Summary
In vitro-kultur-system har visat sig oumbärlig för förståelsen av ryggradsdjur myogenes. Dock återstår mycket att lära om nonmammalian skelettmuskelutveckling och tillväxt, särskilt i basal taxa. En effektiv och robust protokoll för att isolera adulta stamceller i denna vävnad, de myogena precursorceller (Medelhavsländerna), och behålla sin självförnyelse, proliferation och differentiering i en primär kultur inställning gör det möjligt att identifiera bevarade och olika regleringsmekanismer i hela ryggradsdjur härstamningar.
Abstract
På grund av den inneboende svårigheten och tid arbetar med att studera myogena programmet in vivo, primära odlingssystem som härrör från de bofasta vuxna stamceller i skelettmuskulaturen, de myogena precursorceller (Medelhavsländerna), har visat sig vara oumbärliga för vår förståelse av däggdjurs skelettmuskelutveckling och tillväxt. Särskilt bland de basala taxa av Vertebrata, är uppgifterna begränsade beskriva de molekylära mekanismer som styr den självförnyelse, proliferation och differentiering av Medelhavsländerna. Av särskilt intresse är potentiella mekanismer som ligger bakom möjligheten för basala ryggradsdjur att genomgå betydande postlarval skelett myofiber hyperplasi (dvs. teleost fisk) och full regeneration efter bihang förlust (dvs. stjärtgroddjur groddjur). Dessutom kan användningen av odlade myoblasts lätta förståelsen av förnyelse och rekapitulation av den myogena program och skillnaderna mellan dem. TillDärför beskriver vi i detalj en robust och effektiv protokoll (och variationer däri) för att isolera och bibehålla MPCs och deras avkomma, myoblaster och omogna myotubes, i cellkultur som en plattform för att förstå utvecklingen av myogena programmet, som börjar med mer basala vertebrater. Utnyttja modellorganism status zebrafisk (Danio rerio), vi rapporterar om tillämpningen av detta protokoll för små fiskar av mört kladen Danioninae. Parallellt kan detta protokoll användas för att realisera ett bredare jämförande tillvägagångssätt genom att isolera MPCs från den mexikanska axolotl (Ambystomamexicanum) och även smågnagare. Detta protokoll är nu allmänt används för att studera myogenes i flera fiskarter, bland annat regnbåge, lax och havsruda 1-4.
Introduction
Betydande förståelse för däggdjur myogenes har erhållits genom rekapitulation av denna process i både primär mus (Mus musculus) myoblast kulturer och väl beskrivna mus-härledd cellinje, C2C12 5. Med början på 1950-talet 6, har dessa kulturer lett till mycket framsteg i förståelsen av den murinemyogenic programmet och, i förlängningen, myogenes i andra ryggradsdjur. Dessutom har enstaka cell myofiber Explantation tekniker ökat ut förståelse för samspelet mellan satellitceller och omgivande myofibers 7-9. Cellkulturer särskilt attraktiv för undersökningar av myogenes på grund av den korta tiden från föregångare till differentierad cell 10, relativt lätt för transfektion för RNAi 11-14, transgena 15,16 och överuttryck studier 14,17,18, in vitro-expansionen följt av in vivo transplantation 18-20, och till och med kompArison av myogena prekursorceller och deras reglerande agenter över taxa 21,22. Även skillnader på grund av den konstgjorda miljön i odlingssystemet har beskrivits 5,23, har dessa in vitro-system visat sig vara oumbärlig för vår dissektion av det intrikata program som styr bildandet av flerkärniga, mononukleära terminalt differentierade myofibersfrom proliferativa stamceller som kallas myosatellite celler (MSC) bland däggdjuren.
Utanför klassen Mammalia dock bevarande och / eller divergens av mekanismer som styr myogenes är dåligt kända, till stor del på grund av svårigheten i att odla myogena precursorceller (MPCs) och myoblasts från olika taxa. I själva verket har primära myoblast kulturer endast beskrivits i tre fåglar 24-26, en reptil 27, några groddjur 28-30, och vissa fiskar 1,3,4,31-33. Kontinuerliga myogena cellinjer från veandra än gnagare 34-36 rtebrates är ännu mer sällsynt, med den enda icke-däggdjur myogenic cellinje härrör från japansk vaktel (Cortunix japonica), QM7 37. Trots många försök till immortalisering, en teleost myogenic cellinje fortfarande instabil och ett protokoll för effektiv transfektion av dessa celler publicerades först i år 15. Således är väldigt välbehövligt tydliga och väl optimerade protokoll för odling av primära MPCs och myoblasts från en mängd olika ryggradsdjur som inte bara ytterligare utöka vår kunskap om utvecklingen av myogena programmet, utan att använda kraften i jämförande fysiologi att göra genombrott i behandling av humana skelettmuskel sjukdomar och störningar.
Medan litteraturen innehåller många rapporter om MPC / myoblast isolering 38-49, är det vanligt att författare att beskriva protokollen för dessa isoleringar i korta, ofta ofullständiga, format. Vidare är de mest instruktiva protokollen reparted har utvecklats för möss 50-53, och några av dessa är beroende av val av antikropp 54,55 eller fluorescens transgener 56,57, vilket gör dessa protokoll oanvändbara eller opraktiska innersta icke-gnagare som används av muskel biologer. Med lite känt om piscine, amfibie, och reptil myogenes, en detaljerad och ingående protokoll, som beskrivs med audiovisuella vägledning och med påvisad effektivitet i avlägset besläktade arter, skulle vara till stor hjälp för fältet.
Först beskrivs av Powell och kollegor 1989 58, var följande protokoll ursprungligen utvecklats för att isolera partnerländerna och myoblasts från laxfiskar (nämligen, regnbåge, Oncorhynchus mykiss, och lax, Salmo salar) och några större karpfiskar (dvs. guldfisk, Carassiusauratusauratus) . År 2000 Fauconneau och Paboeuf optimerat en primär myoblast kultur för regnbåge 59, och minoroptimizations made nämnda protokoll användbart i flera mindre elritsa i Danioninae klad (zebrafisk, Danio rerio, och jätte danio, Devario aequipinnatus) 32 på grund av de många genetiska verktyg tillgängliga för zebrafisk arbete och därmed dess nära släktingar. Teleost fisk är attraktiva organismer för studier på grund av deras avvikande tillväxtstrategi (åtminstone i de flesta arter). Stora laxfiskar, som de flesta fiskar, växa odefinierat, med tillväxtpotential obunden av en asymptot på förfallodagen, även i hög ålder 60-62. Till skillnad från zebrafisk, stora danionins såsom jätten danio 63 och moustached danio display tillväxtmöjligheter som är typiska för teleost fisk, vilket gör deras direkta sammanställning en idealisk plattform för förståelse om MPC cellöde val spelar en roll i skelettmuskulaturen hyperplasi kontra hypertrofi.
På samma sätt har vi visat att detta protokoll kan användas med möss och axolotls, med relativt högt cellutbyte och VIABbilitet index. Stjärtgroddjur salamandrar, såsom den mexikanska axolotl (Ambystomamexicanum), har den märkliga förmågan att regenerera vävnad, inklusive hela ben och svansar 64-66. Denna egenskap gör dessa amfibier intressanta modeller av skelett muskelförtvining och åldrande. Med hjälp av det protokoll som beskrivs nedan, kan göras en liknande strategi som man gjort i många fiskarter, ger en ännu bredare jämförande sammanhang för sådana studier. Som många verkligt jämförande biologer uppskattar, de mest meningsfulla framsteg inom grundläggande biologi och translationell biomedicin kan göras när data analyseras inom bredast möjliga spektrum (här, hela ryggradsdjur härstamning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Uttalande: Alla experiment på ryggradsdjur som beskrivs här har godkänts i förväg av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Alabama i Birmingham och är i linje med de riktlinjer som fastställts av Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health i USA Institutionen för hälsa och mänskliga tjänster.
1. Förberedelse för kultur
- Förbered basen mediet enligt följande: 9 mM NaHCO 3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g per 2 L) i DMEM (13,48 g / L, 26.96 g per 2 L).
- Bestäm pH och justera till 7,40 med HCl eller NaOH.
- Bestäm osmolalitet och anpassa sig till ~ 300 mOsm med NaCl (om det behövs).
- Filter sterilisera använda (2) 1 L vakuumsteriliseringssystem och förvara vid 4 ° C skyddat mot ljus i upp till 2-3 månader.
OBSERVERA: Se tabell 1 och 2 för fullständig reagens, verktyg, konsumringar, och utrustning informationen.
- Förbered poly-L-lysin-behandlade plattorna genom upplösning av 5 mg av γ-bestrålade poly-L-lysin (> 300.000 MW) i 50 ml ultrarent sterilt vatten. Blanda försiktigt genom inversion under 10 minuter vid rumstemperatur, säkerställa full upplösning av lysin polymerer.
- Pipettera den nödvändiga mängden av poly-L-lysin-lösningen i varje brunn, i enlighet med typen platta (tabell 3). Låt plattorna stå i laminärt flöde huva i 5 minuter.
- Därefter avlägsna poly-L-lysin-lösningen och tvätta två gånger med sterilt vatten. Låt plattorna lufttorka i laminärt flöde huva i 20 minuter.
- Erhåll ett mg laminin (Engelbreth-Holm-Swarm-ursprung) och lös upp i 50 ml av basmedium till en slutlig koncentration av 20 pg / ml. Applicera laminin lösning på poly-L-lysin-behandlade cellodlingsplattor vid 2 | ig / cm 2. (Se tabell 3 för olika plåtstorlekar)
- Virvla lösningen försiktigt för att säkerställa att full bra täckning. Täta plattor med laboratorium tejp och placera i inkubator under 24 timmar. Inkubatorn bör sättas till lämplig temperatur för arter som används (se tabell 7), och inga ytterligare gaser måste läggas till inkubatorn.
OBSERVERA: Laminin måste tillåtas att vidhäfta plattorna under 24 timmar innan sådd celler. Underlåtenhet att göra detta kommer att leda till dålig eller ingen cell vidhäftning. - Förbered media som beskrivs i tabell 4. Komplett media är bäst förberett användningsdagen.
- Som förberedelse för vävnads isolering, montera följande och autoklav: 300-500 ml bägare (n); glas petriskålar; skalpell handtag; pincett (fin och grov); dissektion sax; och flera ark vattenavvisande autoklav papper.
OBS: För varje person som bistår med dissektion process, (2) skalpellhandtag, (1) pincett (typ beror på personliga preferenser), (1) dissektion sax och (5-10) ark vattenavvisande autoklav papper ärtillräcklig. - Förutom de autoklave punkterna ovan, montera 70% etanol, en viktbalans, sterila 50 ml koniska rör (antalet beror på storleken av kultur), och is.
2. Tissue Dissection
- Innan du börjar, se till att ett tillräckligt lager av fisk är tillgänglig.
OBS: Åldern på den fisk som skall användas är av kritisk betydelse. Även fisk av två olika arter kan ha liknande vikter, kommer en yngre fisk av en art har flera MPCs än en äldre fisk av en annan art. Som en allmän regel, yngre fisk, speciellt vid arbete med laxfiskar, är bäst. För danionins kan fisken så gammal som ett år utnyttjas optimalt, medan laxfiskar i åldern 4-6 månader eller yngre (upp till 15 g) är optimala. - För varje 5 g vävnad som ska dissekeras, portion 25 ml isoleringsmedium i en steril 50 ml koniska rör.
- Väg, spela massa och numret röret (s). Placera rören på is.
- Euthanize 2-3 fiskvid en tidpunkt genom nedsänkning i> 300 mg / L natriumbikarbonat-buffrad tricaine metansulfonat. Tillåt opercular rörelse att upphöra under> 5 minuter och sedan submerse fisken i 70% etanol (som finns i de sterila bägare) under 30 sekunder.
- Ta bort fisken från 70% etanol och lägg på vattenavvisande autoklav papper. Direkt bakom opercula, använd en skalpell för att göra en ytlig, ytlig snitt. Avlägsna vågskålen och huden genom att ta tag i huden på det tidigare nämnda snittet och dra mot svans av fisk.
- Efter borttagning hud, skära ut epaxial, snabb glykolytiskt "vita" muskeln i fisk från båda sidor (undviker långsamt oxidativa "röda" muskel som ligger nära sidolinjen) och placera i isoleringsmedium. Kassera den återstående delen av fisken i enlighet med institution.
OBSERVERA: Även om det är fullt möjligt att odlings MPCs ursprung från röd muskel, nästan varje publikation använder teleost MPCs har utnyttjats celler isolerade från epaxial myotome. - Upprepa steg från 2,4 till 2,6 tills en tillräcklig mängd av muskel erhålles. Under dissektion, se till att poolad muskelvävnad kvar på isen för att upprätthålla cellernas livskraft.
3. Mekanisk Dissociation
- Häll en tub på 25 ml / 5 g muskelvävnad i ett glas petriskål. Med hjälp av två skalpell handtag med bifogad # 10 skalpell blad, finhacka vävnaden till en slurry eller mos konsistens. En "back-och-tillbaka"-rörelse för att dra de skalpellblad förbi varandra fungerar bäst.
OBS: Även vävnads homogenizers kan tyckas lämpligt kommer antalet livskraftiga celler minskas drastiskt, om inte avskaffas. - Med hjälp av en 25 ml serologisk pipett och serologisk pipett, avlägsna uppslammade vävnaden och ersätta den ursprungliga koniska rör.
- Upprepa steg 3.1-3.2 tills all vävnad i alla rör är mekaniskt dissocierade.
- Centrifugera vävnad under 5 minuter vid 300 x g och 10 ° C.
- Follgrund centrifugering, kasta 25 ml media supernatanten med en 25 ml serologisk pipett, vakuumsug, eller genom försiktig dekantering.
- Tillsätt 25 ml tvättmedium till varje rör, återsuspendera vävnad och recentrifuge som ovan.
- Tvätta två gånger med tvättmediet, avlägsnande av supernatanten varje gång.
4. Enzymatisk Dissociation
- Under steg 3.4, förbereda kollagenas lösning genom att kombinera 0,22 g av typ IV kollagenas och 44 ml bas medium (eller tillräcklig mängd på 0.11 g/0.22 ml).
- Rör om i en bägare för 10 till 15 minuter vid 4 ° C. Filtersterilisera med en 50 ml spruta och en 0,45 fim sprutfilter.
OBSERVERA: Mer än ett sprutfilter kan behövas, beroende på kollagenas beredning. Kollagenas från andra djur än Worthington Biochemical leverantörer innebär större svårigheter under filtreringen. Kollagenas används för att dissociera peptidbindningar i kollagen som utgör endomysium. Dettamatsmältningen kommer att ta bort den skyddande barriär av myofibers. - För varje g muskelvävnad, resuspendera vävnad i en 0,2% kollagenas lösning. För 5 g muskelvävnad, tillsätt 10 ml kollagenas lösning och 15 ml bas medium.
- Tillsätt 10 l av PSF per ml kollagenas lösning / bas medium (t.ex. 250 ^ till 25 ml). Se till att vävnaden är väl suspenderad, eftersom detta kommer att påverka effektiviteten av den enzymatiska digestion.
- Inkubera muskelvävnad i kollagenas under 60 minuter vid 18 ° C med försiktig skakning. Beroende på graden av mekanisk dissociation och art, kan kollagenasdigestion utsträckas till 90 minuter, även om detta kan påverka cellviabiliteten.
- Efter kollagenasspjälkning, centrifugera koniska rör vid 300 xg under 5 minuter vid 12 ° C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera vävnad i 25 ml tvättmedium.
- Recentrifuge vid 300 x g under 5 minuter vid 126; C. Upprepa med tvättmediet en andra gång.
- Efter tvättning vävnad två gånger, tills vävnaden / medel homogenatet passerar återsuspendera muskelvävnad i 25 ml tvättmedium och kör med en 10 ml serologisk pipett in och ut ur pipetten med relativ lätthet. 5-10 triturationerna är vanligen tillräcklig.
- Upprepa med en 5 ml serologisk pipett och därefter en 16 gauge metall kanyl fäst vid en spruta.
- Centrifugera koniska rören vid 300 xg under 5 minuter vid 12 ° C. Dekantera supernatanten.
- Under den ovan 5 minuters centrifugering, framställning av trypsindigerering lösning genom att kombinera 0,25 g av trypsin med 5 ml av basmedium.
- Rör om vid 4 ° C under 10 till 15 minuter och filtrera sterilisera med en 20 ml spruta och 0,45 fim sprutfilter.
- Hämta koniska rör och tillsätt 100 ìl av trypsin-lösning och 4,9 ml av dissociation medium för varje 1 g muskelvävnad till varje rör. För EXAmple, tillsätt 500 l av trypsin lösning och 24,5 ml dissociation medium till 5 g muskelvävnad.
NOTERA: Trypsin är ett serinproteas som kommer att skilja myogena prekursorceller från basal lamina. - Resuspendera vävnad i trypsin / dissociation medellång väl. Inkubera under 20 minuter vid 18 ° C.
- Efter den första trypsin inkubation centrifug koniska rör vid 300 x g under 1 min vid 12 ° C.
- Neutralisera trypsin genom kombinering av supernatanterna med isoleringsmedium i en koncentration av 1 volym av supernatanten till 4 volymer av isoleringsmedium. Lagra vid 4 ° C under den andra trypsindigerering.
- För den kvarvarande pellet av vävnad, upprepa steg från 4,12 till 4,15, kombinera supernatanten efter steg 4,15 med supernatanten / isoleringsmediet från den första trypsin matsmältningen.
- ALTERNATIVT: De kollagenas och trypsin digere kan kombineras för att maximera cellutbyten. <ol>
- För att göra detta, mal sönder kollagenas smälta med hjälp av en metallkanyl (6 i längd och 16 gauge fungerar bäst) fäst till en 20 ml spruta tills homogenatet passerar lätt genom kanylen.
- Till homogenatet, tillsätt 500 | il av trypsin-lösning (framställd i steg 4,10) och inkubera vid 18 ° C under 20 minuter.
- Efter inkubationen centrifug koniska rör vid 300 x g under 1 minut vid 12 ° C.
- Neutralisera trypsin genom kombinering av supernatanterna med isoleringsmedium i en koncentration av 1 volym av supernatanten till 4 volymer av isoleringsmedium.
- Lagra vid 4 ° C under den andra trypsindigerering.
- Fortsätt med steg 4.18 som med standardprotokollet.
5. Räkna, Utspädning och sådd av celler
- Efter den sista centrifugeringen i steg 4.25, avlägsna supernatanten genom noggrann dekantering eller med en serologisk pipett. Suspendera cellpelleten i 5 ml komplett medium.
- Med celler helt suspenderas, ta bort 20 l, Av cellsuspensionen och plats i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg 5 pl av trypanblått och vänta 5 minuter. Med användning av en hemocytometer, bestämma antalet viabla celler.
- Vid fastställandet, späd celler till den nödvändiga koncentrationen. Teleost MPCs bäst såddes vid 150.000-200.000 celler per cm 2. För en sex-väl plätering strategi, späda celler till 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 per ml stödjer tillräcklig spridning och differentiering.
- Retrieve poly-L-lysin-behandlade, laminin-belagda plattor och utsädes celler. (Se Tabell 5 för plattspecifik utspädningar och plätering volymer.) ANMÄRKNING: Tabell 6 visar medelantalet celler isolerade per gram muskelvävnaden isoleras från olika teleost arter. Regnbåge (O. mykiss) uppvisar färre MPCs per gram muskelvävnad än gör zebrafisk (D. rerio) och kommer därmed att kräva mer fisk för att isolera från för korrekt seedning.
- Förslut plattorna med laboratorie tejp och placera i kylning inkubator vid den lämpliga temperaturen. Medelhavsländerna från alla arter som anges här (spara för möss) kan inkuberas under normala atmosfäriska förhållanden utan koldioxid (CO 2) tillskott. (Se Tabell 7.)
- ALTERNATIVT: Vissa laboratorier har antagit ett protokoll som kräver att låta Medelhavsländerna för att ansluta sig till den kultur substrat i 40 minuter.
- Skölj plattorna med tvättmedia för att avlägsna eventuella löst fästa och icke-vidhäftande celler. Varning: Detta steg är mycket viktigt att undvika "icke-specifik" vidhäftning av andra celler (t.ex. fibroblaster) till odlingssubstrat.
- Lägg kompletta media och placera celler i inkubatorn och ta hand om enligt nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tjugofyra timmar efter sådd, myogena prekursorceller (MPCs) ska vara synligt fäst till laminin substrat (se figurerna 1a och 1d). Efter sådd, celler (MPCs) anta en spindelliknande form, är indikativ för denna celltyp (figur 1) och är MyoD1 + (Figur 2). I Danio arter, MPCs verkar vara mer kompakt med mindre bipolära processer än gör MPCs från Oncorhynchus och Salmo arter. Men under fyra dagar av kultur, MPCs från alla piscine arter undersökta anta liknande morfologier och ser tydligt ut som myoblasts (figurerna 1b och 1e). Kompletta medier bör tas bort, och Medelhavsländerna ska tvättas två gånger med tvättmediet. Myofibroblaster kan förorena myogena kulturer och är lätt att skilja från MPCs / myoblasts genom sin stjärnliknande morfologi (kontra spindel formen på myoblast). Tvättning av plattorna kraftigt improves avlägsnandet av sådana fibroblaster.
I de arter som beskrivs här (se tabell 7), dagliga medie förändringar ger bäst resultat. MPCs och avkomma (myoblaster och begynnande myotuber) bör tvättas en eller två gånger före tillsatsen av färskt komplett medium. Alternativt kan medieförändringar minskas till varannan dag efter det att cellerna har nått den slutgiltiga myoblast stadiet (ungefär dag 4 av kultur). Myotubes bör bildas inom 2-3 dagar (figur 1c och 1f) och bli myogenin + (figur 2), särskilt när de odlas i differentieringsmedium (se nedan). Medan perioder av veckor till månader, har rapporterats i flera däggdjursarter, behöver piscine MPCs och myoblaster förefaller inte tolerera sådana tidsperioder. Celler förökar sig under de första sex dagarna av kultur (Figur 3), med efterföljande differentiering mellan dag 7 och 9-11 av kultur. Efteråt celler åldras eller enpoptose.
Den myogena natur MPCs och deras avkomma isoleras med hjälp av detta protokoll har bestämts 3,32,33 baserat på genuttryck. Till skillnad från däggdjur kultursystem, är spridningen av Medelhavsländerna och myoblast avkomma relativt låg under de första dagarna av kultur (jämfört med system som använder primära murina myoblasts eller C2C12), med snabba ökningar upptäckts som cellerna bildar omogna myotubes under dagarna 6-9 av kultur i Danio arter 32. Rapporter från regnbågslax har utnyttjat ett differentieringsmedium (vanligt i däggdjurs myoblast kulturer, men inget krav på piscine system) och indikerar att spridningsindex minskar som väntat med myotube formation 33. I våra händer, kan de resulterande myotubes kvar i kulturen i upp till 9-11 dagar (Danio arter) och 11-13 dagar (Oncorhynchus arter) före cellulärt åldrande och apoptos inträffar.
| Reagens | Företag (Preferred v. Alternate) | Katalognummer (Preferred v. Alternate) | Kvantitet per kultur |
| γ-bestrålade poly-L-lysin | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (hög glukos) | Sigma-Aldrich (Cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Natriumbikarbonat (NaHCO 3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1,51 g |
| HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9,53 g |
| Antibiotikum / Antimykotisk | Thermo Scientific (SIgma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 ml |
| Gentamicinsulfat | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 ml |
| Donator Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 ml |
| Fetalt bovint Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 ml |
| Kollagenas (typ IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0,44 g |
| Trypsin (från bukspottkörteln) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
Tabell 1. Detaljerad reagens lista med önskad tillverkare och katalognummer.
| Förbrukningsartikel | Verktyg | Utrustning |
| Cellodlingsplattor | Tång (grov) | Serologisk Pipett |
| Sterila 50 ml koniska rör med | Tång (Fin) | pH-mätare |
| Laboratorie Tape | Skalpell Handtag | Chilling Incubator (Echotherm) |
| 0.2 um Vakuum Sterilisering Systems | Skalpellblad (# 10, # 11) | Laminärflödeshuv |
| Vattenavvisande Autoklav Papper | Kirurgiska Sax | Vacuum Manifold |
| Serologiska pipetter | Glas petriskålar | Microosmolality Meter |
| 12-16 G Kanyler med Luer Locks |
Tabell 2. Förbruknings, verktyg och utrustning som behövs för cellodling.
| Plattstorlek | cm 2 per brunn | Poly-L-lysin * | Laminin ** |
| 6 väl | 9,5 | 1,6 ml | 1 |
| 24 väl | 1,9 | 0,32 | 0,2 |
| 48 väl | 0,95 | 0,16 | 0,1 |
| 96 väl | 0,32 | 0,06 | 0,03 |
| * 0,1 mg / ml koncentration | ** 0,020 mg / ml koncentration |
Tabell 3. Optimerad volymer för beläggning av cellkulturplattor med poly-L-lysin och laminin.
| Reagens | Isolering | Tvätta | Dissociation | Komplett |
| Base Medium | 419,25 ml | 395,40 ml | 297,00 ml | 178,00 ml |
| PSF * | 5,00 ml | 4,00 ml | 3,00 ml | 2,00 ml |
| Gentamicinsulfat ** | 0,75 ml | 0,60 ml | - | - |
| Donator Equine Serum | 75,00 ml | - | - | - |
| Fetalt bovint serum *** | - | - | - | 20,00 ml |
| * PSF: penicillin / streptomycin / fungizon cocktail (100x); ** 50 mg / ml koncentration; *** Karakteriserat |
Tabell 4. Olika medier förberedelser för isolering och odling av myogena precursorceller (MPCs).
| Plattstorlek | cm 2 per brunn | Utspädning | Plätering Volym |
| 6 väl | <td> 9.51,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml | 1 ml | |
| 24 väl | 1,9 | 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml | 250 | il |
| 48 väl | 0,95 | 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml | 150 | il |
| 96 väl | 0,32 | 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml | 50 till 100 | il |
Tabell 5. Rekommenderade utspädningar och plätering volymer med cellodlingsplatta bra storlek.
| Arter | Genomsnitt # celler / g vävnad |
| Danio rerio | 6400000 |
| Danio dangila | 1783000 |
| Devario aequipinnatus | 1797000 |
| Oncorhynchus mykiss | 66800 |
. Tabell 6 Genomsnittligt antal myogena prekursorceller isolerade från 1 gram muskelvävnad från olika teleost arter: Danio rerio (zebrafisk), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (jätte danio), och Oncorhynchus mykiss (regnbågslax).
| Arter | Temperatur |
| Danio / Devario spp.. | 26 - 28 ° C |
| Oncorhynchus / Salmo spp.. | 10 * - 18 ° C |
| Ambystoma mexicanum | 18 ° C |
| * Lägre temperaturer stöder lägre spridnings priser. |
Tabell 7. Rekommenderad inkuberingstemperaturer för piscine och amfibie myogena precursor celler (MPCs).
Figur 1. Representativa ljusa fält bilder av Medelhavsländerna (längst till vänster), myoblaster (mitten), och tidiga myotubes (längst till höger) från två arter, regnbåge (Oncorhynchus mykiss, överst) och zebrafisk (Danio rerio, botten).
Figur 2. Representant immunocytokemisk färgning av Medelhavsländerna (a, c) och myotubes (b, d) isoleras och odlas från jätte danio (Devario aequipinnatus, överst) och regnbåge (Oncorhynchus mykiss, botten). I kultur, myoblaster är MyoD1 + positiv (a, c)som visualiserades med användning av kommersiellt tillgängliga MyoD1 +-antikroppar (Danio: C-20, Santa Cruz Biotechnology; öring: NB100-80899, Novus Biologicals). Dessutom, som myoblasts differentiera, uttrycker de myogenin (b, d) som visualiseras med kommersiellt tillgängliga myogenin antikroppar (Danio: M-225, öring: SC-567, båda från Santa Cruz Biotechnology).
Figur 3. Representativa cellproliferations data med hjälp av BrdU att mäta cellproliferations priser över tiden i kultur. Data som erhållits från MPCs isolerade och odlade från jätte danio 67.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den myogena programmet, i vilket som arter som undersökts, kan lättast studeras genom ett in vitro-system. I själva verket, på isolering, myogena precursorceller (MPCs) i fisk eller myosatellite celler (MSC) i däggdjur anger lätt detta starkt reglerade process med spridningen, cellcykeln tillbakadragande, och terminal differentiering av myoblaster och fusion av dessa myoblasts i begynnande myotubes. Den allmänna bristen på transgena gen reporter stammar av piscine arter (möjligen med undantag av zebrafisk 67 och regnbåge 69) begränsar in vivo arbete MPC / MSC aktivering, proliferation och differentiering, och därmed vitro systemet presenteras här är en attraktiv plattform för studier i fiskarter.
Framgångsrik kultur MPC / MSC, oavsett art, är i hög grad beroende av a) noggrann uppmärksamhet på sterilitet; b) noggrann mekanisk dissociation av skelettmuskulaturen temission; och c) optimering av enzymatisk nedbrytning. Under de inledande stegen i muskelvävnad isolering måste stor försiktighet vidtas för att säkerställa att den nödvändiga mängden vävnad skärs utan föroreningar. Det är av yttersta vikt att fisk (eller något djur utnyttjas, för den delen) är ordentligt desinficerade i 70% etanol och under tillräckligt lång tid. I våra händer, fungerar 30 sekunder bäst; kortare tidsperioder kan resultera i kontaminering och längre, förlust av vävnadsintegritet och cellviabilitet. Etanol kan användas som ett fixativ, så man måste vara försiktig att inte dehydratisera fisken innan dissekering. Dissektion kan göras utanför ett laminärt flöde cellkultur huva; Men vi rekommenderar att denna process ske inom en huva för att minimera de eventuella bakterier eller svampkontamination.
Medan den mekaniska dissociation beskrivits ovan kan verka råa och / eller tröttande i början, är det viktigt att isoleringsförfarandet. Två stora skalpellblad, drog förbivarandra i en glidande rörelse (såsom visas i videon protokoll), producerar de bästa resultaten. När du är klar, bör konsekvensen av homogenatet vara att en slurry eller mos, och enkelt in med en bred-borrning serologisk pipett (dvs. 25 ml). Helt enkelt, desto bättre mekanisk dissociering, desto högre MPC / MSC utbyte och desto bättre den resulterande kulturen. Dålig dissociation kommer att hindra enzymatisk nedbrytning och minskar cellutbyte. Även om det kan vara frestande att tänka på, användningen av elektriska vävnads homogenizers sänker dramatiskt cellviabiliteten trots sin uppenbara bekvämlighet, åtminstone med piscine MPCs.
Som med alla protokoll, är det ofta nödvändigt optimering av det förfarande som beskrivs ovan. Detta har visat sig vara sant i vårt arbete med flera danionin arter. Resultat från vårt laboratorium visar att mindre danionins (t.ex. zebrafisk) ger fler MPCs per gram skelettmuskulatur än gör större arter (t.ex. giant eller moustached Danio). Detta är dock endast realiseras om en högre koncentration av kollagenas (0,3%) används med vävnad från mindre arter. I våra händer, är en koncentration av 0,2% är lämplig för laxfiskar (t.ex. regnbåge, mordisk forell [Oncorhynchusclarki], Chinook lax [Oncorhynchustschawytscha]), de större danionins, axolotl (Ambystomamexicanum) lem och svans, och även mus skelettmuskulatur. På samma sätt måste man vara noga att välja lämplig kollagenas. Enligt vår erfarenhet bevarar kollagenas av typ IV cellviabilitet långt bättre än kollagenaser som rekommenderas för fibrösa vävnader, såsom ben och muskler (t.ex. kollagenas typ II) 70. Även rötning kan vara mer komplett i en kortare tidsperiod, är cellmembranreceptor integritet sannolikt äventyras av ökad tryptiskt aktivitet i dessa förberedelser. När det gäller trypsin, har vårt laboratorium alltid utnyttjat den grövre trypsinberedning purified från svinpankreas, snarare än att de "renare" preparat tillgängliga. I vår kulturaktiviteter med olika arter, har vi märkt lite positiva effekten av varierande trypsin koncentrationer.
Rivning är kritisk till detta protokoll. Det båda dissocierar den fibrösa matrisen i skelettmuskulaturen och ökar ytarean för tryptisk digerering hela tiden stör den strukturella integriteten av de myofibers manuellt. Vid utförande av de trituration, med användande av mindre slangpipetter och kanyler är mycket enklare än att använda kanylen och sprutan direkt. Fortsätter direkt till trituration med en kanyl och spruta kan resultera i igensatta kanyler och / eller alltför stort tryck som appliceras på cellerna. Tillämpa tryptisk nedbrytning utan tillräcklig rivning kommer att dramatiskt minska cellutbyten.
När det väl isolerats, är odlingsprocessen ganska enkelt. De flesta publikationer har hittills utnyttjat ett protokoll kvickheth ett media för både proliferation och differentiering 33,71-75, inklusive vår egen; har dock senare artiklar skrivna av flera franska utredarna beskrev en två medier protokoll, med separata baserade medier och seruminnehåll för proliferation och differentiering 33. Denna "nyare" protokoll mer nära efterliknar de som används i kulturen i murina MSCs och myoblastsand tycks öka spridningen av tillväxtföretag myoblasts 33 och kan vara lämpligare att reglera proliferation och / eller differentiering av celler. Men, är det utan omfattande karakterisering av genuttryck svårt att avgöra om en sådan "spridning" media sparar också en mer "myoblast-liknande" tillstånd än vad den traditionella mediemetodik. Tidigare publikationer som beskriver genuttryck, vare sig vid utskrift eller proteinnivå, rapporteras med den traditionella medie protokoll 3. Alternativt kan ett enda material (DMEM beskrivits häri) kan kompletteras med olika koncentrationer av fetalt bovint serum (FBS): 10% för spridning och 2% för differentiering.
Medan utredare använder däggdjurscellodlingssystem kan acklimatiserad att använda koldioxid atmosfärer för odling av dessa celler, de faktiska skillnaderna mellan land och i vatten gasutbyte kräver en annan strategi vid odling piscine eller vatten-slutna stjärtgroddjur celler, inklusive Medelhavsländerna. Media som beskrivs här är buffrade med en piperazin-härrörande, zwitterjoniska organiska föreningen [HEPES: 4 - (2-hydroxietyl) piperazin-1-etansulfonsyra] och natriumbikarbonat (NaHCO 3). Sålunda behövs inte en inkubator med gas injektion eller som erfordras för odling av dessa celler. Ännu viktigare, bör sådana kuvöser besitter förmågan att kyla i stället för värme, eftersom de temperaturer som behövs för att kulturen piscine och stjärtgroddjur MPCs variera mellan 18 till 26 ° C. Vidare kan laxfisk MPCs vara Cultured vid lägre temperaturer om det behövs, ytterligare belysa behovet av en kylnings inkubator. Dessutom har vi funnit (som har andra utredare, som tidigare kommu) som tätning av odlingsplattor som är nödvändigt för att bevara cellulära viabilitet. Enkelt inslag gränssnittet mellan locket kultur och plattan med standardlaboratorie band är tillräcklig för att uppnå detta mål.
Även passage av både primära MPCs / MSC / myoblasts är vanligt i däggdjurscellkultur, verkar det inte vara möjligt med piscine celler, åtminstone innan den sena Mb stadium (runt dag 6 av kultur). Därför måste det lämpliga antalet celler som är tillräcklig för att stödja spridning och för att nå målen för försöket seedas vid initieringen av kulturen. Vidare, om mindre än väntat cell utbyten erhålles, är det inte möjligt att föröka celler och sedan förnyad utbredning avkomman senare. Vi har tillskrivits denna egenskap till det ökade beroendet av extracellular matrix (ECM) i piscine MPC / myoblasts. Alternativt är det möjligt att detta är en artefakt av laminin-substrat och på så sätt ytterligare empirisk bestämning av ECM-komponenter som är nödvändiga för piscine MPC / Mb proliferation och differentiering är motiverad. Vi noterar dock att flera av våra samarbetspartners framgångsrikt har tagit bort slutskedet myoblasts (~ dag 6 av kultur) från kultur underlaget och lades åter ut dessa celler (JM Froehlich och PR Biga, personlig kommunikation).
Med hjälp av detta protokoll, eller en som liknar den, experiment som involverar RT-PCR 3,71-74,76-78, Western blot 32,79-81, immunocytokemi 32,33, proliferationsanalyser 32,33,59, gen transfektion 15, morfometrisk analys 78, toxikologi screening 82, och kromatin immunoprecipitation (chip, JM Froehlich och PR Biga, opublicerade resultat) har gjorts. Men ytterligare beskrivningar av ytterligare i vitro protokoll, det vill säga de som involverar aging och klonal förökning, är väldigt välbehövligt. Faktum är att Rodgers laboratorium 15 gjort betydande framsteg i kulturen i piscine Medelhavsländerna / myoblasts genom att optimera ett protokoll för att framkalla transfektion av regnbåge myoblasts. Baserat på denna metod, ytterligare undersökningar som involverar RNAi eller överuttryck av skelettmuskelspecifika mål, särskilt de postulerade att vara involverad med de banor livslångt tillväxt av teleost fiskar, är inte bara möjligt, men kan leda till betydande framsteg inom vattenbruket och biomedicinska områden vetenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill rikta ett stort tack till Dr. Josep Planas och Juan Castillo för deras professionella kompetens inom utveckling och tillämpning av denna kultur protokoll till små fiskar och groddjur. Tack också till de otaliga personer som outtröttligt har bistått med dissekering och dissociation av muskelvävnad från många fiskar (både arter och antal), inklusive Matthew Laddning, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, och Sinibaldo Romero. Detta arbete stöddes av University of Alabama i Birmingham Institutionen för Biologi nystartade fonder, Centrum för Proteas Research NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350, och NDSU Advance FORWARD NSF Grant # HRD-0.811.239 till PRB. Stöd har också lämnats av UAB Nutrition Fetma Research Center utmärkelse # P30DK056336, NIH NIDDK. Dess innehåll är helt och hållet författarnas egna och inte nödvändigtvisrepresenterar officiella ståndpunkter NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. Detailed Reagent Information | |||
| Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture |
| γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL |
| Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL |
| Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| Table 2. Consumables, Tools and Equipment | |||
| Consumable | Tools | Equipment | |
| Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | |
| Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | |
| Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | |
| 0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | |
| Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | |
| Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | |
| 12-16 G Cannulas with Luer Locks | |||
| Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** |
| 6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 |
| 24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| *0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | ||
| Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | |||
| Reagent | Isolation | Wash | Dissociation |
| Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL |
| Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | - |
| Donor Equine Serum | 75.00 mL | - | - |
| Fetal Bovine Serum*** | - | - | - |
| * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | |||
| Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume |
| 6 well | 9.5 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 1 mL |
| 24 well | 1.9 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 250 μL |
| 48 well | 0.95 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 150 μL |
| 96 well | 0.32 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 50-100 μL |
| Table 6. Average number of cells per g tissue | |||
| Species | Average # cells/g tissue | ||
| Danio rerio | 6,400,000 | ||
| Danio dangila | 1,783,000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66,800 | ||
| Table 7. Recommended Incubation Temperatures | |||
| Species | Temperature | ||
| Danio/ Devario spp. | 26 - 28 °C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* - 18 °C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18°C | ||
| * Lower temperatures support lower proliferation rates. | |||
References
- Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
- Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
- Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
- Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
- Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
- Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
- Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
- Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
- Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
- Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
- Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
- Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345 (2010).
- Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
- Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
- Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
- McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
- Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
- Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
- Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
- Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
- Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
- McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
- Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
- Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
- Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
- Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
- Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
- Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
- Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
- Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
- Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
- Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
- Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
- Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
- Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
- Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
- Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
- Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
- McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
- Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
- Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
- Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
- Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
- Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
- Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
- Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
- Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
- Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
- Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
- Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
- Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
- Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
- Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
- Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
- Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
- Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
- Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
- Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
- Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
- Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
- Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
- Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
- Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
- Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
- Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).
