Summary
本协议描述的由labellar味觉神经元在果蝇发射动作电位反应细胞外记录。
Abstract
昆虫的外围味道响应可以有力地调查与电生理技术。这里介绍的方法使研究人员直接和定量测量味觉反应，反映了感官输入，昆虫的神经系统从它的环境味觉刺激接收。该协议概述了在利用这项技术的所有关键步骤。在组装的电装备，如选择的必要设备和一个合适的环境记录的关键步骤，圈定。我们还描述了记录作出适当的参考和记录电极如何准备，并促味剂的解决方案。我们详细地描述用于通过插入玻璃参比电极成飞，以固定所述长鼻制备昆虫的方法。我们显示通过味觉神经元响应于一个糖和一个苦味化合物烧制的电脉冲的痕迹。该协议的某些方面为technically具有挑战性的，我们包括可能遇到的一些常见的技术挑战，如缺乏信号或噪音过大的系统，和潜在的解决方案广泛的描述。该技术具有局限性，如不能交付时间上复杂的刺激，观察背景发射前夕刺激交付，或使用不溶于水的呈味物质方便。尽管有这些限制，这项技术（包括在协议中引用的微小变化）是一种标准，用于记录果蝇神经元对味道的化合物广泛接受的过程。
Introduction
味觉允许的昆虫以检测可溶性的化学物质种类繁多并且起着一种营养物质的接受了重要的作用，或一种有毒或毒性1的抑制。味道也被认为在择偶中发挥作用，通过信息素1-5的检测。这些重要而多样化的功能所做的昆虫味觉系统调查的令人信服的目标进入感觉系统如何翻译环境因素纳入有关的行为输出。
果蝇味觉系统的主要单位是味道的头发，或感器。分子通过孔在其尖端2,6进入感器。感器上发现的唇瓣，腿，翅缘，咽6。在唇瓣，感受器的数量和位置是千篇一律。有感器基于长度3形态类：长（L），中间体（I），和短（S ）感器7,8。每个感器包含两个（I-型）或4（L-和S-型）味觉受体神经元（GRNS）9。不同GRNS应对不同类别的味觉刺激的：苦，糖，盐和渗透压7,10和表达味觉受体8,11-13的不同子集。只有我和S型感器含有苦响应GRNS 8,10。该GRNS项目的subesophageal神经节（SOG）和其活化味分子被传递到用于解码的更高中枢神经系统，从而导致行为反应6。数量相对较少的神经元和顺从分子和行为分析使果蝇味觉系统的味觉系统的一般调查一个很好的模型。相对难易程度，系统可以通过基因突变或GAL4-UAS表达系统来操作也可作为一种有价值的工具14,15。
ontent“>因为这些感受器从唇瓣的表面突出，它们使电生理学优良的目标。的GRNS的烧成可以使用外记录进行监控。历史上，侧壁的记录方法，其使用插入玻璃电极感器来记录神经细胞的活动，26已被使用，但是，这种方法在技术上是挑战性的执行，并且难以进行长时间录制从每个制备的针尖记录方法，其测量神经元的响应与电极的那同时提供了一个促味，从此成为首选9,16的方法，它已被用来研究果蝇 8,10,17,18的味觉系统，以及其他一些昆虫种类19-23，它有由tastePROBE放大器的发展，这克服了针尖记录方法的主要缺点之一通过补偿得到了极大的便利参比电极和对昆虫感器之间的大的电势差，使得没有过多的放大或过滤24要被记录的GRN动作电位。另一个重要发展是采用tricholine柠檬酸作为记录电解质25。台泥抑制反应的渗透压敏感GRN和不刺激盐敏感GRN，使得由苦和糖味质生成的反应更容易进行分析25。在这里，我们描述了如何在目前卡尔森实验室进行的果蝇 labellar感受器尖记录。该协议将解释如何建立一个合适的电钻机，如何准备飞，以及如何执行味道录音。我们也当使用这种出示由果蝇感器的子集，以及一些常见的问题和可能遇到的潜在解决方案的记录得出了一些有代表性的数据技术。
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Protocol
以下协议符合美国耶鲁大学的所有动物护理指引。
1。试剂和设备的准备
- 录音设备设置（ 图1A）。
- 选择是无大的变化温度或湿度，并从分离的电气和机械噪声，如冰箱和离心机的来源一个房间钻机安装。
图1。记录台设置的（一）概述。立体显微镜（一个）安装在隔振台（b）中选择参考电极支架（三）被安装在平台上的探头（四）相反，通过显微操作。一个出口的塑料管（五）提供针对飞准备加湿空气流也被安装在吨他的平台。该探头被连接到所述放大器（f）中，其连接到数字采集系统（DAS）（克），它被连接到PC（小时）。电极和出口管（B）配置：左侧参比电极，在右边记录电极，和空气流出口管冲着飞准备点击这里查看大图。 - 山体视显微镜抗振动台或平台的中心。
- 附加显微操作为参比电极/昆虫制剂和探头/记录电极的显微镜的左侧和右侧，分别使用磁性台灯。
- 贴装插座塑料管中的第三微操纵器到显微镜的后部，定向成使得管口指向朝向蝇预备的位置（参见图1B）。
- 使用柔性塑料管，在TACH出口塑料管保温瓶部分装满了水。连接一个小水族馆泵到空气泡通过水的烧瓶中，通过对苍蝇的出口塑料管生成加湿空气流。
- 摩光纤光源关闭振动台，定向输出经由正下方的编制一张白色卡片纸反射光照亮的准备。确保光源不休息在桌子上。注意：反映在纸张盘上的光源的优点是双重的：它能够使对比度提高，使得感受器更容易地可视化，并且它防止了准备，会导致直接的光加热。
- 塞tastePROBE放大器进入数字采集系统（DAS）和DAS到个人计算机，根据供应商的使用说明书。插上脚踏开关触发，并在工作区下的安排。注：电气隔离墙壁插座放大器和DAS是高度DESIR能。
- 用鳄鱼夹和绝缘电线和电工胶带长度连接的金属部件，以表电气接地显微镜，显微操作，以及光源。通过连接到地面建筑物或DAS，它是通过电源插头接地电接地的金属平台。
- 供选择的个人电脑上的DAS安装相应的采集软件。注意：确保数字采集驱动程序都与PC上的操作系统兼容。
- 配置软件的扩增（10到100倍），信号滤波（典型的是贝塞尔带通滤波器设定为100赫兹-3，000赫兹）和采样率（至少10千赫）。注：从味觉神经元的信号幅度一般在0.5-2毫伏范围内，所以显示比例设置，以方便他们的可视化。注意：100赫兹滤波器有助于排除外来的电噪声，但是，它的变化尖峰的形状，可以使先进的尖峰排序莫尔Ë挑战。可替换地，一个1赫兹滤波器都可以使用。
- 任选地，法拉第笼可以被设置围绕整个振动台。然而，铝箔的小片通常是足够的，以减少由外部环境或调查所产生的任何噪声。
- 选择是无大的变化温度或湿度，并从分离的电气和机械噪声，如冰箱和离心机的来源一个房间钻机安装。
- 玻璃电极的制备
图2。参考和记录电极。下玻璃毛细管拉成参比电极，用（A）的放大倍率和无（B）尖折断的照片，并记录电极（C）。白条表示2毫米。 点击这里查看大图。- 拉参考电极从使用吸管牵拉仪器的玻璃毛细管。注：移液器拉马计划的确切设置会有所不同仪器之间。努力实现一个很长的渐进的锥度。孔径在前端不是关键的，因为尖将飞准备（ 图2A和2B）之前被破坏，但是，确保该电极的锥形长度的直径既不太薄，这将不允许足够固定化的唇瓣，也不太大，这可能会损坏味觉神经元或破裂的唾液腺。
- 从与灯丝用吸管拉马仪器硼硅玻璃毛细管拉记录电极。试图实现一个锥度比的参比电极的浅，约10-15微米（ 图2C）28的孔径。
- 促味剂的溶液的制备
- 使用比德尔 - 弗鲁西城林格氏溶液化（B＆E）为参比电极的电解质。一公升的B＆E中，溶解7.5克氯化钠加入0.35g KCl和0.279克氯化钙2∙2H 2 O一公升超纯水。存储小等分试样在-20℃下
- 用30mM的tricholine柠檬酸溶液（TCC）作为记录电极电解质和溶剂为促味剂溶液25，如苦味或糖GRN响应是被测定。或者，1-3 73mM氯化钾溶液可以使用，如果是水电池的反应来测定。
- 为了使促味剂的解决方案，权衡促味剂适量粉末状，加入台泥作出初始库存的浓度。使用该项进行系列稀释从这个初始库存，以产生用于测试所需的浓度。注意：如果促味剂不容易溶于水，其它溶剂，如乙醇，可用于使初始原料浓度。台泥适当控制解决方案，并没有促味剂的溶剂应该在这种情况下被使用。
- 店等分长期在-20°C存储的促味剂溶液1工作等分试样在4℃下，用于记录使用长达一周，这取决于促味剂的化学性质。
2， 果蝇准备
图3。录音准备工作苍蝇（A）插入参比电极的位置成飞背胸部。白色箭头指示的参比电极。 （ 二）参比电极的中间位置是：通过颈部和头部先进，长鼻尚未扩展。 （C，D）与参比电极粉煤灰在最后的位置与尖端内唇瓣电极，和长鼻完全展开。 点击这里查看大图。
- 收集新eclosed苍蝇从维护良好的动态文化，温度和湿度控制的条件下生长记录，并把它们的年龄5-10天的记录之前，新鲜的培养瓶。
- 准备飞行前寒意镜板置于冰上15-30分钟。
- 与B＆E解决方案使用的是长而细胶针0.5毫米直径，如脊髓针1毫升注射器回填玻璃参比电极，并轻轻拍打任何气泡。打破少量尖关闭使用镊子和利用毛细作用来绘制出所有剩余的气泡组织，解剖显微镜下观察。
- 滑块B＆E填充参比电极丝上参比电极座，注意不要引入气泡。
- 吸飞入P200的移液器吸头，使用内置吸引苍蝇从管材，网格，和移液器吸头，在冰桶和冷却30-60秒29的地方。
- 从冰取出显微镜片，擦去水分，并在显微镜下的位置。轻轻拍打飞出枪头到显微镜板。
注：飞应充分固定，以轻松操控。 - 在低倍率，轻轻地用一对镊子取出前腿，同时保持稳定的胸部与其他钳子。放置在其腹侧飞，背部朝上。注意：请务必小心，以免在准备过程中接触唇瓣与钳在任何时候，以尽量减少机械损伤。
- 按住苍蝇的地方，一对镊子，将参比电极的后背胸部正中线。条目的一个建议的角度大约为45度，在所述头部（ 图3A）的方向。
- 固定参考electrodË持有人与橡皮泥，使得飞是在显微镜高倍下可见。通过颈部和头部操纵和角度的玻璃电极，通过使用两对钳子的滑动对参考电极架飞。注：很快，但工作顺利，它是更容易完成这个步骤，而苍蝇仍是从冷（ 图3B）固定。
- 轻轻地延长长鼻用一对钳子的，而滑动蝇进一步向下玻璃参比电极，直到电极的前端是唇瓣内侧和长鼻完全伸展（ 图3C和3D）。注：小心不要刺破任何部分长鼻组织或扩张与参比电极的唇瓣的边缘，因为这样可能会损坏苍蝇和/或味觉神经元，影响录音质量。
3。从Labellar感器记录
图4。从苍蝇录音（A）唇瓣上飞准备离开与接触的权利，在高倍率下对齐记录电极。 （ 二）记录电极和唇瓣单感器接触，在高放大倍率。 点击这里查看大图。
- 总是通过触摸抗振动台或平台的金属表面录制过程中接触任何设备之前，自己接地！注意：不提供静电荷的探头为可损坏电路是极其重要的。
- 安全参考电极夹到微操纵安装在recordin的航空表克钻机。位置1瓣唇瓣在视场显微镜的，在高倍率下（通常至少140X），并在加湿的空气的流线。
- 开启加湿空气流，电脑，DAS和放大器。开放的采集软件。
- 冲洗和填充玻璃记录电极与所需的促味剂。
- 通过使用注射器和塑料管28穿过管至少10次拉少量水冲洗玻璃记录电极用超纯水。
- 冲洗记录电极与促味剂的至少5倍。填写记录电极大约有三分之一到一半充满的促味剂和管取出。如果有气泡，点击释放或干脆重新填充电极。
- 滑动电极到探头的银线迅速而顺利以便不引入气泡。
- 刺激单感器与促味剂的填充记录电极。
- 使用micromanipu振荡器带给感兴趣感器对准记录电极。
- 按下脚踏开关触发放大器的采集模式。
- 超前的记录电极与显微操作的精细控制旋钮仔细直至它与感器和记录开始针尖接触。
- 经过1-2秒取出电极。
- 如果需要，重复步骤3.5与其他感器。注：等待至少1分钟的演讲到同一感器之间。如果有用于长时间的单个促味剂的记录，所述促味剂的溶液干燥后会在尖端的溶液可能会变得更加集中。这可通过用平滑的纸张通过毛细管作用来除去少量的液体玻璃电极的前端轻轻接触来补救。
- 记录对另一促味剂，冲洗并用新的促味剂负荷记录电极，然后重复步骤3.4。注：彻底冲洗味质的电极是ABSolutely至关重要的，以避免交叉污染。
- 定期保存数据文件的标识信息，如日期，基因型和促味剂。注：重要的是要保持记录会话的数据分析过程中的促味剂和每个演示感器身份的书面记录是很重要的。
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Representative Results
图5A示出了一个L形感器的一种糖，蔗糖的反应。同一感器不给苦化合物反应，黄连， 图5B示出了一个I型感器，它包含一个苦响应神经元，显示响应于小檗碱较大的幅度峰值，并响应于蔗糖较小的幅度峰值。 L感器显示一个最小的背景响应溶剂对照，台泥，而我感器显示给TCC几乎没有响应（ 图5）。有关labellar GRNS的盐和水反应的更多信息，请参阅广井10。
图5野生型果蝇 labellar回应代表的痕迹（A）L sensillu米响应于100mM的蔗糖（SUC），1mM的小檗碱（BER），和30mM TCC（B）I sensillar响应SUC，BER及TCC。箭头表示发生在每一个记录开始接触工件。 点击这里查看大图。
图6。代表最理想的电生理结果。（一 ）完全没有信号的（B）50/60赫兹“噪音”（C）随机噪声（D）mechanosensory神经元单独射击（E）苦GRN（空心三角形）和mechanosensory神经元（实心三角形）都烧成。/ www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
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Discussion
Labellar感受器由于形态和解剖组织的差异而有所不同在便于记录。有时候感器不响应任何促味剂，连一个已知可引起积极的回应。取决于感器类型与发生这种情况的频率而变化。 L感器是最一致响应和相对容易访问，因为它们的长度。一般来说，S感器是一致响应，但他们的短长并在唇瓣位置好好接触挑战性。余感器可以更容易地访问，这取决于制剂的角度，但是，它们更频繁响应。在任何给定的飞行准备，我感器更大比例可能是反应迟钝除L或S感器。遗传背景会影响味觉反应的一致性好。例如，一些转基因果蝇可能会显示比野生型不太一致的反应，大概是因为转基因影响GE苍蝇的橙花醛健康。我们观察到W -突变果蝇是特别具有挑战性的记录。
一个普通的技术问题是缺乏信号， 即没有尖峰被观察到（ 图6A）。首先，有时一个特定感器可能是反应迟钝，而其他人在相同的苍蝇同一个类的可能响应。第二，可能存在的气泡在记录电极或参比电极。如果记录电极之嫌，这可以通过简单地拆卸和重新填充玻璃电极，轻轻拍打并在放大镜下检查，以确保没有气泡存在。如果参比电极怀疑含有气泡，改造的准备与新飞是解决这个问题的最简单方法。第三，有时携带电信号的导线可能不能牢固地连接。第四，偶尔被接收到的电压信号可以是高于或低的范围内，放大器可以测量。如果使用tastePROBE放大器，请检查是否短片的向上或向下夹指示灯亮起。如果剪辑起来指示灯亮，经常拆卸和重新填充玻璃参比电极，同时注意填写不超过一半以上和擦拭下来的以外，以除去水分会解决这个问题。水分含量对玻璃电极的外侧可以使金属外壳，电极和导线之间的电连接，在发送信号输出的放大器的范围内。如果未能解决问题，还是剪辑下来指示灯上，考虑到打击系统的电子干扰下段的建议。第五，有时一只苍蝇可以制备过程中死亡或因其他原因无法响应，尽管准备的健康的外观。生长条件，例如湿度，温度，年龄，食物的质量，和微生物，以及一个不太健康的遗传背景可能有助于更高“反应迟钝”苍蝇的比例。最后，很少，一台设备可以是无功能的。如果信号始终没有实现，而所有其他的可能性都已经用尽，可能有必要进行调查每件设备的功能：探头，放大器和数字化仪。做到这一点最简单的方法就是更换一个设备与另一个来自被称为是功能钻机。如果只有一个钻机是目前在实验室中，信号发生器可以用于测试电子元器件的功能。
另一种常见的技术问题是“噪声”，这是一种不出现以表示烧成响应于味觉刺激（ 图6B-E）的神经元动作电位的观察信号。首先，该信号可能是由于从录音设备或其它设备附近（ 图6B）50/60赫兹的电噪声。由于没有参比电极上飞，直接LY连接记录和参比电极通过一个下降的林格氏液，按向上键进入直通模式的放大器。如果噪声是观察对直通信号，这可能意味着噪音外部飞准备。确保所有的钻机设备正确接地，并且锡箔屏蔽到位。尝试拔掉附近的设备，看看噪音被消除，或屏蔽其他组件。其次，可能会出现噪点随机（ 图6C）。在这种情况下，详细的为50/60 Hz的噪声的步骤仍应进行。此外，尝试拔出或更换录音设备的不同组成部分，特别是探头和/或放大器。如果当电极被直接连接无噪声被观察到的，源很可能飞制剂本身。它通常是最简单的，以备记录新飞，小心，尽量减少损坏飞。第三，激活包含感器内的mechanosensory神经元（ 图6D和6E）可以观察到。该mechanosensory神经元可如果感器偏转或申请记录电极的弯曲，或接触碰撞过程中被激活。尖峰通常是区别于化学感受尖峰由不规则的图案，通常会出现配合的机械破坏，而不是味觉刺激的应用。 Mechanosensory烧成可通过比对记录电极与感器和推进轻轻仅只要是必要的，使接触带感器的前端被最小化。四，随机秒杀“爆棚”可以观察到，这会出现类似神经元放电，但高频率和幅度，以回应刺激并不协调。这通常会导致从蝇制备本身，而不是从设备，并且可能是由于由参考电极扰乱神经。</ P>
第三个常见的技术问题是，准备为移动，导致唇瓣移动，这使得有困难感器连接。首先，苍蝇制剂可能是不稳定的。检查参比电极的位置正确，并在必要时重新调整。第二，参考电极可能太薄在前端保持该长鼻和唇瓣动的。试着掰一个较长的金额尖端的准备飞之前。如果这是不够的，因为需要改变的参比电极的形状调整的移液管拔出器的设置，使得锥形是更渐进的直径稍微增加。第三，苍蝇可能是异常活跃。翻拍的准备与新飞。
对于一般的电生理信息和更多的故障排除指南，请参阅轴突指南30。
有一些限制到尖部 - 记录方法，在此publicat概述离子。一个限制是，所述促味剂必须是水溶性的，因为它是装在沿与电解质的记录电极。这增加了录制与烃类化合物的难度，但使用像DMSO溶剂中取得了一定的记录与信息素可能4。替代方法是使用一个削尖的钨电极从感器的插座基座进行录音，或使用玻璃电极，以从侧壁感器的执行记录，在记录电极这两者的促味剂被独立传递的26,27。然而，这些技术是具有挑战性和侧壁录音是更有害的味觉器官。另一个限制是交换的促味剂溶液（协议步骤3.3），从而降低了吞吐量所需的时间量，并且限制了使用的复杂的刺激范式经常出现在嗅觉录音。味觉受体神经元表现出一定的可变性在振幅是依赖于尖峰频率。此功能可以复杂神经元的身份进行评估，使先进的秒杀排序比较困难25,31-33。此外，由于尖部 - 记录方法的性质1不能基底击发刺激的递送之前立即记录，如通常在嗅觉录制完成。尽管有这些缺点，尖部-记录方法已成功地用于阐明许多味觉编码果蝇和其它物种8,10,17,19,21-23的原理。
这里所概述的苍蝇制备技术仅仅是一种可能的方法。在此制备方法的长鼻被固定在延伸位置，以方便与所关注的感器记录电极的接触，和参比电极插入动物。其它制备方法包括对动物的安装到橡皮泥球和使用细条的胶带固定长鼻34。的确，只要组织稳定和参考电极放置的基本参数都满足时，感受器在其它位置，或从不同的物种，可以从在大致相同的方式记录下来。例如，腿部感器可以从通过固定一只苍蝇的身体用细昆虫针一SYLGARD涂层的载玻片，张开腿断玻璃稍微35的边记录。它可以通过记录电极提供药物制剂的感受器，调查信号转导中的味觉受体神经元。这只不过是实验的任务，以确定哪种方法对所期望的结果是最好的。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由一个NRSA博士前补助1F31DC012985（到RD）和美国国立卫生研究院资助，以支持JC
我们要感谢琳内亚魏斯博士的帮助编制数字上的稿子，约瑟夫·莱恩博士有益的意见和弗雷德里克博士马里昂轮询的有益的技术咨询。我们也想感谢的四审稿意见非常有用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
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