Summary
يصف هذا البروتوكول تسجيل خارج الخلية من العمل الاستجابات المحتملة التي أطلقتها الخلايا العصبية الذوق labellar في ذبابة الفاكهة.
Abstract
استجابة طعم الطرفية من الحشرات يمكن التحقيق بقوة مع تقنيات الكهربية. الطريقة الموضحة هنا يسمح الباحث لقياس الاستجابات الذوقية مباشرة وكميا، مما يعكس المدخلات الحسية أن الجهاز العصبي للحشرات تتلقاها من المحفزات طعم في بيئته. يحدد هذا البروتوكول جميع الخطوات الرئيسية في أداء هذه التقنية. الخطوات الحاسمة في تجميع وتلاعب الكهربية، مثل اختيار المعدات اللازمة وبيئة مناسبة للتسجيل، ويتم رسم. نحن تصف أيضا كيفية الاستعداد لتسجيل بجعل المرجعية وتسجيل الأقطاب المناسبة، والحلول منبهة للذوق. نحن تصف بالتفصيل الطريقة المستخدمة لإعداد الحشرات عن طريق ادراج الإلكترود المرجعي الزجاج في ذبابة من أجل شل خرطوم. نظهر آثار النبضات الكهربائية التي أطلقها الخلايا العصبية الذوق ردا على السكر ومجمع المر. جوانب البروتوكول هي رechnically صعبة ونحن وتشمل وصفا واسعة من بعض التحديات التقنية المشتركة التي يمكن مواجهتها، مثل عدم وجود إشارة أو الضوضاء المفرطة في النظام، والحلول المحتملة. تقنية له حدود، مثل عدم القدرة على تقديم المحفزات المعقدة زمنيا، ومراقبة خلفية إطلاق النار مباشرة قبل التحفيز التسليم، أو استخدام مركبات غير قابلة للذوبان في الماء طعم مريح. على الرغم من هذه القيود، هذه التقنية (بما في ذلك الاختلافات الطفيفة المشار إليها في البروتوكول) هو المعيار، والإجراءات المقبولة على نطاق واسع لتسجيل الاستجابات العصبية ذبابة الفاكهة لتذوق المركبات.
Introduction
حاسة التذوق يسمح حشرة للكشف عن مجموعة واسعة من المواد الكيميائية القابلة للذوبان، ويلعب دورا هاما في قبول مادة مغذية، أو رفض واحد الضارة أو السامة. ويعتقد الذوق أيضا للعب دور في اختيار الشريك، من خلال الكشف عن الفيرومونات 1-5. جعلت هذه الوظائف الهامة والمتنوعة النظام طعم الحشرات هدفا مقنعة للتحقيق في كيفية النظم الحسية ترجمة الاشارات البيئية في المخرجات السلوكية ذات الصلة.
الوحدة الأساسية للنظام طعم البطن ذبابة الفاكهة هو الشعر والذوق، أو sensillum و. جزيئات دخول sensillum وعبر المسام في 2،6 طرفها. تم العثور على الشعيرات labellum، والساقين، وهامش الجناح، والبلعوم 6. على labellum، والنمطية عدد وموقع الشعيرات. هناك ثلاث فئات من الشعيرات المورفولوجية بناء على طول: طويل (L) والمتوسطة (I)، وقصيرة (S ) الشعيرات 7،8. يحتوي كل sensillum وإما اثنين (I-نوع) أو أربعة (L-S-نوع و) الخلايا العصبية مستقبلات الذوقية (GRNs) 9. GRNs مختلفة الرد على فئات مختلفة من المحفزات طعم: المر والسكر والملح والأسمولية 7،10 والتعبير عن مجموعات فرعية مختلفة من المستقبلات الذوقية 8،11-13. فقط أنا وS-نوع الشعيرات تحتوي GRNs المر استجابة 8،10. يتم ترحيل المشروع GRNs إلى العقدة تحت المريء (مجموعة العمليات الخاصة) والتنشيط من خلال جزيئات الذوق إلى الجهاز العصبي المركزي العالي لفك التشفير، مما أدى إلى استجابة سلوكية 6. عدد قليل نسبيا من الخلايا العصبية وقابليته للتحليل الجزيئي والسلوكية جعل النظام طعم ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا للتحقيق في أنظمة الذوقية بشكل عام. السهولة النسبية التي يمكن التلاعب بها النظام عبر طفرة جينية أو نظام التعبير GAL4-UAS أيضا بمثابة أداة قيمة 14،15.
ontent "> لأن هذه الشعيرات تبرز من سطح labellum، لأنها تجعل أهداف ممتازة للالكهربية. اطلاق النار من GRNs يمكن رصدها باستخدام تسجيل خارج الخلية. تاريخيا، وطريقة تسجيل جنبا إلى الجدار، والذي يستخدم الزجاج الكهربائي إدراجها في sensillum وتسجيل نشاط الخلايا العصبية، وقد استخدم 26، ولكن هذا الأسلوب يمثل تحديا تقنيا على القيام بها، وأنه من الصعب أن يسجل لفترة طويلة من كل إعداد. طريقة غيض تسجيل، والذي يقيس استجابة الخلايا العصبية مع القطب أن في وقت واحد يسلم منبهة للذوق، وأصبح منذ الأسلوب المفضل 9،16. وقد استخدمت وللتحقيق في نظام طعم ذبابة الفاكهة السوداء البطن 8،10،17،18 فضلا عن عدد من أنواع الحشرات الأخرى 19-23. له تم سهلت كثيرا من خلال تطوير مكبر للصوت tastePROBE، التي تغلبت احدة من العوائق الرئيسية لطريقة التسجيل عن طريق بلاغ للتعويضفرق الجهد الكبير بين الإلكترود المرجعي وsensillum والحشرات، مما يتيح للإمكانات العمل GRN ليتم تسجيلها دون التضخيم المفرط أو التصفية 24. وثمة تطور مهم آخر استخدام tricholine سترات كما بالكهرباء يسجل 25. TCC يقمع الاستجابات من GRN الحساسة للالأسمولية ولا تحفيز GRN الحساسة الملح، مما يجعل الاستجابات التي تم إنشاؤها بواسطة tastants المر والسكر أسهل بكثير لتحليل 25.نحن هنا تصف كيف يتم تنفيذ تسجيل غيض من ذبابة الفاكهة labellar الشعيرات حاليا في المختبر كارلسون. وهذا البروتوكول شرح كيفية تأسيس منصة مناسبة الكهربية، وكيفية إعداد الطاير، وكيفية تنفيذ تسجيلات الذوق. كما نقدم بعض البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تسجيل ممثل من مجموعات فرعية من ذبابة الفاكهة الشعيرات، وكذلك بعض القضايا المشتركة والحلول المحتملة التي يمكن مواجهتها عند استخدام هذاالتقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول التالية يتوافق مع جميع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة ييل.
1. الكواشف وإعداد معدات
- تسجيل الإعداد المعدات (الشكل 1A).
- اختيار غرفة للتلاعب الإعداد التي هي خالية من اختلافات كبيرة في درجة الحرارة أو الرطوبة وعزل أيضا من مصادر الضوضاء الكهربائية والميكانيكية، مثل الثلاجات وأجهزة الطرد المركزي.
الشكل 1. (A) نظرة عامة حول الإعداد تسجيل تلاعب. هي التي شنت Stereomicroscope (أ) على منصة مضادة للاهتزاز (ب) هي التي شنت. مرجع القطب حامل (ج) على منصة المقابلة لheadstage (د)، عبر micromanipulators. أنبوب من البلاستيك منفذ (ه) تقديم تيار الهواء مرطب الموجهة إلى إعداد ذبابة هي التي شنت أيضا على رانه المنصة. يتم توصيل headstage إلى مكبر للصوت (و)، والتي يتم توصيلها إلى النظام الرقمي اقتناء (DAS) (ز)، والتي يتم توصيلها إلى جهاز كمبيوتر (ح). (ب) تكوين من الأقطاب الكهربائية والأنابيب منفذ: المرجعية القطب على اليسار، وتسجيل القطب على الحق، ومخرج تيار الهواء أنبوب الموجهة إلى إعداد ذبابة اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. - جبل stereomicroscope إلى وسط الجدول مضادة للاهتزاز أو منصة.
- نعلق micromanipulators لإعداد الإلكترود المرجعي / الحشرات وheadstage / تسجيل القطب إلى اليسار واليمين من المجهر، على التوالي، وذلك باستخدام المدرجات المغناطيسي.
- جبل مخرج أنبوب من البلاستيك في مياداة مجهرية الثالث إلى الجزء الخلفي من المجهر، موجهة بحيث افتتاح أنبوب وأشار نحو موقع ذبابة الإعدادية (انظر الشكل 1B).
- باستخدام أنابيب بلاستيكية مرنة، فيمنفذ تاش أنبوب بلاستيكي إلى قارورة فراغ مملوء جزئيا بالماء. توصيل مضخة ماء صغيرة للهواء فقاعة من خلال الماء في قارورة، وتوليد تيار الهواء مرطب من خلال أنبوب بلاستيكي منفذ نحو الطاير.
- الألياف البصرية جبل مصدر الضوء من على الطاولة الاهتزاز، وتوجيه المخرجات لإلقاء الضوء على التحضير من خلال عكس الضوء عبر ورقة بطاقة بيضاء مباشرة تحت الإعداد. تأكد من أن مصدر الضوء لا يستريح على الطاولة. ملاحظة: صالح تعكس مصدر الضوء على قرص الورق ذو شقين: أنه يحسن التباين، مما يجعل من الأسهل الشعيرات لتصور، وأنه يمنع من إعداد التدفئة التي ستنجم عن الضوء المباشر.
- المكونات مكبر للصوت tastePROBE في نظام اقتناء الرقمية (DAS)، وداس في أجهزة الكمبيوتر الشخصية، وفقا لدليل المورد. سد العجز في دواسة القدم الزناد وترتيب في إطار مساحة العمل. ملاحظة: مآخذ الجدار معزولة كهربائيا لمكبر للصوت وDAS هي غاية ديزيريهقادرة.
- الأرض كهربائيا المجهر، micromanipulators، ومصدر الضوء من خلال ربط المكونات المعدنية لجدول باستخدام مقاطع التمساح وأطوال الأسلاك الكهربائية المعزولة والشريط الكهربائي. الأرض كهربائيا منصة المعدنية من خلال ربط لبناء الأرض أو DAS، الذي يرتكز من خلال المكونات امدادات الطاقة.
- تثبيت البرامج المناسبة لاكتساب DAS الاختيار على أجهزة الكمبيوتر الشخصية. ملاحظة: تأكد من أن السائقين اقتناء الرقمية متوافقة مع نظام التشغيل على جهاز الكمبيوتر.
- تكوين التضخيم البرمجيات (10-100X)، إشارة تصفية (عادة ممر الموجة مرشح بسل مجموعة من 100 هرتز، 3، 000 هرتز)، وأخذ العينات معدل (لا يقل عن 10 كيلو هيرتز). ملاحظة: سعة الإشارة من الخلايا العصبية الذوقية وعادة ما تكون في نطاق 0.5-2 بالسيارات، بحيث يتم تعيين نطاق العرض لتسهيل التصور بهم. ملاحظة: مرشح 100 هرتز يساعد على استبعاد الضجيج الكهربائي غريبة، ومع ذلك، فإنه يغير شكل طفرات ويمكن أن تجعل متقدمة ارتفاع الفرز موره التحدي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام فلتر 1 هرتز.
- اختياريا، يمكن تعيين قفص فاراداي حتى حول طاولة الاهتزاز كله. ومع ذلك، وصحائف صغيرة من رقائق الألومنيوم وعادة ما تكون كافية للحد من أي الضوضاء الناتجة عن البيئة الخارجية أو المحقق.
- اختيار غرفة للتلاعب الإعداد التي هي خالية من اختلافات كبيرة في درجة الحرارة أو الرطوبة وعزل أيضا من مصادر الضوضاء الكهربائية والميكانيكية، مثل الثلاجات وأجهزة الطرد المركزي.
- الزجاج إعداد الكهربائي
الشكل 2. مرجع وتسجيل الأقطاب. تصوير تحت التكبير من الشعيرات الدموية الزجاج سحبت في القطب المرجعية، مع (A) وبدون (B) طرف مكسورة، وتسجيل الكهربائي (C). يمثل شريط أبيض 2 مم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.- سحب المرجعالقطب من الزجاج الشعرية باستخدام أداة ماصة ساحبة. ملاحظة: إن الضبط الدقيق للبرنامج ماصة ساحبة تختلف من أداة لالصك. محاولة لتحقيق تفتق تدريجي طويل جدا. حجم المسام في الطرف ليس حاسما لأنه سيتم كسر غيض قبل إعداد ذبابة (أرقام 2A و 2B)، ولكن تأكد من أن قطر طول مدبب من القطب ليست رقيقة جدا، والتي لن تسمح كافية الشلل في labellum، ولا كبيرة جدا، الأمر الذي قد يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية الذوقية أو تمزق الغدد اللعابية.
- سحب تسجيل القطب الكهربائي من الزجاج الشعرية البورسليكات مع خيوط باستخدام أداة ماصة ساحبة. محاولة لتحقيق تفتق التي هي أقل عمقا من ذلك من الإلكترود المرجعي، وقطر المسام من حوالي 10-15 ميكرومتر (الشكل 2C) 28.
- إعداد الحلول منبهة للذوق
- استخدام بيدل-Ephrussi قارع الأجراس المحاليلنشوئها (B & E) كما بالكهرباء الإلكترود المرجعي. لجعل لتر واحد من B & E، حل 7.5 غرام كلوريد الصوديوم، 0.35 ز بوكل، و0.279 غرام و CaCl 2 ∙ 2H 2 O في لتر واحد من الماء عالى النقاء. تخزين مأخوذة أصغر في -20 درجة مئوية.
- استخدام 30 ملي حل سيترات tricholine (TCC) كما بالكهرباء القطب تسجيل ومذيب للحلول منبهة للذوق 25، إذا الردود GRN مريرة أو السكر يتم قياس. بدلا من ذلك، 1-3 ملي محلول كلوريد البوتاسيوم يمكن استخدامها إذا استجابات الخلية المياه المراد قياسها.
- لجعل الحلول منبهة للذوق، تزن كمية مناسبة من منبهة للذوق في شكل مسحوق وإضافة إلى TCC لجعل تركيز الأسهم الأولية. استخدام هذا لجعل التخفيفات المسلسل من هذا المخزون الأولي لتسفر عن التركيز المطلوب للاختبار. ملاحظة: إذا tastants لا تذوب بسهولة في الماء، والمذيبات آخر، مثل الإيثانول، ويمكن استخدامها لجعل تركيز الأسهم الأولية. حلا المراقبة المناسبة للTCC والمذيبات دون منبهة للذوقوينبغي أن تستخدم في هذه الحالة.
- متجر مأخوذة المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تخزين واحد قسامة عمل حلا منبهة للذوق عند 4 درجة مئوية لتسجيل استخدام لمدة تصل إلى أسبوع، اعتمادا على الخصائص الكيميائية للمنبهة للذوق.
2. إعداد ذبابة الفاكهة
الرقم 3. إعداد يطير للتسجيل. (A) موقف الإدراج من الإلكترود المرجعي في ظهري الصدر من الطاير. السهم الأبيض يشير إلى الإلكترود المرجعي. (B) موقفا وسطا من الإلكترود المرجعي: تقدمت من خلال الرقبة والرأس، لا خرطوم تمديد حتى الآن. (C، D) سافر مع الإلكترود المرجعي في الموقف النهائي مع غيض من القطب داخل labellum، وخرطوممددت تماما. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
- جمع الذباب eclosed حديثا للتسجيل من الثقافات ذبابة جيدا المحافظة، ونمت تحت ظروف درجة الحرارة والرطوبة التي تسيطر عليها، ولهم في العمر 5-10 أيام في قارورة ثقافة جديدة قبل التسجيل.
- البرد المجهر لوحة على الجليد لمدة 15-30 دقيقة قبل إعداد الطاير.
- الردم الزجاج الكهربائي مع الإشارة B & E الحل باستخدام طويلة وإبر بلاستيكية رقيقة من 0.5 مم، مثل إبرة في العمود الفقري و1 مل حقنة وبلطف اضغط على أي فقاعات. كسر كمية صغيرة من غيض قبالة باستخدام ملقط واستخدام العمل الشعري لاستخلاص جميع الفقاعات المتبقية بمنديل، ومراقبة تحت مجهر تشريح.
- الشريحة B & E مليئة الإلكترود المرجعي على سلك حامل الإلكترود المرجعي، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء.
- نضح تطير في تلميح ماصة P200، وذلك باستخدام الشافطة ذبابة بنيمن الأنابيب، وعيون، وماصة؛ 29 مكان في دلو الثلج والبرد لمدة 30-60 ثانية.
- إزالة لوحة المجهر من الجليد، وتمحو أي الرطوبة، وموقف تحت المجهر. اضغط بلطف تطير من غيض ماصة على لوحة المجهر.
ملاحظة: الطاير يجب أن يجمد بما فيه الكفاية للتلاعب بسهولة. - في ظل انخفاض التكبير، وإزالة بلطف اليدين مع زوج واحد من الملقط، في حين الضغط على الصدر مستقرة مع زوج آخر من الملقط. ضع ذبابة على جانبها بطني، الجانب الظهري مواجهة. ملاحظة: كن حذرا لتجنب لمس labellum مع ملقط في جميع الأوقات أثناء عملية التحضير لتقليل الأضرار الميكانيكية.
- في حين عقد الطاير في مكان مع زوج واحد من ملقط، إدراج الإلكترود المرجعي في خط الوسط من الصدر الخلفي الظهرية. واقترح زاوية من دخول ما يقرب من خمسة وأربعين درجة، في اتجاه الرأس (الشكل 3A).
- تأمين electrod المرجعية حامل الإلكترونية مع الصلصال بحيث الطاير مرئيا تحت المجهر في التكبير عالية. المناورة وزاوية الزجاج الكهربائي من خلال الرقبة والرأس، عن طريق تحريك الطاير نحو حامل الإلكترود المرجعي باستخدام اثنين من أزواج من ملقط. ملاحظة: العمل بسرعة ولكن بشكل سلس، بل هو أسهل لإكمال هذه الخطوة في حين أن ذبابة لا يزال يجمد من البرد (الشكل 3B).
- تمديد بلطف خرطوم مع زوج واحد من الملقط، في حين ينزلق الطاير مزيد من أسفل الإلكترود المرجعي الزجاج، حتى غيض من القطب هو داخل labellum وخرطوم يتم توسيع بالكامل (أرقام 3C و 3D). ملاحظة: الحرص على عدم ثقب أي جزء من النسيج خرطوم أو يتمدد على حافة labellum مع الإلكترود المرجعي، لأن هذا قد يؤدي إلى تلف الطاير و / أو طعم الخلايا العصبية وتؤثر على جودة التسجيل.
3. تسجيل من Labellar الشعيرات
gether.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 4. التسجيل من ذبابة. (A) labellum إعداد ذبابة على اليسار مع القطب تسجيل الانحياز للاتصال على الحق، في ظل تضخم عالية. (ب) القطب تسجيل sensillum واحد وعلى labellum في الاتصال، تحت التكبير عالية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
- الأرض نفسك دائما عن طريق لمس سطح معدني من الجدول مضادة للاهتزاز أو منصة قبل لمس أي معدات أثناء عملية تسجيل! ملاحظة: من المهم للغاية عدم تسليم تهمة ثابتة إلى headstage كما يمكن أن يؤدي إلى تلف الدوائر.
- آمنة حامل القطب إشارة إلى مياداة مجهرية التي شنت على طاولة الهواء من recordinز تلاعب. الفص موقف واحد من labellum في مجال المجهر للعرض، تحت التكبير عالية (عادة 140X على الأقل)، وتمشيا مع تيار الهواء مرطب.
- بدوره على تيار ترطيب الهواء، والكمبيوتر، DAS، ومكبر للصوت. البرمجيات مفتوحة الاستحواذ.
- شطف الزجاج وملء القطب تسجيل مع منبهة للذوق المطلوب.
- شطف الزجاج تسجيل الكهربائي مع الماء عالى النقاء باستخدام حقنة وأنابيب بلاستيكية 28 لسحب كميات صغيرة من المياه من خلال أنبوب عشر مرات على الأقل.
- شطف القطب تسجيل مع منبهة للذوق خمس مرات على الأقل. ملء القطب تسجيل ما يقرب من ثلث إلى نصف الطريق الكامل مع منبهة للذوق وإزالتها من الأنبوب. إذا كان هناك فقاعات الهواء، اضغط على إطلاق سراح أو ببساطة إعادة ملء القطب.
- الشريحة الكهربائي على أسلاك الفضة من headstage بسرعة وسلاسة حتى لا أعرض فقاعات الهواء.
- تحفيز sensillum واحد مع مملوءة منبهة للذوق القطب تسجيل.
- استخدام micromanipulator لجلب القطب تسجيل sensillum وتتماشى مع المصالح.
- اضغط دواسة القدم لتحريك الوضع الاستحواذ على مكبر للصوت.
- تقدم القطب تسجيل مع مفتاح التحكم غرامة مياداة مجهرية بعناية حتى يجعل الاتصال مع غيض من sensillum وتسجيل وتبدأ.
- إزالة القطب بعد 1-2 ثانية.
- كرر الخطوة 3.5 مع الشعيرات الأخرى، إذا رغبت في ذلك. ملاحظة: انتظر 1 دقيقة على الأقل في بين العروض التقديمية لنفس sensillum و. إذا تسجيل مع منبهة للذوق واحد لفترة طويلة من الزمن، والحل منبهة للذوق قد تجف والحل في الطرف قد تصبح أكثر تركيزا. هذا يمكن علاجه عن طريق الاتصال بلطف غيض من الزجاج الكهربائي مع ورقة ناعمة لإزالة كمية صغيرة من السائل عن طريق عمل شعري.
- لتسجيل الاستجابات لمنبهة للذوق آخر، وشطف وتسجيل تحميل الكهربائي مع منبهة للذوق جديد وكرر الخطوة 3.4. ملاحظة: الشطف بدقة القطب بين tastants هو القيمة المطلقةolutely حاسمة لتجنب التلوث المتبادل.
- حفظ ملفات البيانات بشكل دوري مع تحديد المعلومات، مثل التاريخ وراثى، وtastants. ملاحظة: من المهم الاحتفاظ بسجل مكتوب من منبهة للذوق والهوية sensillum وكل عرض خلال تسجيل الدورة لتحليل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 5A الاستجابة لL sensillum وإلى السكر، السكروز. لا يستجيب نفس sensillum والى مجمع المر، بربارين. الشكل 5B يظهر أن sensillum والنوع الأول، والذي يحتوي على الخلايا العصبية تستجيب المر، ويعرض المسامير السعة أكبر في استجابة لبربارين، وارتفاع السعة أصغر ردا على السكروز. L الشعيرات عرضه استجابة الخلفية الحد الأدنى لسيطرة المذيبات، TCC، بينما أنا الشعيرات عرضه تقريبا أي رد على TCC (الشكل 5). لمزيد من المعلومات حول الملح والماء ردود GRNs labellar، يرجى الرجوع إلى Hiroi 10.
الرقم 5. آثار الممثل البرية من نوع الاستجابات ذبابة الفاكهة labellar (A) L sensillu استجابة م إلى 100 ملي السكروز (SUC)، 1 ملم بربارين (ديسمبر)، و 30 ملي TCC. (B) I sensillar ردا على SUC، البر، وTCC. رأس السهم يشير إلى قطعة أثرية الاتصال الذي يحدث في بداية كل تسجيل. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 6. نتائج دون المستوى الأمثل الممثل الكهربية (أ) غياب كامل للإشارة (B) 50/60 هرتز "الضجيج" (C) الضوضاء العشوائية (D) الخلايا العصبية ميكانيكية حسية اطلاق النار وحده (E) مريرة GRN (مثلثات مفتوحة) والخلايا العصبية ميكانيكية حسية ( شغل مثلثات) على حد سواء اطلاق النار./ www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الشعيرات Labellar تختلف في سهولة تسجيل بسبب الاختلافات في التشكل وتنظيم التشريحية. أحيانا لا يستجيب إلى أي sensillum وtastants، حتى واحد ما هو معروف للحصول على رد إيجابي. التردد الذي يحدث هذا يختلف تبعا لنوع sensillum و. L الشعيرات هي الأكثر استجابة باستمرار وسهلة نسبيا للوصول بسبب طولها. بشكل عام، S الشعيرات تستجيب باستمرار، ولكن طولها قصيرة والموقف على labellum إجراء اتصالات جيدة الصعبة. أنا الشعيرات يمكن الوصول إليها بسهولة أكبر، تبعا لزاوية من إعداد، ولكن، هم أكثر لا تستجيب بشكل متكرر. على أي إعداد ذبابة معينة، نسبة أكبر من الشعيرات أنا قد لا تستجيب من L أو S الشعيرات. الخلفية الوراثية يمكن أن تؤثر على اتساق الاستجابات الذوق أيضا. على سبيل المثال، قد يكون بعض الذباب المعدلة وراثيا عرض استجابات أقل اتساقا من النوع البري، ويفترض لأن الجينات المحورة تؤثر على شركة جنرال الكتريكالصحة نيرال من الطاير. وقد لاحظنا أن ث - الذباب متحولة بشكل خاص تحديا للتسجيل من.
واحد مشكلة فنية مشتركة هو عدم وجود إشارة، أي لم يلاحظ أي كعب (الشكل 6A). الأولى، وأحيانا sensillum واحد معين قد يكون غير قادر على الاستجابة، في حين أن آخرين من نفس تلك الفئة على نفس ذبابة قد يستجيب. الثانية، قد يكون هناك فقاعة هواء في القطب تسجيل أو الإلكترود المرجعي. إذا اشتبه القطب تسجيل، وهذا يمكن ان تكون ثابتة ببساطة عن طريق إزالة وإعادة تعبئة الزجاج الكهربائي، والتنصت بلطف والتفتيش تحت التكبير لضمان عدم وجود فقاعات موجودة. إذا اشتبه الإلكترود المرجعي لاحتواء فقاعة الهواء، وإعادة بناء الإعدادية مع ذبابة الجديد هو أسهل طريقة لحل هذه المشكلة. الثالث، وأحيانا الأسلاك تحمل إشارة كهربائية قد لا تكون مرتبطة بشكل آمن. الرابعة، وأحيانا إشارة الجهد الذي حصل قد يكون إما أعلى أو أقل منمجموعة مكبر للصوت يمكن قياسها. إذا باستخدام مكبر للصوت tastePROBE، تحقق لمعرفة ما إذا كان أي من يصل مقطع أو مقطع أسفل ضوء مؤشر على. إذا كان مقطع يصل المؤشر الضوئي في وضع التشغيل، في كثير من الأحيان إزالة وإعادة تعبئتها الإلكترود المرجعي الزجاج، مع الحرص على ملء لا أكثر من منتصف الطريق ومحو أسفل خارج لإزالة الرطوبة سوف يعمل على حل المشكلة. الرطوبة على الجزء الخارجي من الزجاج الكهربائي تتمكن من إجراء الربط الكهربائي بين حالة المعادن من القطب والأسلاك، وإرسال إشارة خارج النطاق من مكبر للصوت. إذا فشل في حل المشكلة، أو مقطع إلى أسفل ضوء مؤشر على و، والنظر في الاقتراحات في الفقرة التالية لمكافحة الضجيج الكهربائي في النظام. الخامسة، وأحيانا ذبابة قد يموت أثناء إعداد أو لا يستجيب إلا مظهر صحي على الرغم من إعداد و. ظروف النمو، مثل الرطوبة ودرجة الحرارة والعمر ونوعية الغذاء، ومجهريات البقعة، فضلا عن الخلفية الوراثية أقل صحية يمكن أن تسهم في ارتفاعنسبة الذباب "لا تستجيب". أخيرا، ونادرا ما، وقطعة من المعدات قد تكون غير وظيفي. إذا لم يتحقق باستمرار إشارة واستنفدت كل الاحتمالات الأخرى، قد يكون من الضروري للتحقيق وظيفة كل قطعة من المعدات: headstage، مكبر للصوت، والتحويل الرقمي. أسهل طريقة للقيام بذلك هو استبدال قطعة من المعدات مع آخر من تلاعب ما هو معروف لتكون وظيفية. إذا تلاعب واحد فقط موجود في مختبر، ومولد إشارة يمكن استخدامها لاختبار وظيفة من المكونات الإلكترونية.
قضية فنية مشتركة أخرى هي أن من "الضوضاء"، والتي هي إشارة لوحظ أن لا تظهر لتمثيل إمكانات العمل العصبية أطلقت ردا على التحفيز الذوقية (أرقام 6B-E). الأولى، قد يؤدي الإشارة من 50/60 هرتز الضوضاء الكهربائية من تسجيل المعدات أو غيرها من المعدات قريب (الشكل 6B). مع عدم وجود ذبابة على الإلكترود المرجعي، المباشرةلاي ربط تسجيل وإشارة كهربائية من خلال قطرة من حل رينغر وأدخل وضع العبور على مكبر للصوت عن طريق الضغط على زر المتابعة. إذا الضجيج هو ملاحظتها على إشارة العبور، وهذا على الأرجح يعني أن الضجيج هو خارجي لإعداد الطاير. التأكد من أن جميع المعدات تلاعب يرتكز بشكل صحيح وأن القصدير الدروع احباط في مكانها الصحيح. محاولة إلغاء توصيل المعدات المجاورة لمعرفة ما إذا كان يتم التخلص من الضوضاء، أو حماية مكونات إضافية. الثانية، قد تظهر الضوضاء العشوائية (الشكل 6C). في هذه الحالة، والخطوات المفصلة ل50/60 هرتز الضوضاء لا يزال ينبغي القيام بها. بالإضافة إلى ذلك، حاول فصل أو استبدال مكونات مختلفة من أجهزة التسجيل، وبخاصة headstage و / أو مكبر للصوت. إذا لوحظ أي ضجيج عندما تكون متصلا الأقطاب مباشرة، ومن المرجح المصدر إعداد الذبابة نفسها. فإنه عادة ما يكون أبسط لإعداد ذبابة جديدة للتسجيل، مع الحرص على تقليل الأضرار التي لحقت الطاير. الثالث، وتفعيلمن الخلايا العصبية ميكانيكية حسية الواردة في sensillum و(أرقام 6D و6E) يمكن ملاحظتها. ويمكن تنشيط الخلايا العصبية ميكانيكية حسية إذا تم الأوساط sensillum وأو عازمة على تطبيق القطب تسجيل، أو صدم أثناء الاتصال. والتموج وعادة ما تكون مميزة عن المسامير التي كتبها حسي كيميائي نمط غير منتظم، والتي تظهر عادة بالتنسيق مع اضطراب الميكانيكية، وليس تطبيق التحفيز الذوقية. اطلاق ميكانيكية حسية يمكن التقليل من محاذاة القطب تسجيل sensillum ومع والنهوض بلطف فقط بقدر ما هو ضروري لاجراء اتصالات مع غيض من sensillum و. الرابع، ستوكاستيك زيادة "انفجار" يمكن ملاحظة، وهذا يبدو مشابهة لاطلاق العصبية، ولكن الترددات العالية والسعة، وليس منسقة ردا على التحفيز. هذه النتائج عادة من الإعدادية الطيران نفسها، وليس من المعدات، وربما يرجع ذلك إلى العصبية تعطلت بسبب الإلكترود المرجعي. </ ع>
وثمة مسألة تقنية مشتركة الثالث هو أن إعداد هو المحمول، مما تسبب في labellum للتحرك، الأمر الذي يجعل اتصال مع sensillum وصعبة. أولا، قد يكون إعداد ذبابة غير مستقرة. تأكد من أن الإلكترود المرجعي وضعه بشكل صحيح، وتعديل إذا لزم الأمر. الثانية، قد يكون الإلكترود المرجعي رقيقة جدا على طرف لعقد خرطوم وlabellum متحرك. محاولة بقطع كمية أطول من غيض قبل إعداد الطاير. إذا كان هذا لا يكفي، إعادة ضبط إعدادات ساحبة ماصة حسب الحاجة لتغيير شكل الإلكترود المرجعي بحيث تفتق هو أكثر تدرجا ويتم زيادة القطر قليلا. الثالث، قد تكون نشطة بشكل غير عادي الطاير. إعادة صياغة إعداد مع ذبابة جديدة.
للحصول على معلومات عامة الكهربية ومزيد من التوجيه استكشاف الأخطاء وإصلاحها، راجع دليل أكسون 30.
وهناك قيود قليلة على طريقة غيض تسجيل الواردة في هذا publicatأيون. القيد واحد هو أن منبهة للذوق يجب أن يكون للذوبان في الماء، ويتم تسليمها في القطب تسجيل جنبا إلى جنب مع بالكهرباء. هذا يزيد من صعوبة مع تسجيل المركبات الهيدروكربونية، على الرغم من استخدام المذيبات مثل DMSO جعلت بعض تسجيل مع الفيرومونات ممكن 4. النهج البديلة لاستخدام القطب التنغستن شحذ لأداء التسجيلات من قاعدة المقبس من sensillum و، أو استخدام الزجاج الكهربائي على أداء التسجيلات من الجدار الجانبي للsensillum و، في كل منها يتم تسليم منبهة للذوق بشكل مستقل من القطب تسجيل 26،27. ومع ذلك، هذه التقنيات هي صعبة والتسجيلات الجانب الجدار أكثر الضارة إلى الجهاز الذوق. قيود أخرى هو مقدار الوقت اللازم لتبادل الحل منبهة للذوق (البروتوكول الخطوة 3.3)، مما يقلل من الإنتاجية، ويحد من استخدام نماذج التحفيز معقدة غالبا ما ينظر في التسجيلات حاسة الشم. الخلايا العصبية مستقبلات الذوقية تظهر بعض التباينفي السعة التي تعتمد على وتيرة الارتفاع. هذه الميزة يمكن أن تعقيد تقييم هوية الخلايا العصبية وجعل ارتفاع متقدمة فرز أكثر صعوبة 25،31-33. بالإضافة إلى ذلك، بسبب طبيعة الأسلوب بلاغ تسجيل واحد لا يمكن أن تسجل اطلاق القاعدية على الفور قبل تقديم الحوافز، كما هو الحال عادة في التسجيلات حاسة الشم. على الرغم من هذه السلبيات، فقد تم استخدام أسلوب تسجيل بلاغ بنجاح لتوضيح العديد من المبادئ من ترميز الذوق في ذبابة الفاكهة وغيرها من الأنواع 8،10،17،19،21-23.
تقنية إعداد الذبابة المذكورة هنا هو نهج ممكن واحد فقط. في هذا الأسلوب إعداد يتم إصلاح خرطوم في موقف الموسعة لتسهيل الاتصال من القطب تسجيل مع sensillum والمصالح، ويتم إدخال إلكترود إشارة إلى الحيوان. وتشمل أساليب إعداد الأخرى المتصاعدة من الحيوان إلى كرة من الصلصال واستخدام شرائح رقيقة منالشريط لإصلاح خرطوم 34. في الواقع، طالما تم استيفاء المعايير الأساسية للاستقرار الأنسجة والمرجعية القطب التنسيب، والشعيرات في أماكن أخرى أو من مختلف الأنواع يمكن تسجيلها من في الكثير بنفس الطريقة. على سبيل المثال، يمكن تسجيل الشعيرات الساق من طريق تحديد الجسم من ذبابة إلى المجهر الشريحة المغلفة sylgard مع دبابيس الحشرات الجميلة، التفلطح الساقين قبالة حافة الزجاج قليلا 35. فمن الممكن لتقديم وكلاء الدوائية إلى الشعيرات عبر القطب تسجيل للتحقيق في نقل الإشارة في الخلايا العصبية مستقبلات الذوقية. هو مجرد مهمة التجريب لتحديد النهج الذي يعمل على نحو أفضل للنتائج المرجوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل NRSA 1F31DC012985 منحة دكتوراه مسبقا (لRD) ومنح المعاهد الوطنية للصحة لJC
نود أن نشكر الدكتور ينيا فايس لتعليقات مفيدة على المخطوطة، والدكتور ريان جوزيف لشخصيات مساعدة تجميع، والدكتور فريدريك ماريون-الإستطلاع للحصول على المشورة التقنية مفيدة. نود أيضا أن نعترف تعليقات مفيدة من أربعة المعلقين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
