Summary
체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.
Abstract
때문에 생체 내에서 근육 조직 프로그램을 공부와 관련된 고유의 어려움과 시간, 골격 근육의 주민 성체 줄기 세포에서 파생 된 주 문화 시스템은 근육 조직 전구 세포 (MPC를)은 포유 동물의 골격 근육 발달에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다 성장. 특히 척추 동물의 기초 분류군 사이에서, 그러나, 데이터는 자기 갱신, 확산 및 MPC와의 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 설명하는 제한됩니다. 특히 관심을 부속 기관 손실 (즉, urodele 양서류) 다음과 같은 상당한 치하의 골격 근섬유 세포의 증식 (즉, 경골 어류) 및 완전 재생을 받아야하는 기초 척추 동물의 능력을 기초 잠재적 인 메커니즘이다. 또한, 배양 된 근육 아세포의 사용은 재생 및 근육 조직 프로그램 재현부와 그들 사이의 차이의 이해를 도울 수있다. 에이 말은, 우리는 세부 사항에 강력하고 효율적인 프로토콜을 설명 (및 유사 안에) 더 많은 시작, 근육 조직 프로그램의 진화를 이해하기위한 플랫폼으로 세포 배양에서, MPC는 그들의 자손, 근원 세포와 미성숙 myotubes을 분리하고 유지 기초 척추 동물. 제브라 피쉬 (다니오 rerio)의 모델 생물의 상태를 대문자로, 우리는 잉어 clade의 Danioninae의 작은 물고기에이 프로토콜의 응용 프로그램에보고합니다. 탠덤,이 프로토콜은 멕시코 Axolotl의 (Ambystomamexicanum)에서도 실험실 설치류에서 MPC를 분리하여 넓은 비교 방법을 실현하는데 사용된다. 이 프로토콜은 현재 널리 무지개 송어, 연어, 도미 1-4 등 여러 물고기 종에 근육 생성을 연구하는 데 사용됩니다.
Introduction
포유 동물의 근육 생성의 상당한 이해 C2C12 5, 모두 기본 마우스 (뮤스 musculus)의 근 모세포 문화와 잘 설명 마우스 유래 세포주에이 과정의 반복 설을 통해 얻을 수있다. 1950 년대 6 년부터이 문화가 다른 척추 동물의 확장, 근육 생성에 의해, murinemyogenic 프로그램의 이해에 많은 발전을 주도하고있다. 또한, 하나의 세포 근섬유 이식편 기술은 위성 세포와 주변 근섬유 7-9 사이의 상호 작용에 대한 이해를 증가하고있다. 세포 배양은 근육 생성의 조사에 특히 인해 짧은 시간에 전구체로부터 분화 된 세포 10, RNAi를위한 형질의 상대적 용이성 11 ~ 14, 15, 16 및 과발현 형질 전환 연구 14,17,18, 체외에서 생체 이식 18 ~ 20 다음에 확장, 심지어 샘플분류군 (21, 22)에서, 근원 전구 세포와 그 통제 요원의 Arison는. 때문에 문화 시스템의 인공 환경에 차이가 5,23을 설명 하였지만, 이러한 생체 시스템은 다핵의 형성을 지배하는 복잡한 프로그램을 우리의 해부에 필수적인적일 수있다, 말기 차별화 된 myofibersfrom는 myosatellite로 알려진 증식 전구 세포를 mononucleated 포유 동물 사이 세포 (중간 엽 줄기 세포).
클래스 포유의 이상으로, 그러나, 근육 생성을 제어하는 메커니즘의 보존 및 / 또는 분기 저조한 인해 크게 다양한 생물 군에서 근육 조직 전구 세포 (MPC를) 및 근육 아세포를 배양의 어려움으로 이해된다. 사실, 기본 근원 세포 배양은 3 새 24 ~ 26, 하나의 파충류 (27), 몇 양서류 28-30, 일부 물고기 1,3,4,31-33에 설명되어있다. 했습니다에서 연속 근육 조직 세포 라인설치류 34-36 이외의 rtebrates 일본 메추라기 (Cortunix 자포니카)에서 파생되는 유일한 비 포유 동물의 근육 조직 세포 라인, QM7 37 더욱 드물다. 불멸화에서 많은 시도에도 불구하고, 경골, 근원 세포 라인은 애매 남아 이러한 세포의 효율적인 형질 전환을위한 프로토콜은 올해 15 출판되었다. 따라서, 척추 동물의 다양한 기본하여 MPC와 근육 아세포를 배양하기위한 명확하고 잘 최적화 된 프로토콜은 매우 더 근육 조직 프로그램의 진화에 대한 우리의 지식을 확장 할뿐만 아니라에서 돌파구를 만들기 위해 비교 생리학의 힘을 사용하는 데 필요한 인간 골격근 질환 및 장애의 치료.
문학은 MPC / 근원 세포 분리 38-49의 많은 보고서가 포함되어 있지만, 그것은 저자는 간단한 종종 불완전, 형식 등의 절연 부에 대한 프로토콜을 설명하는 일반적입니다. 또한, 대부분의 교훈 프로토콜 REPOrted 쥐 50-53를 위해 개발되었으며, 이들 중 일부는 이러한 프로토콜을 사용할 수 없게하거나 근육의 생물 학자에 의해 이용 허무 가장 깊은 비 설치류하고, 항체의 선택 (54, 55) 또는 형광 형질 전환 유전자 56, 57에 의존하고 있습니다. 시청각지도와 함께와 관계가 먼 종에서 입증 효율성을 설명 셨나요, 양서류 및 파충류 근육 생성, 상세하고 철저한 프로토콜에 대해 거의 알려진으로, 현장에 가장 도움이 될 것입니다.
1989 58 파월과 동료에 의해 설명, 다음과 같은 프로토콜은 처음에 (즉, 무지개 송어, mykiss 앙 코링, 대서양 연어, 살모 살라) 연어과 물고기와 몇 가지 큰 cyprinids (즉, 금붕어, Carassiusauratusauratus)에서 MPC를하고 근육 아세포를 분리하기 위해 개발되었다 . 2000 년 Fauconneau 및 Paboeuf 무지개 송어 (59)에 대한 기본 근원 세포 배양을 최적화하고, minoroptimizations 엄마Danioninae의 clade의 (제브라 피쉬, 다니오의 rerio, 거대한 다니오, Devario aequipinnatus)으로 인해 제브라 피쉬의 작업에 사용할 수있는 다양한 유전 적 도구 (32)와, 따라서 그것의 가까운 친척의 여러 개의 작은 미노의 utilizable 해당 프로토콜 데. 경골 어류로 인해 (적어도 대부분의 종에서) 자신의 분기 성장 전략 연구를위한 매력적인 생물이다. 큰 연어류, 대부분의 물고기처럼, 심지어 나이 60 ~ 62 년 만기에 점근선으로 자유롭게 성장 잠재력 indeterminately 성장. 제브라 피쉬는 달리, 같은 거대한 다니오 (63)와 경골 어류의 일반적인 moustached 다니오 디스플레이 성장 잠재력, 자신의 직접 병렬 MPC 세포 운명의 선택이 비대 대 골격 근육 세포의 증식에 중요한 역할을 담당하고 있는지 이해를위한 이상적인 플랫폼으로 큰 danionins.
마찬가지로, 우리는 상대적으로 높은 세포 수율과 viab으로,이 프로토콜은 마우스와 axolotls와 함께 사용할 수 있다는 것을 증명하고있다ility 지수. 이러한 멕시코 Axolotl의 (Ambystomamexicanum) 등 Urodele 도롱뇽은 전체 사지와 꼬리 64-66 등의 조직을 재생하는 놀라운 능력을 가지고있다. 이 특성은 골격 근육 낭비하고 노화의 이러한 양서류 흥미로운 모델을 만든다. 이러한 연구에도 넓은 비교 컨텍스트를 제공 많은 어종에서 수행 한 바와 같이 아래에 설명 된 프로토콜을 사용하여, 유사한 방식이 수행 될 수있다. 많은 진정으로 비교 생물학 데이터 (여기에서, 전체 척추 동물의 혈통) 넓은 스펙트럼 내에서 분석 할 때 기초 생물학 및 번역 상 생물 의학에서 가장 의미있는 발전 할 수있다, 감사합니다.
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Protocol
윤리 문 : 여기에 설명 척추 동물을 포함한 모든 실험은 버밍햄에 위치한 앨라배마 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 사전 승인 및 실험 동물 복지, 미국 국립 보건 연구소의 사무실에 의해 설립 된 가이드 라인과 일치했다 보건 복지부.
문화 1. 준비
- (2 L 당 26.96 g 13.48 g / L) 9 mM의 탄산 수소 나트륨 (2 L 당 1.51 g), DMEM에서 20 mM의 HEPES (2 L 당 9.53 g)을 다음과 같이 기본 매체를 준비합니다.
- 산도를 결정하고 염산 또는 수산화 나트륨과 7.40로 조정합니다.
- 삼투압을 결정하고 (필요한 경우) NaCl로 ~ 300 mOsm로 조정합니다.
- 필터는 최대 2 ~ 3 개월 빛으로부터 보호 4 ° C에서 (2) 1 L의 진공 살균 시스템과 저장소를 사용하여 소독.
참고 : 전체 시약 표 1과 표 2를 참조, 도구, consum의당했을 및 장비 정보를 제공합니다.
- 초순수 멸균 물 50 ㎖에 γ-조사 폴리-L-라이신의 5 밀리그램 (> 30 MW)를 용해하여 폴리-L-라이신 처리 접시를 준비합니다. 리신 중합체의 완전한 용해를 보장하는, 실온에서 10 분 동안 반전에 의해 부드럽게 혼합한다.
- 판형 (표 3)에있어서, 각 웰에 폴리-L-라이신 용액의 필요량을 피펫. 플레이트는 5 분 동안 층류 후드에 서 할 수 있습니다.
- 다음으로, 폴리-L-라이신 솔루션을 제거하고 멸균 물로 2 회 세척한다. 20 분 동안 층류 후드의 건조 공기 판을 허용합니다.
- 라미닌의 1 MG (Engelbreth-홀름 - 떼 원점)를 얻어 20 μg / ML의 최종 농도에 기초 배지 50 ㎖에 용해. / cm 2 μg에 폴리-L-라이신 처리 된 세포 배양 접시에 라미닌 솔루션을 적용합니다. (다른 접시 크기의 표 3 참조)
- 부드럽게 쿵푸을 보장하기 위해 솔루션을 소용돌이적용 잘거야. 24 시간 동안 실험실 테이프와 인큐베이터에있는 장소 플레이트를 밀봉. 인큐베이터는 사용되는 종에 적합한 온도 (표 7 참조)로 설정되어야하고, 추가 가스 배양기에 첨가 할 필요가 없다.
참고 : 라미닌이 세포를 파종하기 전에 24 시간 동안 플레이트에 부착 할 수 있어야합니다. 이렇게하는 실패는 세포 부착에별로 발생합니다. - 표 4에 설명 된대로 미디어를 준비합니다. 완료 미디어는 최고의 사용의 하루를 준비한다.
- 조직 분리를위한 준비에서 다음 항목과 오토 클레이브 조립 : 300 ~ 500 ㎖의 비이커 (들); 유리 페트리 접시; 메스 핸들; 집게 (미세하고 거친); 해부 가위; 물 방수제 오토 클레이브 종이를 여러 장.
참고 : 해부 과정을 지원 각 사람의 경우, (2) 메스 핸들, (1) 집게 (유형은 개인의 취향에 따라), (1) 해부 가위, 물 방수제 오토 클레이브 용지 (5 ~ 10) 시트는충분. - 상기 멸균 항목 이외에, 70 % 에탄올, 중량 밸런스, 멸균 50 ㎖ 원추형 튜브 (번호 배양 크기에 의존한다), 그리고 얼음을 조립한다.
2. 조직의 해부
- 시작하기 전에, 물고기의 충분한 재고를 사용할 수 있는지 확인합니다.
참고 : 사용하는 물고기의 나이는 매우 중요합니다. 두 개의 서로 다른 종의 물고기가 비슷한 무게의 수 있지만, 한 종의 어린 물고기는 다른 종의 이전 물고기보다 더 MPC를 소유합니다. 일반적인 규칙, 연어류 작업, 특히 어린 물고기로, 최고입니다. 나이 4~6개월 이하 (최대 15 g)을 연어류 최적 동안 danionins를 들어 일년만큼이나 오래된 생선, 최적 이용 될 수있다. - 멸균 50 ML 원뿔 관에 격리 매체의 나누어지는 25 ML을 해부하는 조직의 각 5g하십시오.
- 기록 질량 및 숫자 튜브 (들)의 무게. 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 2 ~ 3 물고기를 안락사> 300 ㎎ / L 중탄산 나트륨 - 완충 tricaine 메탄에 침수시. > 5 분 동안 정지 한 다음 30 초 동안 (멸균 비이커에 포함) 70 % 에탄올에서 물고기를 물속에 가라 앉히다하는 아가미 운동을 할 수 있습니다.
- 70 % 에탄올에서 물고기를 제거하고 물 방수제 오토 클레이브 용지에 배치합니다. 직접 너덜 거림 뒤에, 표면, 얕은 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 상기 절개의 피부를 잡고 비늘과 피부를 제거하고 물고기의 꼬리쪽으로 잡아 당깁니다.
- 피부를 제거 후, epaxial, 양쪽에서 물고기의 빠른 당분 '화이트'근육 (옆 선 근처에있는 느린 산화 '빨간색'근육을 방지) 및 절연 매체에 자리를 절제. 기관에 의해 요구되는 어류의 나머지를 버린다.
참고 : epaxial m에서 격리는 빨간색 근육에서 발생하는 문화 MPC를 전적으로 가능하지만, 경골하여 MPC를 사용하여 거의 모든 출판물 활용했다 세포yotome. - 근육의 충분한 양을 얻을 때까지 반복 2.4-2.6 단계를 반복합니다. 해부 동안 풀링 된 근육 조직은 세포 생존을 유지하기 위해 얼음에 남아 있는지 확인합니다.
3. 기계 해리
- 유리 페트리 접시에 근육 조직 25 ㎖ / 5 g을 하나의 튜브를 붓는다. 두 메스를 사용하여 첨부와 # 10 메스 블레이드, 슬러리 또는 퓨레 일관성을 말하다 조직으로 처리합니다. 서로 과거 메스 블레이드를 당기는 "전후"운동이 가장 적합합니다.
주 : 조직 균질 적절한 보이지만 폐지되지 않은 경우, 생존 세포의 수를 극적으로 감소 될 것이다. - 25 ㎖ 혈청 피펫 혈청학 피펫을 사용하여, 슬러리 화 조직을 제거하고 원래의 원뿔형 튜브에 교체한다.
- 모든 튜브의 모든 조직이 기계적으로 해리 될 때까지 반복 3.1-3.2 단계를 반복합니다.
- 300 XG에서 5 분, 10 ℃에서 원심 분리 조직
- FOLL원심 분리 때문에, 25 ㎖의 혈청 피펫, 진공 흡입기, 또는주의 디캔팅로와 미디어 상층 액 25 ㎖를 폐기합니다.
- 각 튜브에 resuspend 조직에 세척 매체의 25 ML을 추가, 상기와 같이 recentrifuge.
- 상층 액을 각 시간을 제거, 세척 매체로 두 번 씻으십시오.
4. 효소 해리
- 3.4 단계 동안 (0.11 g/0.22 ML 또는 충분한 양의) 유형 IV 콜라게나 제의 0.22 g의 기본 매체의 44 ML을 결합하여 콜라겐 분해 효소 용액을 제조.
- 4 ℃에서 10 ~ 15 분 비커에 저어 필터는 50 ML의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터로 살균.
참고 : 하나 이상의 주사기 필터는 콜라게나 준비에 따라 필요할 수 있습니다. 워딩 턴 생물 이외의 공급 업체로부터 얻은 콜라게나 여과하는 동안 더 어려움을 포즈. 콜라는 endomysium을 구성하는 콜라겐 펩타이드 결합을 해리하는 데 사용됩니다. 이소화는 근섬유의 보호 장벽을 제거합니다. - 근조직의 각 g를 들어, 0.2 % 콜라게나 제 용액에서 조직을 재현 탁. 근육 조직의 5g를 들어, 콜라게나 제 용액 10 ㎖ 및 기본 매체의 15 ML을 추가합니다.
- 콜라게나 솔루션 /베이스 매체 (25 ㎖에 예를 들어, 250 μL)의 ML 당 PSF의 10 μl를 추가합니다. 이 소화 효소의 효율성에 영향을 미치기 때문에, 조직이 잘 중지되어 있는지 확인합니다.
- 부드러운 락을 18 ° C에서 60 분 콜라의 근육 조직을 품어. 이 세포 생존에 영향을 미칠 수 있지만, 기계적 해리 종의 정도에 따라, 콜라게나 제 소화가 90 분으로 연장 될 수있다.
- 12 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 콜라게나 제 소화, 원심 분리기 원뿔 튜브에 따라 세척 매체의 25 ML에 뜨는에 resuspend 조직을 폐기하십시오.
- Recentrifuge 5 분 동안 300 X g에서 12시6, C. 세정 매체를 두 번 반복합니다.
- 세척 조직 두 번, 10 ㎖ 혈청 피펫 세척 매체 씹다 25 ㎖에 재현 탁의 근육 조직은 조직 / 매체 균질 상대적으로 쉽게 피펫 안팎으로 통과 할 때까지 한. 5-10 triturations은 일반적으로 충분하다.
- 5 ㎖ 혈청 피펫 다음 주사기에 부착 된 16 게이지 금속 캐 뉼러와 함께 반복합니다.
- 12 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기 원뿔 튜브 뜨는을 가만히 따르다.
- 상기 5 분 동안 원심 분리, 기초 배지 5 ㎖로 트립신 0.25 g을 조합하여 트립신 분해 용액을 제조 하였다.
- 10-15분 및 필터 20 ML의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터로 살균을 위해 4 ° C에서 교반.
- 원뿔 튜브를 검색하고 모든 튜브에 근육 조직의 모든 1g에 트립신 용액 100 μL와 해리 매체의 4.9 ML를 추가합니다. EXA에 대한엠플, 트립신 용액 500 μL와 근육 조직 5 g의 분리 매체의 24.5 ML을 추가합니다.
NOTE : 트립신은 기저판 근육 조직에서 전구체 세포를 분리한다 세린 프로테아제이다. - 을 Resuspend 트립신 / 해리 조직 중간으로. 18 ℃에서 20 분 동안 품어
- 12 ℃에서 1 분 300 XG에 처음 트립신 배양, 원심 분리기 원뿔 튜브에 따라
- 분리 매질 중에서 볼륨 상등액 1 부피의 농도로 분리 매체와 상청액을 조합하여 트립신을 중화. 두 번째 트립신 소화하는 동안 4 ° C에 보관하십시오.
- 조직의 나머지 펠렛으로, 반복은 첫 번째 트립신 소화에서 뜨는 / 분리 매체와 단계 4.15 다음 상층 액을 결합, 4.12-4.15 단계를 반복합니다.
- 양자 택일 : 콜라게나 트립신 digestions 세포 수율을 극대화하기 위해 결합 될 수있다. <올>
- 이를 위해, 파쇄가 용이하게 통과 할 때까지 캐 뉼러 콜라게나 제는 20 ㎖ 주사기에 부착 된 금속 (길이 10와 16 게이지 가장 적합) 캐 뉼러를 사용하여 다이제스트 씹다.
- 균질로 (단계 4.10에서 제조) 트립신 용액 500 μl를 추가하고 20 분 동안 18 ° C에서 알을 품다.
- 12 ℃에서 1 분 동안 300 XG에서 배양, 원심 분리기 원뿔 튜브에 따라
- 분리 매질 중에서 볼륨 상등액 1 부피의 농도로 분리 매체와 상청액을 조합하여 트립신을 중화.
- 두 번째 트립신 소화하는 동안 4 ° C에 보관하십시오.
- 표준 프로토콜과 같은 단계 4.18을 진행합니다.
5. 계수, 희석, 및 세포의 파종
- 단계 4.25의 최종 원심 분리 후,주의 디캔팅 또는 혈청 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 완전 배지 5 ㎖에 세포 펠렛을 재현 탁.
- 세포가 완전히 재현 탁으로, 20 μl를 제거; 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관의 세포 현탁액 및 장소.
- 트리 판 블루 염색의 5 μl를 추가하고 5 분 기다립니다. 혈구를 사용하여 생존 세포의 수를 결정한다.
- 판정시에, 필요한 농도로 세포를 희석. 경골 MPC를 가장 잘 cm 2 당 150,000-200,000 세포에 씨앗을 품고있다. 여섯 잘 도금 전략, 1.5 × 10 6 세포를 희석 - ML 당 2.0 × 10 6 충분 증식과 분화를 지원합니다.
- 폴리-L-라이신 처리, 라미닌 코팅 플레이트와 씨앗 세포를 검색합니다. (판 별 희석 및 도금 볼륨에 대한 표 5 참조). 참고 : 표 6은 다양한 경골 종에서 고립 근육 조직의 그램 당 고립 된 세포의 평균 수를 나타낸다. 무지개 송어 (O.는 mykiss) 할 제브라 피쉬 (D. rerio)보다 근육 조직의 그램 당 더 적은 MPC를 전시함으로써 적절한 시드에서 격리하는 물고기를 더 필요합니다.
- 적절한 온도로 냉각 인큐베이터에있는 실험실 테이프와 장소 플레이트를 밀봉. (마우스 저장) 여기에 나열된 모든 종에서 MPC를 이산화탄소 (CO 2)의 보완없이 대기압 조건에서 배양 할 수있다. (표 7 참조).
- 양자 택일로 일부 연구소는 MPC를 40 분 동안 문화의 기층을 준수 할 수 있도록 요구 프로토콜을 채택했습니다.
- 그런 다음, 느슨하게 부착 및 비 부착 세포를 제거하는 세정 매체와 접시를 씻어. 경고 :이 단계는 문화의 기층에 다른 세포의 "비특이적"부착 (예를 들어, 섬유 아 세포)를 방지하는 것이 매우 중요합니다.
- 인큐베이터에서 전체 미디어 및 장소 세포를 추가하고 아래에 설명 된대로에 대한 관리.
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Representative Results
주야 후 파종, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)는 (그림 1A와 1D 참조) 라미닌의 기질에 부착 볼 수 있어야합니다. 파종 후, 세포 (MPC를)이 세포 유형을 나타내는 스핀들 형상 (그림 1)를 채택하고 MyoD1 + (그림 2)이다. 다니오 종에서 MPC는이 앙 코링 및 살모 종 MPC를하는 것보다 작은 바이폴라 프로세스와보다 컴팩트 한 것으로 나타납니다. 그러나, 문화의 네 가지 일 이상은, 검사의 모든 셨나요 종에서 MPC를 비슷한 형태학을 채택하고 근육 아세포처럼 뚜렷하게 볼 (그림 1B 및 1E). 전체 미디어를 제거해야하고, MPC를 세척 매체로 두 번 세척해야한다. 근육 섬유 모세포는 근육 조직 문화를 오염시키고 (근원 세포의 스핀들 모양 대) 자신의 별과 같은 형태로 MPC를 / 아세포에서 쉽게 구별 할 수 있습니다. 플레이트의 세척 크게 나이러한 섬유 아세포의 제거 mproves.
(표 7 참조) 여기에서 설명하는 종으로, 매일 미디어의 변화는 최상의 결과를 생산하고 있습니다. MPC를하고 자손 (근원 세포와 초기 myotubes)는 이전의 신선한 전체 미디어의 추가에 한 번 또는 두 번 세척해야한다. 세포는 근원 세포 결정적인 단계 (배양 약 4 일)에 도달 한 후, 또는, 미디어 변화는 격일로 감소 될 수있다. Myotubes 2 ~ 3 일 이내 (그림 1C 및 1 층) 형성 (그림 2) + 오게 닌 수, 특히 분화 배지에서 배양 (아래 참조)해야합니다. 개월 주 기간 여러 포유 동물 종에서보고되었지만, 셨나요 MPC를하고 근육 아세포는 시간의 같은 기간을 허용하는 표시되지 않습니다. 세포 배양의 첫 번째 육일 일 7과 문화의 9-11 사이의 연속적인 분화와 (그림 3)에 대한 증식. 그 후, 세포가 노쇠하거나poptose.
MPC는 그들의 자손이 프로토콜을 사용하여 격리의 근육 조직 성격은 유전자 발현에 따라 3,32,33을 결정되었습니다. 세포가 일 문화의 6-9 중에 미숙 myotubes을 형성로 감지 급속한 증가와 함께, (주 쥐의 근육 아세포 C2C12를 이용하여 시스템에 비해) 포유 동물 배양 시스템과는 달리, MPC를하고 근원 세포 자손의 확산은 문화의 초기 일 동안 상대적으로 낮은 다니오 종 32. 무지개 송어의 보고서는 (포유류의 근원 세포 배양의 일반적인, 그러나 셨나요 시스템에 필요하지 않음) 차별화 매체를 활용하고 myotube 형성 (33)가 예상대로 확산 지수가 감소 표시했다. 세포 노화 또는 세포 사멸이 발생하기 전에 우리 손에, 결과 myotubes 최대 9-11일 (다니오 종)에 대한 문화에 남아 11 ~ 13 일 (앙 코링 종) 할 수 있습니다.
| 시약 | 회사 (기본 절 대체) | 카탈로그 번호 (선호 절 대체) | 문화 당 수량 |
| γ-조사 폴리-L-라이신 | 시그마 - 알드리치 (MP Biomedicals는) | P5899 (ICN19454405) | 5 MG |
| DMEM (높은 혈당) | 시그마 - 알드리치 (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| 라미닌 | BD 바이오 사이언스 (시그마 - 알드리치) | CB-40232 (L2020) | 1 MG |
| 중조 (탄산 수소 나트륨) | 피셔 과학 (시그마 - 알드리치) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C 13 H 18 N 2 O 4 S) | 피셔 과학 (시그마 - 알드리치) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| 항생제 / 항진균 | 온도 과학 (SIGMA - 알드리치) | SV3007901 (A5955) | 17 ~ 20 ㎖의 |
| 겐타 마이신 황산염 | 론자 (시그마 - 알드리치) | BW17-519Z (G1397) | 2 ~ 3 ㎖의 |
| 기증자 말 세라 | 온도 과학 (시그마 - 알드리치) | SH3007403 (H1270) | 75 ML |
| 소 태아 혈청 | 온도 과학 (시그마 - 알드리치) | SH3007103 (F2442) | 25 ML |
| 콜라게나 제 (유형 IV) | 워딩 턴 (시그마 - 알드리치) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| 트립신 (췌장에서) | MP Biomedicals는 (시그마 - 알드리치) | ICN15357125 (T5266) | 1g |
표 1. 선호하는 제조 업체와 제품 번호와 자세한 시약의 목록입니다.
| 소모품 | 도구 | 장비 |
| 세포 배양 접시 | 겸자 (일반) | 혈청 피펫 |
| 멸균 50 ML 원뿔 관 | 포셉 (파인) | ph-미터 |
| 실험실 테이프 | 메스 핸들 | 재미 보육 (Echotherm) |
| 0.2 μm의 진공 살균 시스템 | 메스 블레이드 (# 10, # 11) | 층류 후드 |
| 물 방수제 압력솥 종이 | 외과 용 가위 | 진공 매니 폴드 |
| 혈청 피펫 | 유리 페트리 접시 | Microosmolality 미터 |
| 루어 잠금 12-16 G 캐 뉼러 |
세포 배양에 필요한 표 2. 소모품, 도구 및 장비.
| 플레이트 크기 | 그럼 당 cm 2 | 폴리-L-라이신 * | 라미닌 ** |
| 6도 | 9.5 | 1.6 ML | 1 |
| 24도 | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 개 | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96도 | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| * 0.1 ㎎ / ㎖의 농도 | * 0.020 ㎎ / ㎖ 농도 |
표 3. 폴리-L-라이신과 라미닌과 세포 배양 접시에 코팅 볼륨을 최적화.
| 시약 | 격리 | 빨래 | 분리 | 완전한 |
| 기본 중간 | 419.25 ML | 395.40 ML | 297.00 ML | 178.00 ML |
| PSF의 * | 5.00 ML | 4.00 ML | 3.00 ML | 2.00 ML |
| 겐타 마이신 황산염 ** | 825 ㎖의 | 0.60 ML | - | - |
| 기증자 말 혈청 | 82,500 ML | - | - | - |
| 태아 혈청 *** | - | - | - | 20.00 ML |
| * PSF : 페니실린 / 스트렙토 마이신 / fungizone 칵테일 (100 배); * / ㎖ 농도 50 mg의; ***이 특징 |
표 4. 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 분리 및 문화에 대한 다른 미디어 준비.
| 플레이트 크기 | 그럼 당 cm 2 | 희석 | 도금 양 |
| 6도 | <TD> 9.51.5-2.0 × 10 6 세포 / ml | 1 ㎖ | |
| 24도 | 1.9 | 1.5-2.0 × 10 6 세포 / ml | 250 μL |
| 48 개 | 0.95 | 1.5-2.0 × 10 6 세포 / ml | 150 μL |
| 96도 | 0.32 | 1.5-2.0 × 10 6 세포 / ml | 50 ~ 100 μL |
표 5. 세포 배양 접시에 잘 크기 추천 희석 및 도금 볼륨.
| 종 | 평균 # 세포 / g 조직 |
| 다니오의 rerio | 6,400,000 |
| 다니오의 dangila | 1783000 |
| Devario aequipinnatus | 1797000 |
| 앙 코링 mykiss | 66,800 |
. 다양한 경골 종 근육 조직의 1g에서 분리 된 근육 조직 전구 세포의 표 6 평균 수 : 다니오 rerio (제브라 피쉬), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (거대한 다니오) 및 앙 코링 mykiss (무지개 송어).
| 종 | 온도 |
| 다니오 / Devario 종. | 26-28 ° C |
| 앙 코링 / 살모 종. | 10 * - 18 ° C |
| Ambystoma mexicanum | 18 ° C |
| * 낮은 온도가 낮은 확산 속도를 지원합니다. |
셨나요 및 양서류, 근원 P 표 7. 추천 배양 온도recursor 세포 (MPC를).
그림 1. MPC를 (왼쪽) 대표 시야 이미지, 근원 세포 (중간), 초기 myotubes (오른쪽) 두 종, 무지개 송어 (mykiss 앙 코링, 위)와 제브라 피쉬 (다니오 rerio, 아래)에서.
그림 2. MPC를 대표 면역 세포 화학적 염색 (A, C) 및 myotubes (B, D) 격리 된 거대한 다니오 (Devario aequipinnatus, 위)와 무지개 송어 (앙 코링 mykiss, 아래)에서 배양 하였다. 문화, 근육 아세포는 MyoD1 + 플러스 (A, C)이다상업적으로 이용 가능한 MyoD1 + 항체를 사용하여 시각으로 (다니오 : C-20, 산타 크루즈 생명 공학, 송어 : NB100-80899, 노부스 체액). (:; 송어 M-225 : SC-567, 산타 크루즈 바이오 테크놀러지에서 모두 다니오) 근육 아세포는 분화로 또한, 그들은 (B, D) 상용 오게 닌 항체를 사용하여 시각으로 오게 닌 표현한다.
그림 3. 문화에서 시간이 지남에 따라 세포의 증식 속도를 측정하기 위해 BrdU의를 사용하여 대표 세포 증식 데이터. 거대한 다니오 67에서 분리 배양하여 MPC에서 얻은 정보.
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Discussion
근육 조직이 프로그램은, 어느 검사 종, 가장 쉽게 체외 시스템을 통해 공부하실 수 있습니다. 사실, 격리에, 근원 성 전구 세포 (MPC를) 생선이나 포유류의 myosatellite 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 쉽게 증식, 세포주기 취소 될 수 있으며, 근육 아세포의 단말 차별화 및 초기 myotubes에 그 근원 세포의 융합을 포함하는이 규제가 심한 과정을 입력합니다. (제브라 피쉬 (67) 및 무지개 송어 (69)의 가능한 예외) 셨나요 종의 형질 전환 유전자 기자 균주의 일반적인 부족은 MPC / MSC 활성화, 증식, 분화의 생체 활동에 제약, 따라서 여기에 제시된 시험 관내 시스템입니다 물고기 종의 연구를위한 매력적인 플랫폼입니다.
MPC / 중간 엽 줄기 세포에 상관없이 종의 성공적인 문화 불임에 대한) 엄격한주의에 크게 의존; 골격 근육 t의 b)는 철저하게 기계적인 분리문제; 및 C) 소화 효소의 최적화. 근육 조직 분리의 초기 단계 동안, 큰 관심은 조직의 필요한 양을 오염하지 않고 절제 않도록주의해야한다. 그것은 물고기 (또는 동물이 그 문제에 관해서는, 사용되는)가 제대로 70 % 에탄올과 충분한 시간 동안 소독하는 것이 가장 중요합니다. 우리 손에, 30 초 가장 잘 작동합니다; 시간의 짧은 기간 오염 및 조직 무결성 및 세포 생존 능력의 이상 손실이 발생할 수 있습니다. 에탄올 고정액으로 사용할 수 있으므로 손질 절개 전에 생선을 탈수하지 않도록주의해야한다. 해부 층류 세포 배양 후드 외부에서 수행 될 수있다; 그러나, 우리는이 프로세스가 잠재적 인 박테리아 또는 곰팡이 오염을 최소화하기 위해 후드 내에서 수행하는 것이 좋습니다.
상술 기계적 해리 당초 조질 및 / 또는 지루한 보일 수도 있지만, 분리 절차에 중요하다. 두 개의 큰 메스 블레이드 뽑아 지난(비디오 프로토콜에 도시 된 바와 같이) 미끄럼 운동으로 서로가 최상의 결과를 생산한다. 일단 완료, 균질의 일관성 슬러리 또는 퓨레의, 그리고 쉽게 넓은 구멍 혈청 피펫 (즉, 25 ㎖)로 수집해야한다. 간단히, 더 나은 기계적 분리, MPC / MSC 수율과 더 나은 결과 문화 높은. 별로 분리는 소화 효소를 방해하고 세포 수율을 감소합니다. 그것은 고려하는 유혹 될 수 있지만, 전기 조직 균질의 사용은 극적으로 적어도 셨나요 MPC를 함께, 그것의 명백한 편의에도 불구하고 세포 생존 능력을 낮춘다.
모든 프로토콜과 마찬가지로, 위에서 설명 된 절차의 최적화가 필요한 경우가 많습니다. 이 작업은 몇 danionin 종과 우리의 작업에 사실 입증되었습니다. 우리 실험실의 결과는 작은 danionins (예를 들어, 제브라 피쉬가) 큰 종을 (예 : GI보다 골격 근육의 그램 당하여 MPC를 얻을 수 있음을 나타냅니다개미 또는 moustached 다니오). 콜라게나 제 (0.3 %)의 높은 농도가 작은 종에서 조직으로 사용되는 경우,이는 실현된다. 우리 손에, 0.2 %의 농도 (예를 들어 무지개 송어, 치열한 송어 [Oncorhynchusclarki], 치누크 연어 [Oncorhynchustschawytscha]) 연어류 종에 적합한, 큰 danionins, Axolotl의 (Ambystomamexicanum) 사지와 꼬리, 그리고 심지어 마우스 골격 근육. 마찬가지로, 치료는 적절한 콜라게나 제를 선택하는주의해야합니다. 우리의 경험에 의하면, 유형 IV 콜라게나 제는 뼈와 근육 (즉, 콜라게나 제 II 형) 70 섬유 조직에 권장 콜라게나보다 훨씬 더 나은 세포 생존 능력을 유지합니다. 소화가 더 짧은 시간주기에서 더 완전 할 수 있지만, 세포막 수용체 무결성 가능성이 제제의 증가 된 트립신 활성에 의해 손상된다. 트립신과 관련하여, 우리의 실험실은 항상 조잡한 트립신 준비 PUR를 이용했다대신 사용할 수있는 '순수한'준비보다, 돼지의 췌장에서는 ified. 다양한 종의 우리의 문화 활동에서 우리는 다양한 트립신 농도의 작은 유익한 효과를 발견했습니다.
연화는이 프로토콜에 매우 중요합니다. 그것은 둘 골격근의 섬유상 매트릭스를 해리하고 모든하면서 수동 근섬유의 구조적 완전성을 방해 트립신 소화를위한 표면적을 증가시킨다. triturations을 수행 할 때, 연속적으로 작은 구멍 피펫과 캐 뉼러를 사용하여 정맥 주사기의 직선을 사용하는 것보다 훨씬 쉽습니다. 캐 뉼러와 주사기 triturations 직접 진행하는 연결 캐 뉼러 및 / 또는 셀에 적용되는 과도한 압력이 발생할 수 있습니다. 적절한 분쇄하지 않고 트립신 소화를 적용하면 극적으로 세포 수율을 감소시킬 것이다.
일단 격리, 배양 방법은 아주 간단합니다. 현재까지 대부분의 출판물은 프로토콜 기지를 활용 한증식과 우리 자신을 포함하여 차별화 33,71-75, 모두를위한 시간 하나의 미디어; 그러나, 몇 가지 프랑스어 수사관에 의해 작성된 최근 기사는 별도의 기반 미디어 및 증식과 분화 33 혈청 내용으로, 두 개의 미디어 프로토콜을 설명했다. 이 '새로운'프로토콜은보다 밀접하게 쥐의 중간 엽 줄기 세포와 myoblastsand의 문화에 사용되는 초기 단계의 근원 세포 (33)의 확산을 향상시키기 위해 나타나고 확산 및 / 또는 세포의 분화를 제어하는 것이 더 적합 할 수 있습니다 모방. 그러나, 유전자 발현의 유용한 특성화없이, 이러한 '확산'미디어는 또한 기존의 하나의 미디어 방법론을보다 더 '근원 세포 같은'상태를 보존하는지 여부를 체결하기 어렵다. 성적 증명서 또는 단백질 수준에서 여부, 유전자 발현을 기술 이전 간행물은, 기존의 하나의 미디어 프로토콜 3를 사용하여보고했다. 대안 적으로, 단일 미디어 (분화 증식 및 2 % 10 % : DMEM)는 본원에 기술하는 소 태아 혈청 (FBS)의 각기 다른 농도로 보충 될 수있다.
포유 동물 세포 배양 시스템을 이용한 조사가 이들 세포 배양을위한 이산화탄소 분위기를 사용하여 적응할 수 있지만, 다른 접근 지상파 및 수생 가스 교환 호출 간의 본질적인 차이점은 MPC를 포함한 셨나요 또는 수분 국한 urodele 세포를 배양 할 때. 중탄산 나트륨 (NaHCO3을) - 여기서 상세한 프레스는 피페 유래, 양쪽이 온성 유기 화합물 [(2 - 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1 - 에탄 술폰산 HEPES 4]로 버퍼링된다. 따라서, 가스 분사 인큐베이터가 필요하거나이 세포의 배양이 필요하지 않습니다. 온도가 문화 셨나요을 필요로하고 urodele하여 MPC는 18 ~ 26 ° C. 사이의 범위로 더 중요한 것은, 이러한 창업 보육 센터, 오히려 열을보다 냉각 할 수있는 능력을 가지고 있어야합니다 또한, 연어류 MPC를이 C이 될 수 있습니다상기 냉각 인큐베이터에 대한 필요성을 강조하는, 필요한 경우 낮은 온도에서 ultured. (이전에 전달 같은 다른 연구자가 같은) 또한 우리가 발견 한 배양 접시의 밀봉은 세포 생존 능력을 보존 할 필요가있다. 단순히 표준 실험실 테이프로 문화 뚜껑과 접시 사이의 인터페이스를 배치하면이 목표를 실현하기에 충분하다.
1 차, MPC를 / 엽 줄기 세포 / 아세포의 계대는 포유 동물 세포 배양에서 흔히 있지만, 그것은 셨나요 세포와, 적어도 (문화의 날 6 정도) 후반 메가 단계 전에 가능한 것으로 표시되지 않습니다. 따라서, 확산을 지원하고 실험의 목표를 달성하기에 충분한 세포의 적절한 수는 배양 초기 시드해야합니다. 이하 예상보다 세포 수율을 얻을 경우 또한, 그것은 세포를 전파하고 나중에 자손을 replate 할 수 없습니다. 우리는 extracel의 증가 의존이 특성을 돌렸다셨나요의 MPC / 아세포의 lular 매트릭스 (ECM). 또는,이 라미닌 기판의 유물과 셨나요의 MPC / MB의 증식과 분화가 보증합니다 필요한 ECM 구성 요소 따라서 경험적 결정이라고 할 수있다. 우리는 우리의 공동의 여러 성공적으로 문화의 토대에서 말기 근원 세포 (~ 문화의 날 6)를 제거하고이 세포 (JM 프뢰 리히와 PR Biga, 개인 통신) replated 것을, 그러나주의 않습니다.
그것과 유사한이 프로토콜 또는 하나, RT-PCR 3,71-74,76-78, 웨스턴 블롯 32,79-81, 면역 세포 화학 (32, 33), 확산 분석 32,33,59, 유전자 형질 15, 형태 학적 관련된 실험을 사용하여 분석 78, 독극물 검사 (82)과 크로 마틴 면역 침전 (칩, JM 프뢰 리히와 PR Biga, 게시되지 않은 결과가) 완료되었습니다. 그러나, VIT에서 추가의 추가 설명RO 프로토콜, 계대와 클론 전파를 포함하는, 즉 사람들이 아주 많이 필요합니다. 사실, 로저스 연구소 (15)는 무지개 송어의 근원 세포의 형질 전환을 유도하기위한 프로토콜을 최적화하여 셨나요 MPC를 / 아세포의 문화에 상당한 발전을했다. 이 방법론을 바탕으로, RNAi의 또는 골격근 특정 대상의 과발현, 경골 어류의 평생 성장 궤도에 참여하는 가정, 특히가 관련된 추가 조사뿐만 아니라 가능하지만, 양식 생물 의학 분야에서 상당한 발전으로 이어질 수 있습니다 과학.
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Disclosures
공개 아무것도 없다.
Acknowledgments
저자는 Drs에 많은 감사를하고 싶습니다. 작은 물고기와 양서류이 문화 프로토콜의 개발과 응용 프로그램에서 자신의 전문 지식에 대한 호셉 Planas와 후안 카스티요. 덕분에, 때문에 끊임없이 마태, Delci 크리스텐슨, 재커리 파울러, 브룩 프란 젠, 나단 프뢰 리히, 키라 마샬 충전 등 많은 물고기 (종 및 숫자 모두)에서 근육 조직의 박리와 해리에 지원 한 수많은 개인도 있습니다 벤 마이어, 이단 Remily 및 Sinibaldo 로메로. 이 작품은 생물 창업 자금 버밍엄학과, 프로테아제 연구 NIH 그랜트 # 2P20 RR015566, NIH NIAMS 그랜트 # R03AR055350 센터에서 알라바마 대학의 지원 및 PRB에 NDSU 사전 FORWARD NSF 그랜트 # HRD-0811239했다. 지원도 UAB 영양 비만 연구 센터 수상 # 1 P30DK056336, NIH NIDDK에 의해 제공되었다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 그 필요는 없습니다NIH의 공식 견해를 나타냅니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. Detailed Reagent Information | |||
| Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture |
| γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL |
| Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL |
| Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| Table 2. Consumables, Tools and Equipment | |||
| Consumable | Tools | Equipment | |
| Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | |
| Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | |
| Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | |
| 0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | |
| Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | |
| Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | |
| 12-16 G Cannulas with Luer Locks | |||
| Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** |
| 6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 |
| 24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| *0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | ||
| Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | |||
| Reagent | Isolation | Wash | Dissociation |
| Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL |
| Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | - |
| Donor Equine Serum | 75.00 mL | - | - |
| Fetal Bovine Serum*** | - | - | - |
| * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | |||
| Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume |
| 6 well | 9.5 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 1 mL |
| 24 well | 1.9 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 250 μL |
| 48 well | 0.95 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 150 μL |
| 96 well | 0.32 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 50-100 μL |
| Table 6. Average number of cells per g tissue | |||
| Species | Average # cells/g tissue | ||
| Danio rerio | 6,400,000 | ||
| Danio dangila | 1,783,000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66,800 | ||
| Table 7. Recommended Incubation Temperatures | |||
| Species | Temperature | ||
| Danio/ Devario spp. | 26 - 28 °C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* - 18 °C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18°C | ||
| * Lower temperatures support lower proliferation rates. | |||
References
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