Summary
Ce protocole décrit l'enregistrement extracellulaire des réponses potentielles d'action tirés par les neurones gustatifs labellar chez la drosophile.
Abstract
La réponse du périphérique goût des insectes peut être puissamment étudié avec des techniques électrophysiologiques. La méthode décrite ici permet au chercheur de mesurer les réponses gustatives directe et quantitative, reflétant l'entrée sensorielle que le système nerveux des insectes reçoit de stimuli du goût de son environnement. Ce protocole décrit les principales étapes de l'exécution de cette technique. Les étapes essentielles de l'assemblage d'un appareil de l'électrophysiologie, tels que la sélection de l'équipement nécessaire et un environnement approprié pour l'enregistrement, sont délimitées. Nous décrivons également comment se préparer à l'enregistrement en faisant électrodes de référence et d'enregistrement appropriés et des solutions exhausteur de goût. Nous décrivons en détail la méthode utilisée pour la préparation de l'insecte par insertion d'une électrode de référence de verre dans la volée pour immobiliser la trompe. On montre les traces des impulsions électriques alimentées par les neurones gustatifs en réponse à un sucre et d'un composé amer. Aspects du protocole sont techniquement difficile et nous incluons une description détaillée de certaines difficultés techniques communes que l'on peut rencontrer, comme l'absence de signal ou de bruit excessif dans le système, et les solutions possibles. La technique a ses limites, comme l'impossibilité de livrer stimuli temporellement complexes, observer fond de tir juste avant stimulus livraison, ou utiliser des composés de goût insolubles dans l'eau facilement. Malgré ces limites, cette technique (y compris les variations mineures mentionnées dans le protocole) est une procédure standard largement accepté pour l'enregistrement des réponses neuronales Drosophila goûter composés.
Introduction
Le sens du goût permet un insecte de détecter une vaste gamme de produits chimiques solubles et joue un rôle important dans l'acceptation d'une substance nutritive, ou le rejet d'un être nocif ou toxique. Le goût est aussi pensé pour jouer un rôle dans le choix du conjoint, grâce à la détection des phéromones 1-5. Ces fonctions importantes et diversifiées ont rendu le système de goût insecte une cible irrésistible de l'enquête sur la façon dont les systèmes sensoriels traduisent les signaux environnementaux en sorties comportementales pertinentes.
L'unité principale du système de goût de Drosophila melanogaster est le poil de goût, ou sensille. Molécules entrent dans le sensille via un pore à son extrémité 2,6. Sensilles se trouvent sur le labelle, les jambes, le bord de l'aile, et le pharynx 6. Sur le labelle, le nombre et l'emplacement des sensilles est stéréotypés. Il existe trois classes morphologiques de sensilles fonction de la longueur: long (L), intermédiaire (I), et court (S ) Sensilles 7,8. Chaque sensille contient soit deux (de type I) ou quatre (L-et S-type) neurones récepteurs gustatifs (GRNS 9). Différents GRNS répondre aux différentes catégories de stimuli du goût: amer, le sucre, le sel et l'osmolarité 7,10 et expriment différents sous-ensembles de récepteurs gustatifs 8,11-13. Seulement I et de type S sensilles contiennent GRNS amères sensible 8,10. Le projet GRNS au ganglion subesophageal (SOG) et leur activation par des molécules de goût est relayé vers le système nerveux central supérieur pour le décodage, ce qui entraîne une réponse comportementale 6. Le nombre relativement faible de neurones et la susceptibilité à l'analyse moléculaire et comportementale rendre le système de goût Drosophila un excellent modèle pour l'étude des systèmes gustatives en général. La relative facilité avec laquelle le système peut être manipulé par une mutation génétique ou le système d'expression GAL4 UAS est aussi un outil précieux 14,15.
ontenu "> Parce que ces sensilla dépassent de la surface de la labellum, ils sont d'excellentes cibles pour l'électrophysiologie. L'allumage des GRNS peut être contrôlée en utilisant l'enregistrement extracellulaire. Historiquement, le procédé d'enregistrement de paroi latérale, qui utilise une électrode de verre inséré dans le sensille pour enregistrer l'activité neuronale, 26 a été la méthode d'enregistrement d'extrémité, qui mesure la réponse des neurones avec une électrode utilisée. Cependant, cette méthode est techniquement difficile à réaliser, et il est difficile d'enregistrer pendant longtemps à partir de chaque préparation. que délivre simultanément un exhausteur de goût, devenu depuis la méthode de choix 9,16. Il a été utilisé pour étudier le système de goût de Drosophila melanogaster 8,10,17,18 ainsi que d'un certain nombre d'autres espèces d'insectes 19-23. Elle a été grandement facilité par le développement de l'amplificateur tastePROBE, qui a surmonté l'un des principaux inconvénients de la méthode d'enregistrement de pointe en compensantla grande différence de potentiel entre l'électrode de référence et la sensille d'insecte, ce qui permet les potentiels d'action de GRN à être enregistrées sans amplification excessive ou de filtrage 24. Un autre développement important a été l'utilisation de tricholine citrate comme électrolyte enregistrement 25. STC supprime les réponses du GRN de l'osmolarité sensible et ne stimule pas la GRN sensible au sel, faire les réponses générées par tastants amères et le sucre beaucoup plus facile à analyser 25.Nous décrivons ici l'enregistrement de la drosophile labellar sensilles de pointe est actuellement effectué dans le laboratoire Carlson. Ce protocole explique comment établir une plate-forme appropriée de l'électrophysiologie, la façon de préparer la volée, et la façon d'effectuer des enregistrements de goût. Nous présentons également des données représentatives obtenues par l'enregistrement de sous-ensembles de la drosophile sensilles, ainsi que certains problèmes courants et les solutions possibles qui peuvent survenir lors de l'utilisation de cettetechnique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole suivant est conforme à toutes les directives de protection des animaux de l'Université de Yale.
Une. Réactifs et Préparation du matériel
- Installation de matériel d'enregistrement (figure 1A).
- Choisissez une chambre pour la configuration de plate-forme qui est exempte de grosses variations de température ou d'humidité et aussi isolé des sources de bruit électrique et mécanique, tels que les réfrigérateurs et les centrifugeuses.
Figure 1. (A) Vue d'ensemble de la configuration d'enregistrement de forage. Stéréomicroscope (a) est monté sur la plate-forme anti-vibration (b). Electrode de référence titulaire (c) est monté sur la plate-forme en face de la headstage (d), par l'intermédiaire de micromanipulateurs. Un tube en matière plastique de sortie (e) délivrer des trains d'air humidifié dirigé vers la préparation de la mouche est également monté sur til plateforme. Le headstage est connecté à l'amplificateur (f), qui est relié au système d'acquisition numérique (DAS) (g), qui est relié à un ordinateur (h). (B) Configuration d'électrodes et le tube de sortie:. Électrode de référence sur la gauche, l'électrode d'enregistrement sur la droite, et le tube de sortie de flux d'air dirigé à la préparation à la mouche Cliquez ici pour agrandir l'image. - Mont stéréomicroscope au centre de la table anti-vibration ou plate-forme.
- Fixez micromanipulateurs pour la préparation électrode de référence / contre les insectes et headstage / électrode d'enregistrement à gauche et à droite du microscope, respectivement, en utilisant des stands magnétiques.
- Mont tube en matière plastique de sortie dans une troisième micromanipulateur à l'arrière du microscope, orienté de telle sorte que l'ouverture du tube est dirigé vers l'emplacement de préparation mouche (voir figure 1B).
- Utilisant un tube en plastique souple, àTube en matière plastique de sortie du tachymètre à une fiole à vide partiellement remplie d'eau. Raccorder une petite pompe à air pour aquarium à bulles à travers l'eau dans le ballon, en engendrant un courant d'air humidifié à travers le tube en matière plastique de sortie vers la volée.
- Mont fibre optique source de lumière sur la table de vibration, orientant les sorties pour éclairer la préparation en réfléchissant la lumière par un morceau de papier blanc de carte directement en dessous de la préparation. Assurez-vous que la source de lumière ne repose pas sur la table. Remarque: l'avantage de refléter la source de lumière sur un disque de papier est double: il améliore le contraste, ce qui sensilles plus facile à visualiser, et il empêche le chauffage de la préparation qui résulterait de la lumière directe.
- Branchez amplificateur tastePROBE dans le système d'acquisition numérique (DAS), et le DAS dans un ordinateur personnel, conformément au manuel de fournisseur. Branchez la pédale de déclenchement à organiser et sous l'espace de travail. Remarque: les prises murales électriques isolés pour l'amplificateur et DAS sont hautement souhaitablemesure.
- Électriquement terre microscope, micro-manipulateurs, et source de lumière par la connexion des composants métalliques de table à l'aide des pinces crocodiles et des longueurs de fil électrique isolé et ruban électrique. Électriquement terre plate-forme de métal en se connectant à la construction de sol ou DAS, qui est relié à la terre par prise d'alimentation.
- Installez le logiciel d'acquisition approprié pour la DAS de choix sur l'ordinateur personnel. Remarque: Assurez-vous que les pilotes d'acquisition numériques sont compatibles avec le système d'exploitation sur le PC.
- Configuration d'amplification de logiciel (10-100X), le filtrage du signal (typiquement un filtre de Bessel passe-bande réglable de 100 Hz à 3 000 Hz) et la fréquence d'échantillonnage (d'au moins 10 KHz). Remarque: les amplitudes de signaux de neurones gustatifs sont typiquement dans la gamme mV 0,5-2, si l'échelle d'affichage est réglé pour faciliter leur visualisation. Remarque: Le filtre de 100 Hz permet d'exclure le bruit électrique parasite, mais il modifie la forme de pointes et peut faire de pointe pic tri more contester. En variante, un filtre de 1 Hz peut être utilisé.
- Eventuellement, une cage de Faraday peut être mis en place tout autour de la table de vibration. Cependant, de petites feuilles de papier d'aluminium sont généralement suffisantes pour réduire le bruit généré par le milieu extérieur ou de l'investigateur.
- Choisissez une chambre pour la configuration de plate-forme qui est exempte de grosses variations de température ou d'humidité et aussi isolé des sources de bruit électrique et mécanique, tels que les réfrigérateurs et les centrifugeuses.
- Préparation de l'électrode de verre
Figure 2. Référence et d'enregistrement des électrodes. Photographie sous un grossissement de capillaires en verre tiré dans l'électrode de référence, avec (A) et sans (B) pointe cassé, et des électrodes d'enregistrement (C). Barre blanche représente 2 mm. Cliquez ici pour agrandir l'image.- Tirez la référencel'électrode à partir d'un capillaire en verre à l'aide d'un instrument de traction pipette. Remarque: Les paramètres exacts du programme pipette de traction varient d'un instrument à l'. Essayez d'atteindre un très long cône progressif. La taille des pores à la pointe n'est pas cruciale, car la pointe sera brisé avant la préparation de la mouche (Figures 2A et 2B), mais assurez-vous que le diamètre de la longueur conique de l'électrode n'est ni trop mince, ce qui ne permettra pas suffisante immobilisation de la labellum, ni trop grand, ce qui pourrait endommager les neurones gustatifs ou une rupture des glandes salivaires.
- Tirer électrode d'enregistrement à partir d'un capillaire en verre de borosilicate avec filament en utilisant une pipette instrument de traction. Essayer d'atteindre une conicité qui est moins profonde que celle de l'électrode de référence, et un diamètre de pores d'environ 10 à 15 um (figure 2C) 28.
- Solutions exhausteur de goût préparation
- Utilisez solution Ringer Beadle-Ephrussition (B & E) comme électrolyte de l'électrode de référence. Pour faire un litre de B & E, dissoudre 7,5 g de NaCl, 0,35 g de KCl, et 0,279 g de CaCl2 ∙ 2H 2 O dans un litre d'eau ultra-pure. Rangez les petites aliquotes à -20 ° C.
- Utiliser 30 mM de citrate de tricholine solution (TCC) comme électrolyte de l'électrode d'enregistrement et d'un solvant pour les solutions 25 exhausteur de goût, si les réponses amères ou sucre GRN doivent être mesurés. En variante, mM de solution de chlorure de potassium de 1 à 3 peut être utilisé si les réponses de la cellule de l'eau sont à mesurer.
- Pour rendre les solutions exhausteur de goût, peser quantité appropriée d'exhausteur de goût sous forme de poudre et ajouter à la CCI de faire une concentration de stock initial. Utilisez cette fonction pour faire des dilutions en série de ce stock initial pour obtenir la concentration souhaitée pour le test. Remarque: Si tastants ne se dissolvent pas facilement dans l'eau, un autre solvant tel que l'éthanol, peut être utilisé pour faire de concentration stock initial. Une solution de contrôle approprié de la CCT et de solvant sans exhausteur de goûtdoit être utilisé dans ce cas.
- aliquotes de magasins à long terme à -20 ° C. Stocker une partie aliquote d'une solution de travail d'exhausteur de goût à 4 ° C pour une utilisation pour l'enregistrement de plus d'une semaine, en fonction de propriétés chimiques du exhausteur de goût.
2. Préparation Drosophila
Figure 3. Préparation de la mouche pour l'enregistrement. (A) la position d'insertion de l'électrode de référence dans thorax dorsal de la mouche. La flèche blanche indique l'électrode de référence. (B) La position intermédiaire de l'électrode de référence: avancé à travers le cou et la tête, trompe pas encore sortis. (C, D) Volez avec électrode de référence en position finale avec la pointe d'électrode à l'intérieur labelle, et trompeentièrement déployée. Cliquez ici pour agrandir l'image.
- Recueillir les mouches nouvellement éclos pour l'enregistrement à partir de cultures de mouche bien entretenues, cultivées sous-et des conditions de température à humidité contrôlée, et les vieillir 5-10 jours dans des flacons de culture frais avant l'enregistrement.
- Réfrigérer plaque de microscope sur la glace pendant 15-30 min avant de préparer mouche.
- Remblai électrode de référence en verre avec B & E solution à l'aide d'une aiguille longue et fine en plastique de 0,5 mm de diamètre, comme une aiguille spinale et seringue de 1 ml et tapotez doucement les bulles. Cassez petite quantité de pointe hors aide d'une pince et d'utiliser l'action capillaire à tirer toutes les bulles restantes avec un tissu, en observant sous un microscope à dissection.
- Glisser B & E-rempli électrode de référence sur le fil de support d'électrode de référence, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air.
- Aspirer voler dans une pointe de pipette P200, en utilisant la mouche aspirateur intégréà partir de tubes, maille, et la pointe de la pipette, 29 place dans un seau à glace et réfrigérer pendant 30-60 sec.
- Retirer la plaque de microscope de la glace, essuyez l'humidité, et la position sous microscope. Tapoter doucement décoller de pointe de la pipette sur la plaque de microscope.
Remarque: la mouche doit être immobilisé suffisamment pour manipuler facilement. - À faible grossissement, retirez délicatement les pattes de devant avec une paire de pinces, tout en maintenant la stabilité du thorax avec l'autre paire de pinces. Placez la mouche sur sa face ventrale, la face dorsale vers le haut. Remarque: Toujours faire attention à ne pas toucher le labelle avec la pince à tout moment pendant le processus de préparation afin de minimiser les dommages mécaniques.
- Tout en maintenant la volée en place avec une paire de pinces, insérer l'électrode de référence sur la ligne médiane de la partie postérieure dorsale du thorax. Un angle suggéré d'entrée est d'environ quarante cinq degrés, dans la direction de la tête (figure 3A).
- Fixez le electrod de référenceporte-e avec la pâte à modeler de telle sorte que la mouche est visible sous le microscope à fort grossissement. Manoeuvrer et de l'angle de l'électrode de verre à travers le col et la tête, en faisant coulisser la volée vers le porte-électrode de référence au moyen de deux paires de pinces. Remarque: Travaillez rapidement mais en douceur, il est plus facile de réaliser cette étape alors que la mouche est toujours immobilisé contre le froid (figure 3B).
- Étendre délicatement la trompe avec une paire de pinces, tout en faisant glisser la volée plus bas de l'électrode de référence de verre, jusqu'à ce que la pointe de l'électrode est à l'intérieur du labelle et la trompe est entièrement déployée (figures 3C et 3D). Note: Prenez soin de ne pas percer une partie du tissu trompe ou distendre le bord du labelle avec l'électrode de référence, car cela pourrait endommager la volée et / ou un goût neurones et affecter la qualité d'enregistrement.
3. Enregistrement à partir Labellar Sensilles
Figure 4. Enregistrement à partir volée. (A) labelle de préparation à la mouche sur la gauche avec l'électrode d'enregistrement aligné pour le contact sur la droite, à fort grossissement. (B) électrode d'enregistrement et sensille unique sur labelle en contact, à fort grossissement. Cliquez ici pour agrandir l'image.
- Toujours à la terre en touchant une surface métallique de la table anti-vibration ou plate-forme avant de toucher l'équipement pendant le processus d'enregistrement! Remarque: Il est extrêmement important de ne pas livrer une charge statique à l'headstage car cela peut endommager les circuits.
- Sécurisé électrode de référence détenteur de micromanipulateur monté sur la table de l'air de recording plate-forme. Position un lobe de labelle dans le champ de vision du microscope, à fort grossissement (typiquement au moins 140X), et en ligne avec le courant d'air humidifié.
- Mettez flux d'air humidifié, ordinateur, DAS, et l'amplificateur. Logiciel d'acquisition ouvert.
- Rincer et remplir le verre électrode d'enregistrement avec exhausteur de goût désiré.
- Rincer verre électrode d'enregistrement avec de l'eau ultrapure à l'aide d'une seringue et un tube en plastique 28 pour tirer de petites quantités d'eau à travers le tube au moins dix fois.
- Rincer électrode d'enregistrement avec exhausteur de goût, au moins cinq fois. Remplir l'électrode d'enregistrement d'environ un tiers à la moitié pleine avec exhausteur de goût et retirer du tube. S'il ya des bulles d'air, appuyez sur pour libérer ou simplement remplir l'électrode.
- Faites glisser électrode sur fil d'argent de la headstage rapidement et en douceur afin de ne pas introduire de bulles d'air.
- Stimuler unique sensille avec électrode d'enregistrement exhausteur de goût remplie.
- Utilisez le micromanipulateur pour amener l'électrode d'enregistrement aligné avec sensille d'intérêt.
- Appuyer sur une pédale pour déclencher le mode de l'amplificateur d'acquisition.
- Avancer l'électrode d'enregistrement avec le bouton de réglage fin de micromanipulateur soigneusement jusqu'à ce qu'il entre en contact avec la pointe de sensille et l'enregistrement commence.
- Retirer l'électrode après 1-2 sec.
- Répétez l'étape 3.5 avec d'autres sensilles, si désiré. Remarque: Attendez au moins 1 minute entre les présentations à la même sensille. Si l'enregistrement avec un exhausteur de goût unique pendant une période de temps prolongée, la solution d'exhausteur de goût peut sécher la solution et à la pointe peut devenir plus concentré. Cela peut être résolu en mettant en contact en douceur de la pointe de l'électrode de verre avec du papier lisse pour éliminer une petite quantité de liquide par capillarité.
- Pour enregistrer les réponses à un autre exhausteur de goût, rincer et l'électrode d'enregistrement de la charge avec une nouvelle exhausteur de goût et répétez l'étape 3.4. Remarque: Bien rincer l'électrode entre tastants est absolutely cruciale pour éviter la contamination croisée.
- Enregistrer les fichiers de données périodiquement des informations d'identification, telles que la date, le génotype, et sapides. Remarque: Il est important de garder une trace écrite de l'exhausteur de goût et de l'identité de chaque sensille présentation pendant la session d'enregistrement pour l'analyse des données.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 5A montre la réponse d'un L sensille à un sucre, le saccharose. Le même sensille ne répond pas à un composé amer, la berbérine. Figure 5B montre que l'sensille de type I, qui contient un neurone sensible amer, affiche de plus grands pics d'amplitude en réponse à la berbérine, et de plus petites pointes d'amplitude en réponse au saccharose. L sensilles afficher une réponse de fond minimale pour le contrôle solvant, TCC, alors que je sensilles afficher pratiquement aucune réponse de la STC (figure 5). Pour plus d'informations sur les réponses de sel et d'eau de GRNS labellar, s'il vous plaît se référer à Hiroi 10.
Figure 5. Des traces représentatifs de type sauvage réponses Drosophila labellar (A) L sensillu m réponse à 100 mM de saccharose (CUS), mM berbérine 1 (BER), et la STC 30 mM. (B) Je sensillaire réponse à SUC, BER, et la STC. La flèche indique l'artefact de contact qui se produit au début de chaque enregistrement. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 6. Représentatifs des résultats électrophysiologiques sous-optimaux. (A) de l'absence totale de signal (B) 50/60 Hz "bruit" (C) de bruit stochastique (D) des neurones mécano tir seul (e) GRN amer (triangles ouverts) et le neurone mécano ( triangles) rempli deux tirs./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sensilla Labellar varient dans la facilité d'enregistrement en raison de différences de morphologie et de l'organisation anatomique. Parfois, un sensille ne répond pas à toutes les substances sapides, même celui qui est connu pour déclencher une réponse positive. La fréquence à laquelle cela se produit varie en fonction du type sensille. L sensilles sont les plus constamment réceptifs et sont relativement faciles d'accès en raison de leur longueur. En général, S sensilles sont toujours sensibles, mais leur courte longueur et la position sur le labelle faire un bon contact difficile. Je sensilles peut être accessible, plus facilement, en fonction de l'angle de la préparation, mais ils sont plus souvent ne répond pas. Sur toute la préparation à la mouche donnée, une plus grande proportion de I sensilles peut être insensible à L ou S sensilles. Fond génétique peut affecter la cohérence des réponses gustatives ainsi. Par exemple, certaines mouches transgéniques peuvent afficher des réponses moins cohérentes que de type sauvage, sans doute parce que les transgènes affectent la gesanté néral de la mouche. Nous avons observé que w - mouches mutantes sont particulièrement difficiles à enregistrer.
Un problème technique commune est une perte de signal, c'est à dire pas de pointes sont observées (figure 6A). Tout d'abord, parfois un sensille particulier peut ne pas répondre, tandis que d'autres de la même classe sur le même vol peuvent répondre. En second lieu, il peut y avoir une bulle d'air dans l'électrode d'enregistrement ou de l'électrode de référence. Si l'électrode d'enregistrement est soupçonné, cela peut être résolu simplement en enlevant et le remplissage de l'électrode de verre, tapotant doucement et inspecter à la loupe afin de s'assurer qu'aucun des bulles sont présentes. Si l'électrode de référence est soupçonné de contenir une bulle d'air, refaire la préparation avec une nouvelle volée est la meilleure façon de résoudre ce problème. Troisièmement, parfois les fils transportant le signal électrique ne peuvent pas être raccordés. En quatrième lieu, de temps en temps le signal de tension en cours de réception peut être soit supérieure ou inférieure àla gamme de l'amplificateur peut mesurer. Si vous utilisez l'amplificateur tastePROBE, vérifier pour voir si le clip soit vers le haut ou vers le bas couper voyant est allumé. Si le voyant glisser jusqu'à est souvent retirer et remplir l'électrode de référence de verre, tout en prenant soin de remplir pas plus de la moitié et essuyer l'extérieur pour enlever l'humidité va résoudre le problème. L'humidité à l'extérieur de l'électrode de verre peut établir une liaison électrique entre le boîtier métallique de l'électrode et le fil, l'envoi du signal hors de la plage de l'amplificateur. Si cela échoue à résoudre le problème, ou le témoin de clip rebours est en marche, examiner les propositions dans le paragraphe suivant à la lutte contre le bruit électrique dans le système. Cinquièmement, parfois une mouche peut mourir pendant la préparation ou est ne répond plus, malgré une apparence saine de la préparation. Les conditions de croissance, tels que l'humidité, la température, l'âge, la qualité des aliments, et microbiote, ainsi que d'un fond génétique en moins bonne santé pourraient contribuer à une meilleureproportion de mouches "ne répondent pas". Enfin, plus rarement, une pièce d'équipement peut être non fonctionnel. Si le signal est toujours pas atteint et toutes les autres possibilités ont été épuisées, il peut être nécessaire d'étudier la fonctionnalité de chaque pièce d'équipement: headstage, un amplificateur et convertisseur analogique-numérique. La meilleure façon de le faire est de remplacer une pièce d'équipement avec un autre à partir d'une plate-forme qui est connu pour être fonctionnel. Si une seule plate-forme est présente dans un laboratoire, un générateur de signal peut être utilisé pour tester le fonctionnement des composants électroniques.
Un autre problème technique commune est celle de «bruit», qui est un signal observé ne semble pas représenter des potentiels d'action neuronaux tirés en réponse à un stimulus gustatif (figures 6B-E). Tout d'abord, le signal peut résulter de 50/60 Hz bruit électrique de l'équipement d'enregistrement ou d'autres équipements à proximité (figure 6B). En l'absence de mouche sur l'électrode de référence, directement relier les enregistrement et l'électrode de référence à travers une goutte de la solution de Ringer et entrer dans le mode passthrough sur l'amplificateur en appuyant sur la touche haut. Si le bruit est observable sur le signal émulation, cela signifie probablement que le bruit est externe à la préparation de mouche. Assurez-vous que tous les équipements de forage est correctement mise à la terre et que les boucliers de feuille d'étain sont en place. Essayez de débrancher l'équipement à proximité pour voir si le bruit est éliminé, ou protéger des composants supplémentaires. Deuxièmement, le bruit peut apparaître stochastique (figure 6C). Dans ce cas, les étapes détaillées pour 50/60 Hz bruit doivent encore être entrepris. De plus, essayez de débrancher ou de remplacer les différents composants de l'équipement d'enregistrement, en particulier la headstage et / ou de l'amplificateur. Si aucun bruit n'est observée lorsque les électrodes sont reliées directement, la source est probablement la préparation elle-même à la mouche. Il est généralement plus simple de préparer une nouvelle volée pour l'enregistrement, en prenant soin de minimiser les dommages à la volée. En troisième lieu, l'activationdu neurone mécanosensorielle contenu dans le sensillum (figures 6D et 6E) peuvent être observés. Le neurone mécanosensorielle peut être activée si la sensille est déviée ou plié à la demande de l'électrode d'enregistrement, ou des chocs pendant le contact. Les pointes se distinguent généralement par des pics chimiosensoriels par leur motif irrégulier, qui apparaît généralement en coordination avec la rupture mécanique, pas l'application d'un stimulus gustatif. Tir mécanosensorielle peut être minimisée par l'alignement de l'électrode d'enregistrement avec le sensille et avancer doucement que dans la mesure nécessaire pour prendre contact avec la pointe de l'sensille. Quatrièmement, pic stochastique "éclatement" peut être observé, ce qui semble similaire à la décharge neuronale, mais est de haute fréquence et d'amplitude, pas coordonnée en réponse à un stimulus. Il en résulte généralement de la mouche préparation elle-même, pas de l'équipement, et peut être due à un nerf perturbé par l'électrode de référence. </ P>
Une troisième question technique commune est que la préparation est mobile, ce qui provoque le labelle de se déplacer, ce qui rend difficile le cadre d'une sensille. Tout d'abord, la préparation de la mouche peut être instable. Vérifier que l'électrode de référence est correctement positionné, et réajuster si nécessaire. Deuxièmement, l'électrode de référence peut être trop mince à la pointe de tenir la trompe et labelle immobile. Essayez rompre un montant plus de la pointe avant de préparer la volée. Si cela n'est pas suffisant, réajuster les paramètres de traction de pipettes selon les besoins pour modifier la forme de l'électrode de référence de telle sorte que le cône est plus progressive et dont le diamètre est légèrement augmentée. Troisièmement, la mouche peut être exceptionnellement actif. Refaire la préparation d'une nouvelle volée.
Pour plus d'informations d'électrophysiologie général et davantage de conseils de dépannage, reportez-vous au Guide Axon 30.
Il ya quelques limitations à la méthode pointe d'enregistrement énoncées dans la présente publication. Une limitation est que l'exhausteur de goût doit être soluble dans l'eau, tel qu'il est livré à l'électrode d'enregistrement en même temps que l'électrolyte. Ceci augmente la difficulté de l'enregistrement avec des composés hydrocarbonés, bien que l'utilisation d'un solvant tel que le DMSO a réalisé certains enregistrement possibles avec les phéromones 4. D'autres approches consistent à utiliser une électrode de tungstène aiguisées pour effectuer les enregistrements de la base de douille de la sensille, ou d'utiliser une électrode en verre pour effectuer des enregistrements à partir de la paroi latérale de la sensille, à la fois, dont l'exhausteur de goût est délivré indépendamment de l'électrode d'enregistrement 26,27. Cependant, ces techniques sont difficiles et les enregistrements de parois latérales sont plus préjudiciable à l'organe du goût. Une autre limite est la quantité de temps nécessaire pour échanger la solution exhausteur de goût (protocole de l'étape 3.3), ce qui réduit le débit, et limite l'utilisation des paradigmes de relance complexes souvent vu dans les enregistrements olfactifs. Neurones récepteurs gustatifs présentent une certaine variabilitéen amplitude qui dépend de la fréquence de pic. Cette fonction peut compliquer l'évaluation de l'identité neuronale et faire pointe avancée de tri plus difficile 25,31-33. En outre, en raison de la nature de la méthode d'enregistrement pointe on ne peut pas enregistrer le tir de base immédiatement avant la livraison d'un stimulus, comme cela se fait couramment dans les enregistrements olfactifs. Malgré ces inconvénients, la méthode pointe-enregistrement a été utilisé avec succès pour élucider bon nombre des principes de codage de goût chez la drosophile et d'autres espèces 8,10,17,19,21-23.
La technique de préparation à la mouche décrit ici est juste une approche possible. Dans ce procédé de préparation de la buse est fixée dans une position étendue pour faciliter le contact de l'électrode d'enregistrement avec la sensille d'intérêt, et l'électrode de référence est inséré dans l'animal. D'autres procédés de préparation comprennent le montage de l'animal à une boule de pâte à modeler et l'utilisation des bandes minces debande de fixer la trompe 34. En effet, tant que les paramètres de base de la stabilisation de tissu et le placement de l'électrode de référence sont respectées, sensilla dans d'autres endroits ou d'espèces différentes peuvent être enregistrées à partir de la même façon. Par exemple, la jambe sensilla peut être enregistré à partir de la fixation du corps d'une mouche à une lame de microscope de Sylgard revêtu de fines broches d'insectes, évasement des jambes sur le bord du verre légèrement 35. Il est possible d'administrer des agents pharmacologiques pour le sensilla via l'électrode d'enregistrement pour étudier la transduction du signal dans les neurones récepteurs gustatifs. Il est tout simplement une tâche d'expérimentation afin de déterminer l'approche qui fonctionne le mieux pour le résultat souhaité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de 1F31DC012985 prédoctorale NRSA (à RD) et par des subventions du NIH à JC
Nous tenons à remercier le Dr Weiss Linnea des commentaires utiles sur le manuscrit, le Dr Ryan Joseph pour aider les compiler les chiffres, et le Dr Frédéric Marion-Poll pour des conseils techniques utiles. Nous tenons également à remercier les précieux commentaires de quatre auteurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
