Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Published: April 30, 2014 doi: 10.3791/51354
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

Summary

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı soy.

Abstract

Nedeniyle in vivo miyojen programı eğitim ile ilgili doğasında zorluk ve zaman, iskelet kasının yerleşik yetişkin kök hücrelerinden elde edilen primer kültür sistemleri, miyojenik öncü hücreler (MPCs), memeli iskelet kas gelişimi anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmış ve var büyüme. Özellikle OMURGALI bazal takson arasında, ancak, veri kendini yenileme, çoğalmasını ve MPCs farklılaşmasını kontrol eden moleküler mekanizmaları açıklayan sınırlıdır. Özellikle ilgi apendiksinde kaybı (yani urodele amfibi) sonra hatırı sayılır postlarva iskelet miyofiberde oluşan hiperplazi (yani Kemikli balıklar) ve tam rejenerasyon geçmesi bazal omurgalıların yeteneğini altında yatan potansiyel mekanizmaları vardır. Buna ek olarak, kültürlü miyoblastların kullanımı rejenerasyonu ve kas kaynaklı programın tekrarlama ve aralarındaki farklar anlaşılmasına yardımcı olabilir. KarşıBu amaçla, biz detaylı olarak sağlam ve verimli bir protokol tarif (ve varyasyonlar burada) daha ile başlayan, miyojenik programın evrimini anlamak için bir platform olarak hücre kültüründe, MPCs ve döl, miyoblastları ve olgunlaşmamış miyotüpleri izole ve bakımı için bazal omurgalılar. Zebra balığı (Br.rerio) model organizma durumuna Capitalizing, biz sazan dalının Danioninae küçük balıklar, bu protokolün uygulanması hakkında rapor. Paralel olarak, bu protokol Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) ve hatta laboratuar kemirgenlerden MPCs izole edilmesi suretiyle daha geniş bir karşılaştırmalı bir yaklaşım gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu protokol, artık yaygın gökkuşağı alabalık, somon, ve çipura 1-4 dahil olmak üzere çeşitli balık türleri, Miyogenesis okuyan kullanılmaktadır.

Introduction

Memeli Miyogenesis arasında dikkate değer bir anlayış C2C12 5, her iki primer fare (Mus musculus) miyoblast kültürleri ve iyi tanımlanmış bir fare-türevi hücre hattı bu sürecin tekrarlama yoluyla elde edilmiştir. 1950 6 başlayarak, bu kültürler diğer omurgalılarda uzantısı, Miyogenesis ile murinemyogenic programın anlayışında çok ilerleme yol açmış ve var. Buna ek olarak, tek bir hücre miyofiberde oluşan eksplant teknikleri uydu hücreleri ve çevreleyen myofibers 7-9 arasındaki etkileşimlerin bir anlayış üzerinden artmıştır. Hücre kültürleri edilir Miyogenesis araştırmalar için özellikle çekici dolayı kısa bir süre için ön-farklılaşmış hücre 10, RNAi için transfeksiyon nispi kolaylığı 11-14, 15,16 ve transgenik aşırı ekspresyonu çalışmaları 14,17,18, in vitro ve in vivo nakli 18-20 ardından genişleme ve hatta comptakson 21,22 karşısında miyojenik öncü hücreleri ve bunların düzenleyici ajanlar Arison'ın. Nedeniyle, kültür sisteminin yapay çevreye farkları 5,23 tarif edilmiş olsa da, bu in vitro sistemler çok çekirdekli oluşumunu düzenleyen karmaşık program eden diseksiyon vazgeçilmez olduğu kanıtlanmıştır, terminal olarak farklılaşmış myofibersfrom myosatellite olarak bilinen çoğalma progenitör hücreler mononükleer memeliler arasında hücreler (MSC).

Memeliler sınıfının dışında, ancak, Miyogenesis kontrol mekanizmalarının korunması ve / veya sapma kötü büyük ölçüde nedeniyle çeşitli takson miyojen öncü hücreleri (MPCs) ve miyoblastları kültüre de zorluk, anlaşılmaktadır. Gerçekten de, birinci miyoblast kültürler üç kuş 24-26, bir sürüngen 27, birkaç amfibiler, 28-30 ve bazı balıklar 1,3,4,31-33 'de tarif edilmiştir. Ettik ikinci sürekli miyojenik hücre çizgilerikemirgenler 34-36 dışındaki rtebrates Japon bıldırcını (Cortunix japonica) türetilmiş olan tek memeli olmayan miyogenik hücre hattı, QM7 37 ile daha da nadirdir. Ölümsüzleşme birçok girişimlerine rağmen, bir teleost miyojenik hücre hattı sürüncemede kalır ve bu hücrelerin etkili tarnsfeksiyon için bir protokol, bu yıl sadece 15 yayınlandı. Böylece, omurgalıların çeşitli birincil MPCs ve miyoblastları kültürleme için açık ve iyi optimize edilmiş protokoller çok daha miyojen programın evrim bilgimizi genişletmek için değil sadece, ama atılımlar yapmak için karşılaştırmalı fizyoloji gücünü istihdam için gerekli insan iskelet kası hastalık ve bozuklukların tedavisi.

Edebiyat MPC / myoblast izolasyon 38-49 birçok raporlar içerir iken, yazarlar kısa, genellikle eksik, biçimleri gibi izolasyonların protokolleri tanımlamak için yaygındır. Ayrıca, en öğretici protokolleri reported fareler 50-53 için geliştirilmiştir ve bunlardan bazıları bu protokoller kullanılamaz veya kas biyologlar tarafından kullanılan pratik içteki olmayan kemirgen türü yapma, antikor seçiminde 54,55 veya floresan transgenler 56,57 güveniyor. Görsel-işitsel rehberlik ve uzak akraba türlerde gösterdiği verimlilik ile tarif piscine, amfibiyene ve sürüngen Miyogenesis, ayrıntılı ve kapsamlı protokol, hakkında az bilinen ile, alanında en yararlı olacaktır.

Ilk kez 1989 yılında 58 Powell ve arkadaşları tarafından açıklanan, aşağıdaki protokol başlangıçta (yani, gökkuşağı alabalığı, Oncorhynchus mykiss, ve Atlantik somon, Salmo salar) salmonid balıklar ve bazı büyük sazanlar (yani balığı, Carassiusauratusauratus) den MPCs ve miyoblastları izole etmek için geliştirilmiştir . 2000 yılında, Fauconneau ve Paboeuf gökkuşağı alabalığı 59 için birincil myoblast kültür optimize edilmiş ve minoroptimizations maDanioninae dalının (zebra balığı, Danio rerio ve dev danio, Devario aequipinnatus) nedeniyle Zebra balığı iş için kullanılabilir birçok genetik araçları 32 ve böylece yakın akrabaları birkaç küçük balıklardır kullanılamaması bu protokol de. Kemikli balıklar nedeniyle (en azından çoğu türlerde) onların farklı büyüme stratejisi için çalışma için cazip organizmalardır. Büyük alabalık, çoğu balıklar gibi, hatta yaşlılıkta 60-62 yılında, olgunluk bir asimptot münezzehtir büyüme potansiyeline sahip, belirsizcesine büyür. Zebra balığı aksine, bu tür dev danio 63 ve teleost balık tipik bıyıklı danio ekran büyüme potansiyelleri, onların doğrudan yan yana PPK hücre kaderinin seçim hipertrofisi karşı iskelet kas hiperplazi bir rolü olup olmadığını anlamak için ideal bir platform yapmak gibi büyük danionins.

Aynı şekilde, nispeten yüksek hücre verimi ve VIAB ile, bu protokol, fareler ve axolotls ile kullanılabileceğini göstermiştirility endeksleri. Böyle Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) olarak Urodele semender, tüm uzuvlar ve kuyrukları 64-66 gibi dokularını yenilemek için olağanüstü bir yeteneği, sahip. Bu karakteristik iskelet kas kaybı ve yaşlanma bu amfibi ilginç modeller yapar. Bu tür çalışmalar için daha geniş bir karşılaştırmalı bağlam sağlayan, birçok balık türünün de yapıldığı gibi, aşağıda açıklanan protokolünü kullanarak, benzer bir yaklaşım yapılabilir. Gibi birçok gerçekten karşılaştırmalı biyolog veri (burada, bütün omurgalı soy) geniş spektrumu içinde analiz edildiğinde temel biyoloji ve dönüşümsel biyomedikal en anlamlı gelişmeler yapılabilir, takdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Açıklama: Burada açıklanan omurgalı hayvanları kapsayan tüm deneyler Birmingham Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önceden onaylanan ve Laboratuar Hayvan Refahı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Ofisi tarafından oluşturulan kurallar ile tutarlı edildi Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı.

Kültür 1. Hazırlanması

  1. (, 2 L başına 26,96 g 13,48 g / L) 9 mM NaHCO 3 (2 L başına 1.51 g), DMEM içinde 20 mM HEPES (2 L başına 9.53 g) aşağıdaki gibidir: orta taban hazırlayın.
    1. PH belirlemek HCI veya NaOH ile 7,40 ayarlayın.
    2. Ozmolaliteye belirleyin ve (gerekirse) NaCl ile ~ 300 mOsm ayarlayın.
    3. Filtre kadar 2-3 ay boyunca ışıktan korumalı 4 ° C (2) 1 L vakumlu sterilizasyon sistemleri ve mağaza ile sterilize edin.
      NOT: komple reaktif için Tablo 1 ve 2'ye bakınız, araçları, consumables ve ekipman bilgisi.
  2. Ultra saf, steril su, 50 ml γ-ışınlanmış poli-L-lisin, 5 mg (> 300,000 mw) eritilmesi ile poli-L-lizin ile muamele edilmiş plakalar hazırlayın. Lizin polimerlerin tam çözülmesini sağlayarak, oda sıcaklığında 10 dakika için ters çevirme ile yavaşça karıştırın.
  3. Plaka tipi (Tablo 3) uygun olarak, her bir kuyuya, poli-L-lisin çözeltisinin gerekli miktarda Pipet. Plakalar 5 dakika için laminar akış başlığı içinde beklemeye bırakın.
  4. Sonra, poli-L-lizin çözeltisi çıkarın ve steril su ile iki kez yıkanır. 20 dakika laminar akış başlığı içinde havada kurumaya plakaları izin verin.
  5. Laminin 1 mg (Engelbreth-Holm-Swarm kökenli) elde edilir ve 20 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar, taban ortamı, 50 ml içinde çözülür. / Cm 2 2 mg poli-L-lizin ile muamele hücre kültürü plakalarına laminin çözüm uygulanır. (Farklı plaka boyutları bkz. Tablo 3)
  6. Yavaşça fu sağlamak için bir çözüm girdapkapsama iyi ll. 24 saat boyunca laboratuvar bant ve inkübatör içinde yer plakaları Seal. Kuluçka kullanılan türleri için uygun bir sıcaklıkta (bkz. Tablo 7) ayarlanması gerekir, ve ek bir gaz kuluçka makinesine ilave edilmesi gerekir.
    NOT: laminin tohum hücreleri 24 saat önce plakalara uymak için izin verilmelidir. Aksi takdirde hiçbir hücre yapışması kötü sonuçlanacaktır.
  7. Tablo 4'te tarif edildiği gibi ortam hazırlar. Komple ortam iyi kullanım günü hazırlanır.
  8. Doku izolasyonu için hazırlık olarak, aşağıdaki öğeleri ve otoklav monte: 300-500 ml beher (ler); cam Petri kapları; neşter kolları; forseps (ince ve kaba); Diseksiyon makas; ve su itici otoklav kağıt birkaç yaprak.
    NOT: diseksiyon işlemi ile yardım her kişi için, (2) neşter sapları, (1) forseps (tip kişisel tercihinize bağlı), (1) diseksiyon makas ve su itici otoklav kağıt (5-10) levhalaryeterlidir.
  9. Yukarıdaki otoklavlanmış maddelerine ek olarak,% 70 etanol, ağırlık dengesi, steril 50 ml konik tüp (sayı kültür büyüklüğüne göre değişir) ve buz monte edin.

2.. Doku Diseksiyon

  1. Başlamadan önce, balık yeterli stok mevcut olduğundan emin olun.
    NOT: kullanılacak balık yaş kritik bir önem taşımaktadır. İki farklı türlerin balık benzer ağırlıkları olabilir, bir türün bir başka küçük balık türlerinin büyük bir balık daha fazla MPCs sahip olacaktır. Genel bir kural olarak, salmonidler çalışırken özellikle küçük balıklar gibi, en iyisidir. 4-6 aylık yaş ya da daha küçük (en fazla 15 g) alabalık uygun ise danionins için, bir yıla kadar eski balık, en iyi şekilde kullanılabilir.
  2. Bir steril 50 ml konik tüp içine izolasyon ortamının, kısım 25 ml kesilmiş edilecek doku, her 5 g için.
  3. , Kayıt kitle, ve sayı tüp (ler) tartılır. Tüpler buz üzerine yerleştirin.
  4. 2-3 balık Euthanize> 300 mg / L sodyum bikarbonat tamponlu tricaine metansülfonat daldırılarak bir zamanda. > 5 dakika son verilmesine ve daha sonra 30 saniye boyunca (steril kap içinde bulunan)% 70 etanol içinde balık daldırılması için operküler hareketine izin verir.
  5. % 70 etanol balık çıkarın ve su itici otoklav kağıda yerleştirin. Doğrudan opercula arkasında, yüzeysel, sığ bir kesi yapmak için bir neşter kullanabilirsiniz. Anılan kesi cilt tutarak ölçekler ve cilt kaldırmak ve balık kuyruk doğru çekin.
  6. Cilt çıkarıldıktan sonra epaxial, her iki taraftan balık hızlı glikolitik 'beyaz' kas (yan çizgi yakınında bulunan yavaş oksidatif 'kırmızı' kas kaçınarak) ve izolasyon ortamında yer tüketim. Kurum tarafından gerektiği gibi balıkların kalan atın.
    Not: epaxial m izole kırmızı kas kaynaklı kültür MPCs tamamen mümkün olmakla birlikte, teleost MPCs kullanılarak neredeyse her yayın kullanmıştır hücreleriyotome.
  7. Kas yeterli bir miktarı elde edilene kadar tekrar 2,4-2,6 adımları tekrarlayın. Diseksiyonu sırasında, havuza alınan kas dokusu hücre canlılığını korumak için buz üzerinde kalmasını sağlamak.

3.. Mekanik Ayrılma

  1. , Cam bir Petri kabı içine, kas dokusu 25 ml / 5 g bir tüp dökün. İki neşter kullanılarak bağlı ekli # 10 neşter, bir bulamaç veya püre kıvamına kıyma doku ile işler. Birbirine geçmiş neşter bıçakları çekerek bir "arka-ve-ileri" hareket iyi çalışır.
    NOT: doku homogenızers uygun görünse kaldırıldı değilse, canlı hücrelerin sayısı önemli ölçüde azalacaktır.
  2. 25 ml serolojik pipet ve serolojik pipet kullanarak, bulamaç haline dokuyu çıkarmak ve orijinal konik tüp içinde değiştirin.
  3. Tüm tüplerindeki tüm doku mekanik ayrışmış kadar tekrarlayın 3,1-3,2 adımları.
  4. 300 xg 5 dakika ve 10 ° C için doku santrifüj
  5. Follsantrifüj ötürü, 25 ml'lik bir pipet serolojik, vakum aspiratör veya dikkatli olarak süzüldü medya süpernatanın 25 ml atın.
  6. Her bir tüp, tekrar süspansiyon dokuya yıkama ortamı içinde 25 ml ilave edilir, ve yukarıdaki gibi recentrifuge.
  7. Süpernatan her kaldırma yıkama ortamı ile iki kez yıkanır.

4. Enzimatik Ayrılma

  1. Aşama 3.4 esnasında (0.11 g/0.22 ml 'de ya da yeterli bir miktarda) Tip IV kolajenaz 0.22 g ve taban ortamı 44 ml birleştirerek kolajenaz solüsyon hazırlanır.
  2. 4 ° C'de 10-15 dakika süreyle bir beher içinde ilave edin Filtre 50 ml'lik bir şırınga ve bir 0.45 um şırınga filtre ile sterilize edin.
    NOT: Birden fazla şırınga filtre kollajenaz hazırlık bağlı olarak gerekli olabilir. Worthington Biyokimyasal dışındaki satıcılarından elde Kolajenaz filtrasyon sırasında fazla zorluk teşkil etmektedir. Kolajenaz endomysium oluşturan kollajen peptid bağlar ayırmak için kullanılır. Busindirim myofibers bu koruyucu bariyeri kaldırır.
  3. Kas dokusunun her bir g için,% 0.2 'lik kolajenaz çözeltisi içinde tekrar süspansiyon doku. Kas dokusunun 5 g için, kollajenaz çözelti 10 ml ve taban ortamı 15 ml ekleyin.
  4. Kolajenaz çözeltisi / baz ortamında (25 ml, örneğin 250 ul) içinde ml başına PSF 10 ul ekle. Bu enzimatik sindirme verimini etkileyecek gibi, doku de süspansiyon haline olduğundan emin olun.
  5. Hafif sallama ile 18 ° C 'de 60 dakika boyunca kolajenaz kas dokusu inkübe edin. Bu hücre canlılığı etkileyebilir, ancak mekanik ayrışma ve türlerin derecesine bağlı olarak, sindirim kolajenaz, 90 dakika için uzatılabilir.
  6. 12 ° C'de 5 dakika boyunca 300 xg'de kolajenaz sindirimi, konik santrifüj tüpleri izlenerek Yıkama ortamı içinde 25 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon doku atın.
  7. Recentrifuge 5 dakika boyunca 300 x g 'de 12,6; C. Yıkama ortamının ile ikinci kez tekrarlayın.
  8. Yıkama doku iki kez, 10 ml serolojik pipet ile yıkama ortamı ve trituratının 25 ml tekrar süspansiyon kas dokusu dokusu / orta homojenatında göreli kolaylıkla pipet ve geçinceye kadar sonra. 5-10 toz haline getirilmesini genellikle yeterlidir.
    1. 5 ml'lik bir pipet serolojik ve daha sonra bir şınngaya bağlanmış bir 16 gauge metal kanül ile tekrarlayın.
  9. 12 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin konik borular Süpernatant süzün.
  10. Yukarıdaki 5 dakika santrifüj sırasında, taban ortamının 5 ml tripsin 0.25 g birleştirerek tripsin sindirim solüsyon hazırlanır.
  11. 10-15 dakika ve filtre, bir 20 ml şırınga ve 0.45 um şırınga filtre ile sterilize boyunca 4 ° C'de karıştırılır.
  12. Konik tüpler almak ve her bir tüpe kas dokusunun her 1 g tripsin çözeltisinin 100 ul ve ayrışma ortamı içinde 4.9 ml. EXA içinör., Tripsin çözeltisi 500 ul ve kas dokusunun 5 g ayrışma ortamı içinde 24.5 ml.
    Not: Tripsin bazal lamina kas kaynaklı öncü hücreleri ayrı bir serin proteazdır.
  13. Süspanse tripsin / ayrışma doku orta iyi. 18 ° C'de 20 dakika inkübe
  14. 12 ° C'de 1 dakika boyunca 300 xg'de ilk tripsin inkübasyon, ardından santrifüj tüplerine konik
  15. Izolasyon ortamının 4 hacimlerine yüzer 1 hacim konsantrasyonunda izolasyon ortamı ile süpernatantlar birleştirerek tripsin nötralize. İkinci tripsin sindirim sırasında 4 ° C'de saklayın.
  16. Dokusunun geri kalan topak için, tekrar birinci tripsin sindirimden süpernatan / izolasyon ortamı ile adım 4.15 sonra süpernatant birleştirerek, 4,12-4,15 yineleyin.
  17. Alternatif olarak: kolajenaz ve tripsin sindirimler hücre verimi maksimize etmek için birleştirilebilir. <ol>
  18. Bunu yapmak için, homojenat kolayca kanül geçer kadar kolajenaz, 20 ml şırıngaya bağlanmış bir metal (uzunluğunda, 6 ve 16 ölçü en uygun) bir kanül ile sindirmek çiğnemek.
  19. Homojenat için (adım 4.10 hazırlandı) tripsin çözeltisi 500 ul ekleyin ve 20 dakika boyunca 18 ° C'de inkübe edin.
  20. 12 ° C'de 1 dakika boyunca 300 xg'de inkübasyon, konik santrifüj tüpleri izlenerek
  21. Izolasyon ortamının 4 hacimlerine yüzer 1 hacim konsantrasyonunda izolasyon ortamı ile süpernatantlar birleştirerek tripsin nötralize.
  22. İkinci tripsin sindirim sırasında 4 ° C'de saklayın.
  23. Standart protokol gibi adım 4.18 ile devam edin.
  • 300 x g hızında 50 ml konik santrifüj tüpleri ve içine nihai süpernatan / izolasyon ortamı karışımı dağıtın 12 ° C'de 10 dakika boyunca
  • Kaldır hücre bozmamaya özen yüzerPellet. Pipet her bir hücre pelletini eritilmesi Her tüpe tam ortam 2 ml,.
  • Bir 50 ml konik bir tüp içinde tam bir ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler birleştirin.
  • Yeniden süspansiyon haline getirilmiş, daha önce hücre havuzu ile birleştirerek, komple ortam 1 ml her bir tüp durulayın.
  • Bir metal kanül ile toz haline getirin ve 5-10 kez şırınga.
  • Tam ortam ile durulama, bir 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre.
  • 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre.
  • 50 ml için yeterli tam ortamı ilave edin ve 15 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj

    • 5.. Sayma, seyreltme ve Hücre Tohumluk

    1. Adımda 4.25 final santrifüj takiben, dikkatli aktarmadan veya serolojik bir pipet ile süpernatant kaldırmak. Tam ortam 5 ml hücre pelletini.
    2. Hücreler tamamen yeniden süspanse ile, 20 ul kaldırmak, Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu ile yer.
    3. Trypan mavi boya 5 ul ekleyin ve 5 dakika bekleyin. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını belirler.
    4. Belirlenmesi üzerine, gerekli konsantrasyona hücreleri seyreltin. Teleostlar'ın MPCs iyi cm2 başına 150.000-200.000 hücre tohumlanır. Altı-çukurlu kaplama strateji için, 1.5 x 10 6 hücre seyreltilmesi -, ml başına 2.0 x 10 6 yeterli proliferasyonunu ve farklılaşmasını destekler.
    5. Poli-L-lizin ile muamele edilmiş, laminin kaplanmış plakalar ve tohum hücreleri al. (Levha özel dilüsyonları ve kaplama miktarlar için Tablo 5 e bakınız.) Not: Tablo 6 çeşitli teleost türlerinden izole edilmiş kas dokusunun her bir gramı izole edilmiş hücrelerin ortalama sayısını tasvir etmektedir. Gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) do zebrabalıkları (D. rerio) göre kas dokusunun her bir gramı başına daha az MPCs gösterirler ve böylece uygun tohumlama için izole etmek için daha fazla balık gerektirir.
    6. Uygun sıcaklıkta soğutma inkübatör laboratuvar bant ve yer plakaları Seal. (Fareler için kaydetmek) Burada listelenen tüm türlerden MPCs karbon dioksit (CO 2) takviyesi olmadan normal atmosferik koşullar altında inkübe edilebilir. (Bkz Tablo 7).
    7. ALTERNATİF: Bazı laboratuvarlar MPCs 40 dakika boyunca kültür katmanlarından uymak için izin gerektiren bir protokol kabul etmiştir.
      1. Daha sonra herhangi bir gevşek biçimde bağlanmış ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için yıkama ortamı ile plakaları yıkayın. Uyarı: Bu adım kültür katmanlarından diğer hücrelerin "non-spesifik" yapışma (örneğin fibroblastlar) önlemek için çok önemlidir.
      2. Inkübatör tam medya ve yer hücreleri ekleyin ve aşağıda detaylı olarak bakımı.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Yirmi dört saat sonra tohumlama, miyojenik öncü hücreleri (MPCs) (Şekil 1a ve 1d bakınız) laminin alt tabaka bağlı görünür olmalıdır. Tohumlamadan sonra, hücreler (MPCs) bu hücre tipi göstergesi olan bir mil benzeri bir şekle, (Şekil 1) kabul etmek ve MyoD1 + (Şekil 2) vardır. Danio türlerde, MPCs Oncorhynchus ve Salmo türlerden MPCs göre daha küçük bir bipolar işlemleri ile daha küçük olduğu görülmektedir. Ancak, kültür dört gün boyunca, incelenen tüm balık türlerinin MPCs benzer morfolojiye benimsemek ve iskelet gibi belirgin bir görünüm (Şekil 1b ve 1e). Komple ortam kaldırılmalı ve MPCs yıkama ortamı ile iki kez yıkanır olmalıdır. Miyofibroblastlar miyojenik kültürleri kirletebilir ve (myoblast ve iğ şeklinde karşı) onların yıldız gibi morfoloji MPCs / miyoblastların kolaylıkla ayırt edilebilir olabilir. Plakaların yıkama büyük ölçüde ifibroblastlar kaldırılmasını mproves.

    (Bkz. Tablo 7) Burada tarif türler, günlük medya değişiklikler iyi sonuçlar üretir. MPCs ve döl (miyoblastlardır ve oluşmakta olan miyotüpleri) önce taze tam ortam ilavesi ile bir veya iki kez yıkanmalıdır. Hücreler, kesin bir miyoblast aşama (kültürün yaklaşık olarak 4 gün) ulaştıktan sonra Seçenek olarak ise, ortam değişikliği her gün için azaltılabilir. Miyotüpleri, 2-3 gün içinde (Şekiller 1c ve 1 f) oluşturur (Şekil 2) + myogenin olması, özellikle farklılaşma ortamı içinde kültürlendi (aşağıya bakınız) gerekir. Haftalar ve aylar süreleri bir kaç memeli türünden rapor edilmiş olmasına rağmen, balık ve MPCs miyoblastlardır zaman aralığında tolere görünmüyor. Hücreler kültürünün ilk altı gün günde 7 ve kültür 9-11 arasındaki müteakip farklılaşması ile (Şekil 3), için çoğalırlar. Daha sonra, hücreler yaşlılık ya da birpoptose.

    MPCs ve bunların soyu bu protokolü kullanılarak izole miyojenik doğası gen ekspresyonu göre 3,32,33 tespit edilmiştir. Hücrelerin kültür 6-9 gün boyunca olgunlaşmamış miyotüplerinin meydana olarak algılanabilir hızlı artışlar, (primer veya murin miyoblastları C2C12 kullanan sistemlere kıyasla) memeli kültür sistemlerinin aksine, MPCs ve miyoblast döl çoğalması kültürün ilk günlerinde nispeten düşüktür Danio türler 32. Gökkuşağı alabalığı Raporlar (memeli myoblast kültürlerde yaygın, ancak balık sistemlerde gerekli değildir) bir farklılaşma orta kullanılan ve miyotüp oluşumu 33 beklendiği gibi çoğalması endeksler azaltmak işaret var. Hücresel yaşlanma ya da apoptoz meydana gelmeden önce bizim ellerimizde, çıkan miyotüpleri kadar 9-11 gün (Danio türleri) kültürde kalır ve 11-13 gün (Oncorhynchus türleri) olabilir.

    Reaktif Şirket (Tercih v. Alternatif) Katalog Numarası (Tercih v. Alternatif) Kültür başına miktar
    γ-ışınlanmış poli-L-lisin Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (yüksek glukoz) Sigma-Aldrich (Cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodyum Bikarbonat (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8 H 18 N 2 O S 4) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiyotik / antimikotik Thermo Scientific (SIGMA-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 ml
    Gentamisin Sülfat Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 ml
    Donör Atçılık Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mi
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mi
    Kollajenaz (Tip IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Tripsin (pankreasından alınan) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g

    Tablo 1. Tercih üreticiler ve katalog numarası ile Detaylı reaktif liste.

    Tüketilir Araçlar Ekipman
    Hücre Kültürü Plakalar Forseps (Kaba) Serolojik Pipet
    Steril 50 ml konik tüp Forseps (Güzel) pH Ölçer
    Laboratuvar Teyp Neşter Kolları Soğutma Kuluçka (Echotherm)
    0.2 um sterilizasyon vakum sistemleri Neşter Bıçaklar (# 10, # 11) Laminar Flow Hood
    Su itici Otoklav Kağıt Cerrahi Makas Vakum Manifold
    Serolojik Pipetler Cam Petri kapları Microosmolality Metre
    Luer Kilitler ile 12-16 G kanüller

    Hücre kültürü için gerekli Tablo 2. Sarf, alet ve ekipmanlar.

    Plaka Boyutu Well başına 2 cm Poli-L-lisin * Laminin **
    6 yuvalı 9.5 1.6 mi 1
    24 gözlü 1.9 0.32 0.2
    48 çukurlu 0.95 0.16 0.1
    96 gözlü 0.32 0.06 0.03
    * 0.1 mg / ml konsantrasyon ** 0.020 mg / ml konsantrasyon

    Tablo 3. Poli-L-lisin ve laminin ile hücre kültürü plakaları kaplamak için birimler optimize edilmiştir.

    Reaktif Izolasyon Yıkama Ayrışma Tam
    Baz Orta 419,25 ml 395,40 ml 297.00 ml 178.00 ml
    PSF * 5.00 mi 4.00 mi 3.00 mi 2.00 mi
    Gentamisin Sülfat ** 0.75 mi 0.60 mi - -
    Donör Equine Serum 75.00 ml - - -
    Fetal Bovine Serum *** - - - 20.00 ml
    * PSF: penisilin / streptomisin / fungizon kokteyli (100x); ** / Ml konsantrasyonu 50 mg; *** Karakterize

    Tablo 4.. Miyojen öncü hücreler (MPCs) izolasyonu ve kültürü için farklı medya hazırlıkları.

    <td> 9.5
    Plaka Boyutu Well başına 2 cm Seyreltme Kaplama Hacim
    6 yuvalı 1,5-2,0 x 10 6 hücre / ml ' 1 mi
    24 gözlü 1.9 1,5-2,0 x 10 6 hücre / ml ' 250 ul
    48 çukurlu 0.95 1,5-2,0 x 10 6 hücre / ml ' 150 ul
    96 gözlü 0.32 1,5-2,0 x 10 6 hücre / ml ' 50-100 ul

    Tablo 5. Hücre kültürü plakası sıra boyut tarafından Önerilen seyreltikleri ve kaplama hacimleri.

    Tür Ortalama # hücre / g doku
    Br.rerio 6400000
    Danio dangila 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    Oncorhynchus mykiss 66800

    . Çeşitli teleost türlerinin kas dokusunun 1 gram izole miyojen öncü hücrelerin Tablo 6 ortalama sayısı: Br.rerio (zebra balığı), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (dev danio) ve Oncorhynchus mykiss (Gökkuşağı alabalığı).

    Tür Sıcaklık
    Danio / Devario spp. 26 - 28 ° C
    Oncorhynchus / Salmo spp. 10 * - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * Düşük sıcaklıklar düşük çoğalma oranlarını destekler.

    Piscine ve amfibi miyojen p Tablo 7. Önerilen inkübasyon sıcaklıklarırecursor hücreleri (MPCs).

    Şekil 1
    Şekil 1.. MPCs (soldaki) Temsilcisi parlak alan görüntüleri, miyoblastlardır (orta), ve erken miyotüpleri (sağdaki), iki türün, gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss, üst) ve Zebra balığı (Danio rerio, alttan) dan.

    Şekil 2,
    Şekil 2. MPCs Temsilcisi immünositokimyasal boyama (a, c) ve miyotüpleri (b, d) izole edilmiş ve dev danio (Devario aequipinnatus, üst) ve gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss, alt) kültüre. Kültürde, miyoblastlardır MyoD1 + pozitif (a, c) vardırticari olarak temin edilebilen MyoD1 + antikorlar kullanılarak görselleştirildi olarak (danio: C-20, Santa Cruz Biotechnology; alabalık: NB100-80899, Novus Biologicals). (:; Alabalık M-225: SC-567, Santa Cruz Biotechnology, her iki danio) miyoblastlardır ayırt Buna ek olarak, bu (b, d) ticari olarak temin edilebilir antikorlar kullanılarak myogenin görselleştirildiği gibi myogenin ifade eder.

    Şekil 3,
    Şekil 3,. Kültürde zaman hücre çoğalması hızları ölçmek için BrdU kullanılarak Örnek hücresi çoğalma verileri. Dev danio 67 izole ve kültür MPCs elde edilen veriler.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Miyojenik programı, hangisi incelenen türlerin içinde, en kolay bir in vitro sistemi ile incelenebilir. Nitekim, izolasyon üzerine, miyojenik öncü hücreler (MPCs) balık veya memelilerde myosatellite hücreler (MKH) kolayca çoğalması, hücre döngüsü çekilmesi ve miyoblastların terminal farklılaşma ve doğmakta myotubes bu miyoblastların kaynaşmasını içeren çok iyi düzenlenmiş bu süreci girin. (Zebrabalıkları 67 ve 69 gökkuşağı alabalığı olası hariç) balık türlerinin transgenik gen haberci soylarının yetersizliği, MPC / MSC aktivasyon, proliferasyon ve farklılaşma vivo çalışmaları kısıtlar ve bu nedenle burada sunulan in vitro bir sistem olup balık türlerinde çalışmalar için cazip bir platform.

    MPC / MSC, hiçbir madde türleri, Başarılı kültür sterilite için) titiz dikkat derece bağlıdır; iskelet kas t b) kapsamlı mekanik ayrışmakonu; ve c) enzimatik sindirme optimizasyonu. Kas dokusu tecrit başlangıç ​​aşamaları sırasında, büyük bir dikkatle doku için gerekli miktarı bir kirlenme olmadan kesilir olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. Balık (veya herhangi bir hayvan, bu konuda kullanılmaktadır) uygun bir şekilde% 70 etanol içinde ve yeterli bir süre için dezenfekte edilir olması büyük önem taşımaktadır. Bizim ellerde, 30 saniye iyi çalışır; daha kısa zaman süreleri kirlenme ve doku bütünlüğü ve hücre canlılığının artık kaybına neden olabilir. Etanol, bir sabitleyici olarak kullanılabilir, bu nedenle bakım diseksiyon önce balık kurutmak için dikkat edilmelidir. Diseksiyon bir laminer akış hücre kültürü kaputu dışında yapılabilir; Ancak, biz bu sürecin olası bakteriyel veya mantar kontaminasyonu en aza indirmek için bir kaput içinde yapılması önerilir.

    Yukarıda tarif edilen mekanik ayırma ilk ham ve / veya sıkıcı görünse de, bu izolasyon prosedürü için çok önemlidir. İki büyük neşter bıçakları çekti geçmiş(video protokolü gösterildiği gibi) bir kayma hareketinin birbirlerine, en iyi sonuçları verir. Tamamlandığında, homojenat kıvamı bir bulamaç veya püre bu olması ve kolayca geniş çaplı bir serolojik pipet (örneğin, 25 mi) ile toplandı gerekir. Bunun için, daha iyi bir mekanik ayrıştırma, MPC / MSC verimi ve daha iyi bir kültür elde edilen yüksek olur. Kötü ayrışma enzimatik sindirim engelleyen ve hücre verim düşecektir. Dikkate alınması için cazip olsa da, elektrikli doku homojenizatörlerin kullanımının önemli ölçüde az piscine MPCs ile, onun belirgin kolaylık rağmen hücre canlılığı düşürür.

    Tüm iletişim kuralları gibi, yukarıda ayrıntılı olarak verilen prosedürün optimizasyonu çoğu zaman gereklidir. Bu birkaç danionin türler ile işimizde gerçek kanıtlanmıştır. Laboratuvarımızda sonuçlar küçük danionins (örn. Zebrafish) büyük türler do (örn. gi den iskelet kası gramı başına daha fazla verim MPCs belirtmekkarınca ya da bıyıklı danio). Kolajenaz (% 0.3) daha yüksek bir konsantrasyonu, daha küçük bir türden doku ile birlikte kullanılır, ancak bu sadece gerçekleştirilmiştir. Bizim ellerde,% 0.2 konsantrasyon (örneğin gökkuşağı alabalık; kıyasıya alabalık [Oncorhynchusclarki], Chinook somon [Oncorhynchustschawytscha]) alabalık için uygun olan, büyük danionins, axolotl (Ambystomamexicanum) uzuv ve kuyruk, ve hatta fare iskelet kası. Aynı şekilde, bakım uygun kolajenazı seçmek için alınmalıdır. Bizim tecrübelerimize göre, tip IV kollajenaz gibi kemik ve kas (yani kollajenaz tip II) 70 gibi lifli dokular için önerilen kollajcnazların çok daha iyi hücre canlılığını korur. Sindirim daha kısa bir süre içinde daha tam olarak da, hücre membranı reseptörü bütünlüğü muhtemelen bu terkiplerde triptik artan aktivitesi ile tehlikeye girer. Tripsin ile ilgili olarak, laboratuvar her zaman daha kaba tripsin hazırlanması pur kullanmıştırdaha çok mevcut olan "saf 'den preparasyonlar, domuz pankreasından ified. Çeşitli türleri ile kültür faaliyetlerinde, biz değişen tripsin konsantrasyonlarda az yararlı etkisini fark etmiş.

    Tritürasyon Bu protokol önemlidir. Her iki iskelet kası elyaflı matrisi ayrışarak ve bu arada elle myofibers yapısal bütünlüğünü bozan triptik sindirim için yüzey alanını arttırır. Ezilmesi yaparken, gittikçe daha küçük delik pipet ve kanüller kullanılarak kanül ve şırınga kaldırdık kullanmaktan çok daha kolaydır. Bir kanül ve şırınga ile ezilmesi doğrudan devam edildi takılı kanüller ve / veya hücrelere uygulanan aşırı basınca neden olabilir. Yeterli triturasyonun olmadan triptik sindirim uygulanması önemli ölçüde hücre verimleri azaltacaktır.

    Bir kez izole edilmiş, kültür işlemi oldukça basittir. Bugüne kadar pek çok yayın bir protokol zekâ kullanılan varçoğalma ve farklılaşma dahil olmak üzere, kendi 33,71-75, hem de h bir ortamı; Bununla birlikte, birçok Fransız araştırmacılar tarafından yazılan yazılar daha yeni bir ayrı temel ortam ve çoğalması ve farklılaşması için 33 serum içerikli, bir iki ortam protokolü tarif eder. Bu 'yeni' protokol daha yakından kemirgen MKH'lerin ve myoblastsand kültüründe kullanılan erken evre miyoblastların 33 çoğalmasını artırmak için görünür ve çoğalmasını ve / veya hücre farklılaşmasını kontrol etmek daha uygun olabilir taklit eder. Ancak, gen ifadesinin geniş bir tanımlama olmaksızın, bu tür bir 'çoğalma' ortam aynı zamanda geleneksel bir ortam yapan bir yöntem daha 'miyoblast benzeri' durumunu korur olup sonucuna zordur. Transkript veya protein seviyesinde olsun, gen ifadesini açıklayan Önceki yayınlar, geleneksel bir medya protokolünü 3 ile bildirdi. Alternatif olarak, tek bir ortam (Farklılaşması için proliferasyon ve% 2 için% 10: DMEM), burada tarif fetal sığır serumu (FBS) içinde, farklı konsantrasyonları ile desteklenebilir.

    Memeli hücre kültürü sistemleri kullanan araştırmacılar, bu hücrelerin kültivasyonu için karbon dioksit atmosfer kullanılarak alıştırıldı olsa da, farklı bir yaklaşım için karasal ve su gaz değişimi araması arasındaki içsel farkları MPCs de dahil olmak üzere, piscine ya da suda sınırlı urodele hücrelerin kültürlenmesi zaman. Ve sodyum bikarbonat (NaHCO3) -: burada ayrıntılı Media bir piperazin türevi, zitteriyonik organik bileşik [(2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit 4 HEPES] ile tamponlanır. Bu nedenle, gaz enjeksiyonu ile bir inkübatör gerekli ya da bu hücrelerin kültürü için gerekli değildir. Sıcaklıklar kültür piscine gerekli ve urodele MPCs 18-26 ° C arasında değişmektedir Daha da önemlisi, bu tür kuluçka, değil, ısı daha serin yeteneğine sahip olmalıdır Bundan başka, salmonid MPCs c olabilir,ayrıca bir soğutma kuvöz için gereğini vurgulayarak, gerekirse düşük sıcaklıklarda ultured. (Daha önce iletişim gibi başka araştırmacılar gibi) ek olarak, bulduk kültür plakalarının bu sızdırmazlık hücre canlılığını korumak için gereklidir. Sadece standart laboratuvar bant ile kültür kapak ve plaka arasındaki arayüz sarılması bu hedefi gerçekleştirmek için yeterlidir.

    Hem birinci MPCs / MSC / miyoblastların pasajı, memeli hücre kültüründe yaygın olsa da, balık hücreleri, en azından (kültürün yaklaşık 6 gün) geç Mb aşamasından önce mümkün görünmemektedir. Bu nedenle, çoğalmasını desteklemek ve deney hedeflerine ulaşmak için yeterli hücrelerin uygun sayıda kültürün başlangıcında ekildi gerekir. Beklenenden daha az hücre verimler elde edilmektedir Bundan başka, eğer, bu hücrelerin yayılmasına ve daha sonra soyu replate mümkün değildir. Biz extracel üzerinde artan güven için bu özelliği atfedilen varpiscine MPC / miyoblastların lular matriks (ECM). Alternatif olarak, bu alt-tabakanın bir laminin artifakt ve balık MPC / Mb çoğalması ve farklılaşması için gereken garanti edilir ECM bileşenleri böylece daha fazla deneysel belirleme olması mümkündür. Biz işbirlikçileri birkaç başarılı kültür substratum geç gelen evre miyoblastları (~ kültürün gün 6) çıkarılır ve bu hücreleri (JM Froehlich ve PR Biga, kişisel iletişim) replated olduğunu, ancak, not yok.

    Buna benzer, bu protokol veya bir, RT-PCR 3,71-74,76-78, Western blot 32,79-81, immünositokimya 32,33, çoğalma tahlilleri 32,33,59, 15, gene, morfometrik içeren deney kullanılarak analizi 78, toksikoloji tarama 82, ve kromatin immünopresipitasyon (ChIP; JM Froehlich ve PR Biga, yayınlanmamış sonuçlar) yapılmıştır. Ancak, vitamin ek daha Tanımlarro protokolleri, pasajlanmasını ve klonal içeren, yani bu, çok ihtiyaç vardır. Nitekim, Rodgers laboratuvar 15 gökkuşağı alabalığı miyoblastların transfeksiyonunu uyarılması için bir protokol optimize ederek piscine MPCs / miyoblastların kültüründe önemli gelişmeler kaydetmiştir. Bu metodolojiye dayanarak, RNAi veya iskelet kas-spesifik hedefleri sürekspresyonuna teleost balıkların yaşam boyu büyüme yörüngeleri ile ilgili olduğu öne, özellikle de içeren daha ileri araştırmalar yalnızca mümkün değil, ancak su ürünleri yetiştiriciliği ve biyomedikal alanlarında önemli gelişmeler yol açabilir Bilimin.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Ifşa hiçbir şey yok.

    Acknowledgments

    Yazarlar Dr için çok teşekkürler sunarım. Küçük balıklar ve kurbağalar için bu kültür protokol geliştirme ve uygulama, mesleki uzmanlık için Josep Planas ve Juan Castillo. Teşekkürler nedeniyle yorulmadan Matthew, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall Şarj dahil olmak üzere birçok balık (türlerin ve sayı hem de), kas dokusu diseksiyonu ve ayrışma ile destekli olan sayısız bireyler de vardır Ben Meyer, Ethan Remily ve Sinibaldo Romero. Bu çalışma Biyoloji start-up fonları Birmingham Bölümü, Proteaz Araştırma NIH Hibe # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 için Merkezi'nde Alabama Üniversitesi tarafından desteklenen ve SORUN için NDSU Advance İLERİ NSF Grant # İKG-0811239 edildi. Desteği de UAB Beslenme Obezite Araştırma Merkezi ödülü # P30DK056336, NIH NIDDK tarafından sağlandı. Onun içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka illeNIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
    2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
    3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
    4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
    5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
    6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
    7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
    8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
    9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
    10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
    11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
    12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345 (2010).
    13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
    14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
    15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
    16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
    17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
    18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
    19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
    20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
    21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
    22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
    23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
    24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
    25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
    26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
    27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
    28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
    29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
    30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
    31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
    33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
    35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
    36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
    37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
    38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
    39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
    40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
    41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
    42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
    43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
    44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
    45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
    46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
    47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
    48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
    49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
    50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
    51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
    52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
    53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
    54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
    55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
    56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
    57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
    58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
    59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
    60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
    61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
    62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
    63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
    64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
    65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
    66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
    67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
    68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
    69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
    70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
    71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
    72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
    73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
    74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
    75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
    76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
    77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
    78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
    79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
    80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
    81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
    82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
    83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

    Tags

    Temel Protokol Sayı 86 Miyogenesis zebra balığı miyoblast hücre kültürü dev danio bıyıklı Danio miyotüpleri çoğalma farklılaşma Danioninae axolotl
    Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Froehlich, J. M., Seiliez, I.,… More

    Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter