mioblasti mammiferi, ma non necessaria nei sistemi di piscine) e indicano che gli indici di proliferazione diminuiscono come previsto con myotube formazione di 33. Nelle nostre mani, i miotubi risultanti possono rimanere in coltura per un massimo di 9-11 giorni (specie Danio) e 11-13 giorni (specie Oncorhynchus) prima che si verifichi la senescenza e l'apoptosi cellulare.
| Reagente | Società (Preferred v. Alternate) | Numero di catalogo (Preferred v. Alternate) | Quantità per la cultura |
| γ-irradiati poli-L-lisina | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (alto glucosio) | Sigma-Aldrich (Cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| Antibiotico / antimicotica | Thermo Scientific (SIgma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 ml |
| Gentamicina solfato | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 ml |
| Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 ml |
| Fetale bovino Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 ml |
| Collagenasi (tipo IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| Tripsina (da Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
Tabella 1. Lista dei reagenti dettagliato con il produttore preferito e il numero di catalogo.
| Consumabili | Strumenti | Apparecchiatura |
| Piastre di coltura cellulare | Pinze (Coarse) | Pipettor sierologica |
| 50 sterile ml provette coniche | Pinze (Fine) | pH Meter |
| Laboratorio Tape | Maniglie bisturi | Chilling Incubator (Echotherm) |
| 0.2 micron di vuoto Sistemi di sterilizzazione | Lame di bisturi (# 10, # 11) | Laminar Flow Hood |
| Idrorepellente Autoclave carta | Forbici chirurgiche | Vacuum Manifold |
| Pipette sierologiche | Piatti di vetro Petri | Microosmolality Meter |
| 12-16 G cannule con Luer Locks |
Tabella 2. Materiali di consumo, strumenti e attrezzature necessarie per la coltura cellulare.
| Piatto Size | cm 2 per Bene | Poli-L-lisina * | Laminin ** |
| 6 ben | 9.5 | 1.6 ml | 1 |
| 24 ben | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 ben | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96 ben | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| * Concentrazione 0,1 mg / ml | ** Concentrazione di 0,020 mg / ml |
Tabella 3. Ottimizzato volumi per il rivestimento di piastre di coltura cellulare con poli-L-lisina e laminina.
| Reagente | Isolamento | Wash | Dissociazione | Integrale |
| Piano Base | 419,25 ml | 395,40 ml | 297,00 ml | 178.00 ml |
| PSF * | 5.00 ml | 4.00 ml | 3.00 ml | 2.00 ml |
| Gentamicina solfato ** | 0,75 ml | 0.60 ml | - | - |
| Donor Equine Serum | 75.00 ml | - | - | - |
| Siero fetale bovino *** | - | - | - | 20.00 ml |
| * PSF: penicillina / streptomicina / fungizone cocktail (100x); ** 50 mg / ml di concentrazione; Caratterizzato *** |
Tabella 4. Differenti preparati multimediali per l'isolamento e la coltura di cellule precursori miogeniche (PPM).
| Piatto Size | cm 2 per Bene | Diluizione | Placcatura Volume |
| 6 ben | <td> 9.51.5 - celle 2.0 x 10 6 / ml | 1 ml | |
| 24 ben | 1.9 | 1.5 - celle 2.0 x 10 6 / ml | 250 microlitri |
| 48 ben | 0.95 | 1.5 - celle 2.0 x 10 6 / ml | 150 microlitri |
| 96 ben | 0.32 | 1.5 - celle 2.0 x 10 6 / ml | 50-100 microlitri |
Tabella 5. Diluizioni consigliate e volumi placcatura di cellule piastra di coltura taglia bene.
| Specie | # Cellule / g di tessuto medio |
| Danio rerio | 6.400.000 |
| Danio dangila | 1.783.000 |
| Devario Aequipinnatus | 1.797.000 |
| Oncorhynchus mykiss | 66.800 |
. Tabella 6 Numero medio di cellule precursori miogeniche isolate da 1 grammo di tessuto muscolare da diverse specie di teleostei: Danio rerio (pesce zebra), Daniodangila (moustacheddanio), Devario Aequipinnatus (danio gigante), e Oncorhynchus mykiss (trota iridea).
| Specie | Temperatura |
| Danio / Devario spp. | 26 - 28 ° C |
| Oncorhynchus / Salmo spp. | 10 * - 18 ° C |
| Ambystoma mexicanum | 18 ° C |
| * Temperature inferiori supportano velocità di proliferazione più bassi. |
Tabella 7. Positiva temperature di incubazione per le piscine e anfibi p miogenacellule recursor (PPM).
Figura 1. Immagini rappresentative luminose campo di PPM (più a sinistra), i mioblasti (al centro), e nei primi miotubi (più a destra) da due specie, la trota iridea (Oncorhynchus mykiss, in alto) e zebrafish (Danio rerio, in basso).
Figura 2. Rappresentante colorazione immunocitochimica di PPM (a, c) e miotubi (b, d) isolati e coltivati da gigante Danio (Devario Aequipinnatus, in alto) e la trota iridea (Oncorhynchus mykiss, in basso). Nella cultura, mioblasti sono MyoD1 + positive (a, c)come visualizzato utilizzando anticorpi disponibili in commercio MyoD1 + (danio: C-20, Santa Cruz Biotechnology, trota: NB100-80899, Novus Biologicals). Inoltre, come mioblasti differenziano, esprimono miogenina (b, d) come visualizzato utilizzando anticorpi disponibili in commercio Myogenin (danio: M-225; trota: SC-567, entrambi da Santa Cruz Biotechnology).
Figura 3. Dati proliferazione cellulare rappresentativi con BrdU per misurare i tassi di proliferazione delle cellule nel tempo, nella cultura. I dati ottenuti da PPM isolate e coltivate da gigante danio 67.
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Discussion
Il programma miogenico, in qualsiasi specie esaminate, può essere più facilmente studiata attraverso un sistema in vitro. Infatti, sull'isolamento, cellule precursori miogenici (PPM) in pesci o cellule myosatellite (MSC) nei mammiferi facilmente entrare in questo processo altamente regolato che coinvolge la proliferazione, ritiro ciclo cellulare e differenziazione terminale dei mioblasti e la fusione di questi mioblasti in miotubi nascenti. La generale mancanza di ceppi transgenici gene reporter di specie piscine (con la possibile eccezione del zebrafish 67 e trota arcobaleno 69) vincola in opera vivo dell'attivazione MPC / MSC, proliferazione e differenziazione, e quindi il sistema in vitro qui presentato è un piattaforma interessante per gli studi in specie ittiche.
Cultura di successo di MPC / MSC, non importa la specie, dipende in larga misura a) rigorosa attenzione alla sterilità; b) completa dissociazione meccanica del muscolo scheletrico temissione; ec) l'ottimizzazione della digestione enzimatica. Durante le fasi iniziali di isolamento tessuto muscolare, è necessario prestare attenzione a garantire che la quantità necessaria di tessuto viene asportato senza contaminazioni. E 'della massima importanza che il pesce (o qualsiasi animale stati utilizzati, in questo caso) siano opportunamente disinfettati in etanolo al 70% e per un tempo sufficiente. Nelle nostre mani, 30 secondi funziona meglio; brevi periodi di tempo può provocare la contaminazione e più a lungo, la perdita di integrità del tessuto e la vitalità cellulare. L'etanolo può essere utilizzato come fissativo, quindi bisogna fare attenzione a non disidratare il pesce prima dissezione. Dissezione può essere fatto al di fuori di una cappa a flusso laminare coltura cellulare; Tuttavia, si raccomanda che tale processo essere fatto all'interno di una cappa per ridurre al minimo ogni potenziale contaminazione batterica o fungina.
Mentre la dissociazione meccanica sopra descritto può sembrare grezzo e / o noioso all'inizio, è fondamentale per la procedura di isolamento. Due grandi lame di bisturi, passato tiratol'altro in un movimento di scorrimento (come mostrato nel protocollo video), produce i risultati migliori. Una volta terminata, la consistenza del omogeneizzato dovrebbe essere quello di un impasto o di purea, e facilmente raccolto con una pipetta sierologica wide-bore (cioè 25 ml). Semplicemente, la migliore è la dissociazione meccanica, maggiore è il / MSC resa MPC e migliore la coltura risultante. Scarso dissociazione ostacolerà la digestione enzimatica e diminuire la resa delle cellule. Anche se può essere tentati di considerare, l'uso di omogeneizzatori tessuto elettrici abbassa drasticamente la vitalità cellulare nonostante la sua convenienza ovvio, almeno con MPC piscine.
Come con tutti i protocolli, ottimizzazione della procedura sopra descritta è spesso necessario. Ciò è dimostrato vero nel nostro lavoro con diverse specie danionin. I risultati del nostro laboratorio indicano che danionins più piccoli (ad esempio, il pesce zebra) producono più PPM per grammo di muscolo scheletrico di quanto non facciano le specie più grandi (ad esempio giDanio formica o baffi). Tuttavia, questo si realizza solo se una maggiore concentrazione di collagenasi (0,3%) viene usato con il tessuto da specie più piccole. Nelle nostre mani, una concentrazione dello 0,2% è appropriato per le specie di salmonidi (es. trota arcobaleno, trota spietata [Oncorhynchusclarki], salmone Chinook [Oncorhynchustschawytscha]), i danionins più grandi, Axolotl (Ambystomamexicanum) degli arti e della coda, e anche il mouse muscolo scheletrico. Analogamente, bisogna fare attenzione a selezionare la collagenasi appropriato. Nella nostra esperienza, di tipo IV collagenasi conserva la vitalità cellulare molto meglio di collagenasi raccomandate per i tessuti fibrosi come ossa e muscoli (cioè collagenasi di tipo II) 70. Mentre digestione può essere più completa in un periodo di tempo più breve, integrità recettore di membrana cellulare è probabilmente compromessa da una maggiore attività tripsina in queste preparazioni. Per quanto riguarda la tripsina, il nostro laboratorio ha sempre utilizzato il più crudo tripsina preparazione purified da pancreas suino, piuttosto che i preparativi 'puri' disponibili. Nelle nostre attività culturali con varie specie, abbiamo notato un effetto benefico di concentrazioni variabili tripsina.
Triturazione è fondamentale per questo protocollo. E sia dissocia matrice fibrosa del muscolo scheletrico e aumenta superficie per digestione con tripsina per tutto il tempo interrompendo manualmente l'integrità strutturale delle miofibre. Quando si eseguono le triturazioni, successivamente con pipette diametri più piccoli e cannule è molto più facile che usare la cannula e la siringa subito. Procedendo direttamente triturazioni con una cannula e la siringa può provocare cannule collegate e / o eccessiva pressione applicata alle cellule. Applicando la digestione trittico senza un'adeguata triturazione ridurrà drasticamente le rese delle cellule.
Una volta isolato, il processo di cultura è abbastanza semplice. La maggior parte delle pubblicazioni ad oggi hanno utilizzato uno spirito protocolloh un supporto sia per la proliferazione e la differenziazione 33,71-75, compreso il nostro; Tuttavia, gli articoli più recenti scritti da vari ricercatori francesi hanno descritto un protocollo di due mezzi, con i media basati separate e contenuti siero per la proliferazione e differenziazione 33. Questo protocollo 'recente' imita più molto attentamente quelli utilizzati nella coltura delle MSC murine e myoblastsand sembra aumentare la proliferazione dei primi mioblasti stadio 33 e può essere più appropriato per controllare la proliferazione e / o la differenziazione di cellule. Tuttavia, senza una caratterizzazione di espressione genica, è difficile concludere se tale media 'proliferazione' conserva anche una più stato 'mioblasti-like' che fa la metodologia di una media tradizionali. Pubblicazioni precedenti descrivono l'espressione genica, sia a livello di trascrizione o proteine, trasmessi utilizzando il protocollo tradizionale un supporto 3. In alternativa, un unico supporto (DMEM qui descritto) può essere integrato con diverse concentrazioni di siero bovino fetale (FBS): 10% per la proliferazione e 2% di differenziazione.
Mentre gli investigatori impiegano sistemi di colture cellulari di mammifero possono essere acclimatati con atmosfere di biossido di carbonio per la coltivazione di queste cellule, le differenze intrinseche tra chiamata scambio di gas terrestre e acquatico per un approccio diverso quando la coltura di piscine o le celle urodèle confinati acquatici, tra cui PPM. Media qui descritti sono tamponati con un piperazinici-derivati, anfoionici composti organici [HEPES: 4 - acido (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico] e bicarbonato di sodio (NaHCO3). Così, un incubatore con iniezione di gas non è necessario o richiesto per coltura di queste cellule. Ancora più importante, questi incubatori devono possedere la capacità di raffreddare piuttosto che di calore, come le temperature necessarie per la cultura piscine e urodèle PPM comprese tra 18-26 ° C. Inoltre, PPM salmonidi possono essere cultured a temperature più basse, se necessario, evidenziando ulteriormente la necessità di un incubatore raffreddamento. Inoltre, abbiamo trovato (come hanno fatto altri ricercatori, come comunicato in precedenza), che di tenuta di piastre di coltura è necessario per preservare la vitalità cellulare. Semplicemente avvolgendo l'interfaccia tra il coperchio e la piastra di coltura con nastro laboratorio standard è sufficiente per realizzare questo obiettivo.
Mentre passaging di entrambi i PPM / MSC / mioblasti primari è comune in colture cellulari di mammifero, non sembra essere possibile con le cellule piscine, almeno prima della fase Mb tardi (intorno al giorno 6, della cultura). Pertanto, il numero appropriato di cellule sufficiente per sostenere la proliferazione e per raggiungere gli obiettivi dell'esperimento deve essere seminato alla apertura della cultura. Inoltre, se si ottengono meno del previsto produzioni di cellule, non è possibile propagare cellule e poi replate progenie tardi. Abbiamo attribuito questo caratteristica per la maggiore dipendenza dal extracellularematrice lular (ECM) di piscine MPC / mioblasti. In alternativa, è possibile che questo è un artefatto del substrato laminina e così ulteriormente empirica determinazione dei componenti ECM necessari per piscine MPC / Mb proliferazione e la differenziazione è giustificata. Facciamo notare, tuttavia, che molti dei nostri collaboratori hanno rimosso con successo mioblasti in ritardo-fase (~ 6 giorni di cultura) dal substrato culturale e ripiastrate queste cellule (JM Froehlich e PR Biga, comunicazione personale).
Usando questo protocollo o uno simile a esso, una sperimentazione che coinvolga RT-PCR 3,71-74,76-78, Western Blot 32,79-81, immunocitochimica 32,33, saggi di proliferazione 32,33,59, trasfezione genica 15, morfometrica Analisi 78, tossicologia di screening 82, e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP, JM Froehlich e PR Biga, risultati non pubblicati) è stato fatto. Tuttavia, ulteriori descrizioni di ulteriori in vitprotocolli ro, vale a dire quelli che coinvolgono passaging e la propagazione clonale, sono molto necessari. Infatti, il laboratorio Rodgers 15 ha fatto significativi progressi nella cultura di piscine PPM / mioblasti ottimizzando un protocollo per indurre trasfezione di arcobaleno mioblasti trote. Sulla base di tale metodologia, ulteriori indagini coinvolgono RNAi o sovraespressione di obiettivi specifici muscolo-scheletrico, in particolare quelli postulato di essere coinvolti con le traiettorie di crescita per tutta la vita di pesci teleostei, non solo sono possibili, ma può portare a significativi progressi nel settore dell'acquacoltura e biomedico della scienza.
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Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano estendere molte grazie al Drs. Josep Planas e Juan Castillo per le loro competenze professionali per lo sviluppo e l'applicazione di questo protocollo cultura di piccoli pesci e anfibi. Un ringraziamento anche a causa delle innumerevoli persone che hanno instancabilmente assistito con la dissezione e la dissociazione del tessuto muscolare da molti pesci (sia nelle specie e numero), tra cui Matthew ricarica, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, e Sinibaldo Romero. Questo lavoro è stato sostenuto da University of Alabama a Birmingham Dipartimento di fondi di start-up Biologia, Centro per la Ricerca proteasi NIH di Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS di Grant # R03AR055350, e NDSU Advance AVANTI NSF di Grant # HRD-0.811.239 di PRB. Il sostegno è stato fornito anche dalla UAB Nutrition Obesity Research Center di aggiudicazione # P30DK056336, NIH NIDDK. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamenterappresentano la posizione ufficiale del NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. Detailed Reagent Information | |||
| Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture |
| γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL |
| Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL |
| Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| Table 2. Consumables, Tools and Equipment | |||
| Consumable | Tools | Equipment | |
| Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | |
| Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | |
| Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | |
| 0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | |
| Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | |
| Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | |
| 12-16 G Cannulas with Luer Locks | |||
| Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** |
| 6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 |
| 24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| *0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | ||
| Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | |||
| Reagent | Isolation | Wash | Dissociation |
| Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL |
| Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | - |
| Donor Equine Serum | 75.00 mL | - | - |
| Fetal Bovine Serum*** | - | - | - |
| * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | |||
| Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume |
| 6 well | 9.5 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 1 mL |
| 24 well | 1.9 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 250 μL |
| 48 well | 0.95 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 150 μL |
| 96 well | 0.32 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 50-100 μL |
| Table 6. Average number of cells per g tissue | |||
| Species | Average # cells/g tissue | ||
| Danio rerio | 6,400,000 | ||
| Danio dangila | 1,783,000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66,800 | ||
| Table 7. Recommended Incubation Temperatures | |||
| Species | Temperature | ||
| Danio/ Devario spp. | 26 - 28 °C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* - 18 °C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18°C | ||
| * Lower temperatures support lower proliferation rates. | |||
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