Summary
פרוטוקול זה מתאר הקלטה תאית מתגובות פוטנציאל הפעולה שנורו על ידי נוירונים טעם labellar בדרוזופילה.
Abstract
תגובת הטעם ההיקפית של חרקים יכולה להיחקר בעוצמה עם טכניקות אלקטרו. השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחוקר כדי למדוד את תגובות התעוררו אצלם באופן ישיר וכמותית, המשקף את הקלט החושי שמערכת העצבים של החרקים מקבלת מגירויי טעם בסביבתו. פרוטוקול זה מתאר את כל השלבים העיקריים בביצוע טכניקה זו. השלבים הקריטיים בהרכבת מתקן אלקטרופיזיולוגיה, כגון מבחר של ציוד דרוש וסביבה מתאימה להקלטה, מסומנים. אנו גם מתארים כיצד להתכונן להקלטה על ידי ביצוע אלקטרודות התייחסות והקלטה מתאימות, ופתרונות tastant. אנו מתארים בפירוט את השיטה המשמשת להכנת החרקים על ידי החדרת אלקטרודה התייחסות זכוכית לתוך הזבוב על מנת לשתק את חוטם. אנחנו מראים עקבות של הדחפים החשמליים שנורו על ידי נוירונים טעם בתגובה לסוכר ומתחם מרים. היבטים של הפרוטוקול הם לאechnically מאתגר וכוללים תיאור נרחב של כמה אתגרים משותפים טכניים שעשויים להיות נתקלו, כגון חוסר אות או רעש מוגזם במערכת, ופתרונות אפשריים. הטכניקה יש מגבלות, כגון חוסר היכולת לספק גירויי temporally מורכבים, להתבונן ברקע הירי מייד לפני גירוי משלוח, או להשתמש בתרכובות טעם לא מסיסים במים בנוחות. למרות מגבלות אלה, בטכניקה זו (כולל שינויים קלים בהפניה בפרוטוקול) היא תקן, הליך מקובל באופן רחב להקלטת תגובות עצביות דרוזופילה לטעום תרכובות.
Introduction
חוש הטעם מאפשר חרקים כדי לזהות מגוון רחב של כימיקלים מסיסים וממלא תפקיד חשוב בקבלה של חומר מזין, או הדחייה של אחד מזיק או רעיל. טעם הוא חשב גם לשחק תפקיד בבחירת בן זוג, באמצעות זיהוי של פרומונים 1-5. תפקידים חשובים ומגוונים אלה הפכו את מערכת טעם החרקים יעד משכנע של חקירה כיצד מערכות חושיות לתרגם אותות סביבתיים לתפוקות התנהגותי רלוונטיות.
היחידה העיקרית של מערכת טעם melanogaster דרוזופילה היא שיער הטעם, או Sensillum. מולקולות להיכנס Sensillum דרך נקבובית ב2,6 קצהו. Sensilla נמצא על labellum, הרגליים, מרווח הכנף, והלוע 6. על labellum, המספר והמיקום של sensilla הוא סטריאוטיפי. ישנם שלושה סוגים מורפולוגיים של sensilla מבוססים על אורך: הארוך (L), בינוני (אני), וקצר (S ) Sensilla 7,8. כל Sensillum מכיל או שניים (אני מסוג) או ארבעה (L-ו-S-type) נוירונים קולט התעורר אצלם (GRNs) 9. GRNs שונה מגיב לסוגים שונים של גירויי טעם: מריר, סוכר, מלח וosmolarity 7,10 ולהביע תת שונה של קולטנים התעוררו אצל 8,11-13. רק אני וsensilla S-הסוג להכיל GRNs המר מגיב 8,10. פרויקט GRNs לגנגליון subesophageal (SOG) וההפעלה שלהם על ידי מולקולות טעם מועבר למערכת העצבים המרכזית גבוהה יותר לפענוח, וכתוצאה מכך תגובה התנהגותית 6. המספר הקטן יחסית של תאי עצב ורמת המוכנות לניתוח מולקולרי והתנהגותיות להפוך את המערכת לטעם דרוזופילה מודל מצוין לחקירה של מערכות התעוררו אצלם באופן כללי. קלות היחסית שבי המערכת ניתן להשפיע באמצעות מערכת ביטוי GAL4-כטב"מ מוטציה גנטית או משמשת גם ככלי רב ערך 14,15.
ontent "> בגלל sensilla אלה בולטים מפני שטח של labellum, הם עושים מטרות מעולים לאלקטרופיזיולוגיה. ירי GRNs ניתן לנטר באמצעות הקלטה תאית. מבחינה היסטורית, שיטת ההקלטה בצד הקיר, אשר משתמשת באלקטרודת זכוכית מוכנסת לתוך Sensillum להקליט פעילות עצבית, 26 כבר בשימוש. עם זאת, שיטה זו היא מאתגרת מבחינה טכנית לביצוע, וקשה להקליט במשך זמן רב מהכנה. שיטת טיפ ההקלטה, המודדת את התגובה של נוירונים עם אלקטרודה ש בו זמנית מספק tastant, הפכה מאז את שיטת הבחירה 9,16. זה נוצל כדי לחקור את מערכת הטעם של melanogaster דרוזופילה 8,10,17,18 כמו גם מספר מיני חרקים האחרים 19-23. יש לו כבר הקל באופן משמעותי על ידי הפיתוח של מגבר tastePROBE, שהתגבר על אחד החסרונות העיקריים של שיטת טיפ ההקלטה ידי פיצוי עבורההבדל הגדול בין פוטנציאל אלקטרודה ההשוואתית וSensillum החרקים, המאפשר לפוטנציאל פעולת GRN שיירשם בלי הגברה או סינון 24 מוגזמות. התפתחות חשובה נוספת הייתה השימוש בציטרט tricholine כאלקטרוליט הקלטת 25. TCC מדכא תגובות מGRN osmolarity רגיש ולא לעורר את GRN מלח רגיש, מה שהופך את תגובות שנוצרו על ידי tastants המר וסוכר הרבה יותר קל לנתח 25.כאן אנו מתארים כיצד הקלטת קצה sensilla labellar דרוזופילה מתבצעת כיום במעבדה קרלסון. פרוטוקול זה יסביר כיצד להקים מתקן מתאים אלקטרופיזיולוגיה, כיצד להכין את הזבוב, וכיצד לבצע הקלטות טעם. אנו מציגים גם כמה נתונים נציג מתקבלים על ידי הקלטה מתת קבוצות של sensilla דרוזופילה, כמו גם כמה מבעיות נפוצות ופתרונות אפשריים שעשויים להיות נתקלו בעת שימוש זהטכניקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא עומד בכל הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת ייל.
1. חומרים כימיים וציוד הכנה
- התקנת ציוד הקלטה (איור 1 א).
- בחר מקום להתקנת מתקן שהוא ללא שינויים גדולים בטמפרטורה או לחות וגם מבודד ממקורות רעש חשמלי ומכאני, כגון מקררים וצנטריפוגות.
איור 1. (א) סקירה כללית של התקנת מתקן הקלטה. סטראו (א) הוא רכוב על פלטפורמה נגד רעידות (ב) בעל אלקטרודה. הפניה (ג) הוא רכוב על פלטפורמה מול headstage (ד), באמצעות micromanipulators. צינור לשקע פלסטיק (ה) אספקת זרם אוויר humidified המכוון להכנה לטוס גם רכוב על tהוא הפלטפורמה. Headstage מחוברת למגבר (ו), אשר מחובר למערכת הדיגיטלית הרכישה (DAS) (ז), אשר מחוברת למחשב (שעות). תצורה (B) של אלקטרודות וצינור לשקע:. אלקטרודה השוואתית בצד השמאל, האלקטרודה הקלטה בצד הימין, וצינור לשקע זרם האוויר המכוון להכנה לטוס לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. - סטראו הר למרכז שולחן נגד רעידות או פלטפורמה.
- צרף micromanipulators להכנת אלקטרודה השוואתי / החרקים וheadstage / אלקטרודה הקלטה לשמאל וימין של המיקרוסקופ, בהתאמה, באמצעות דוכנים מגנטיים.
- צינור הר לשקע פלסטיק בmicromanipulator שלישי לחלקו האחורי של מיקרוסקופ, בכיוון כזה שפתיחת הצינור היא הצביעה לכיוון מיקום של הכנת זבוב (ראה איור 1).
- באמצעות צינורות פלסטיק גמישים, בצינור פלסטיק לשקע Tach לבקבוק ריק מלאים באופן חלקי עם מים. חבר משאבת אקווריום קטנה לאוויר בועות במים בבקבוק, יצירת זרם אוויר humidified דרך צינור פלסטיק השקע לכיוון לטוס.
- אופטי הר סיבי מקור אור משולחן הרטט, את מכוון את התפוקות כדי להאיר את ההכנה על ידי המשקף אור באמצעות פיסת נייר לבן כרטיס ישירות מתחת להכנה. ודא שמקור האור לא נח על השולחן. הערה: טובת המשקף את מקור האור על דיסק נייר היא כפולה: הוא משפר את הניגודיות, מה שהופך קל יותר sensilla לדמיין, והיא מונעת חימום של התכשיר, אשר יוביל מאור ישיר.
- חבר מגבר tastePROBE לתוך המערכת הדיגיטלית הרכישה (DAS), וDAS למחשב אישי, על פי הוראות ספק. חבר הדק דוושת רגל ובלסדר תחת סביבת עבודה. שים לב: שקעים חשמלי מבודדים למגבר וDAS הם מאוד Desirהצליח.
- חשמלית קרקע מיקרוסקופ, micromanipulators, ומקור אור על ידי חיבור רכיבי מתכת לשולחן באמצעות קליפים תנין ואורכים של חוט חשמל מבודד והקלטת חשמל. חשמלית קרקע משטח מתכת על ידי חיבור לבניית קרקע או DAS, אשר מעוגן באמצעות תקע אספקת חשמל.
- התקנת תוכנת רכישה מתאימה לDAS של בחירה במחשב האישי. הערה: ודא כי רכישת הנהגים הדיגיטליים בקנה אחד עם מערכת ההפעלה במחשב.
- קבע את תצורת ההגברה תוכנה (10-100x), סינון אות (בדרך כלל מסנן bandpass בסל שנקבע מ100 Hz-3, 000 הרץ), וקצב דגימה (לפחות 10 KHz). הערה: אמפליטודות אותות מתא העצב התעורר אצלם הן בדרך כלל בטווח שבין 0.5-2 mV, אז בקנה מידה התצוגה מוגדרת כדי להקל על ויזואליזציה שלהם. הערה: מסנן 100 הרץ עוזר להוציא רעש חשמלי חיצוני, עם זאת, הוא משנה את הצורה של קוצים והוא יכול לעשות מור ספייק מיון מתקדםדואר מאתגר. לחלופין, ניתן להשתמש במסנן 1 הרץ.
- לחלופין, כלוב פאראדיי ניתן להגדיר סביב השולחן כולו הרטט. עם זאת, גיליונות קטנים של רדיד אלומיניום הם בדרך כלל מספיק כדי להפחית את כל רעש שנוצר על ידי הסביבה או חוקר החיצוני.
- בחר מקום להתקנת מתקן שהוא ללא שינויים גדולים בטמפרטורה או לחות וגם מבודד ממקורות רעש חשמלי ומכאני, כגון מקררים וצנטריפוגות.
- זכוכית אלקטרודה הכנה
אלקטרודות איור 2. סימוכין והקלטה. צילום תחת הגדלה של נימי זכוכית נכנסו לאלקטרודה השוואתית, עם () ובלי טיפ (ב ') נשבר, והאלקטרודה הקלטה (C). בר לבן מייצג 2 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.- משוך את ההתייחסותהאלקטרודה מנימי זכוכית באמצעות מכשיר חולץ פיפטה. הערה: ההגדרות של תכנית חולץ פיפטה המדויקות משתנות ממכשיר למכשיר. נסה להשיג להתחדד הדרגתי ארוכה מאוד. הגודל הנקבובית בקצה הוא לא קריטי כי הקצה יהיה שבור לפני הכנה לטוס (2A דמויות ו2B), עם זאת, לוודא כי הקוטר של האורך מחודד של האלקטרודה הוא לא רזה מדי, שלא תאפשר למספיק חוסר תנועה של labellum, ולא גדול מדי, שעלול לגרום נזק לתאי העצב התעורר אצלם או לקרוע את בלוטות הרוק.
- משוך האלקטרודה הקלטה מזכוכית בורוסיליקט נימים עם נימה באמצעות מכשיר חולץ פיפטה. נסה להשיג להתחדד שהוא רדוד יותר מזה של האלקטרודה ההתייחסות, וקוטר נקבובית של כ 10-15 מיקרומטר (איור 2C) 28.
- הכנת פתרונות Tastant
- השתמש solu רינגר בדל-Ephrussition (B & E) כאלקטרוליט אלקטרודה ההשוואתי. כדי להפוך ליטר אחד של B & E, לפזר 7.5 גרם NaCl, 0.35 גרם KCl, ו0.279 גרם CaCl 2 ∙ 2H 2 O בליטר אחד של מים ultrapure. אחסן aliquots קטנים יותר ב -20 ° C.
- השתמש 30 מ"מ פתרון tricholine ציטרט (TCC) כאלקטרוליט האלקטרודה הקלטה והממס עבור פתרונות tastant 25, אם תגובות GRN מרות או סוכר הן כדי להימדד. לחלופין, ניתן להשתמש 1-3 פתרון אשלגן כלורי מ"מ אם תגובות של תא המים כדי להימדד.
- כדי להפוך את פתרונות tastant, לשקול כמות מתאימה של tastant בצורת אבקה ולהוסיף לTCC לעשות ריכוז מניות ראשוני. להשתמש בזה כדי לעשות דילולים סדרתי מהמלאי ראשוני זה להניב הריכוז הרצוי לבדיקה. הערה: אם tastants לא בקלות מתמוסס במים, ממס אחר, כגון אתנול, ניתן להשתמש בם כדי להפוך את ריכוז מניות ראשוני. פתרון מתאים שליטה של TCC וממס ללא tastantיש להשתמש במקרה זה.
- aliquots חנות לטווח ארוך ב -20 ° C. אחסן aliquot עובד אחד פתרון tastant על 4 מעלות צלזיוס להקלטת שימוש לתקופה של עד שבוע, תלוי בתכונות כימיות של tastant.
2. דרוזופילה הכנה
איור 3. הכנת לטוס להקלטה. () עמדת החדרת אלקטרודה התייחסות לבית חזה הגבי של זבוב. החץ הלבן מצביע על האלקטרודה ההתייחסות. (ב) עמדת ביניים של אלקטרודה השוואתית: מתקדמת דרך צוואר וראש, חוטם עדיין לא הוארך. (C, D) טוס עם אלקטרודה השוואתית במצב סופי עם קצה האלקטרודה בתוך labellum, וחוטםפתוח לגמרי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
- לאסוף זבובי eclosed חדש להקלטה מתרבויות לטוס מתוחזק היטב, גדלו תחת וטמפרטורת תנאי לחות מבוקרת, וגילם 5-10 ימים בבקבוקוני תרבות טריים לפני ההקלטה.
- צ'יל צלחת מיקרוסקופ על קרח למשך 15-30 דקות לפני ההכנה לטוס.
- מילוי אלקטרודת זכוכית התייחסות עם פתרון B & E באמצעות מחט דקה וארוכה מפלסטיק של 0.5 בקוטר מ"מ, כגון מחט השדרה ומזרק 1 מ"ל ולטפוח בעדינות את כל בועות. לשבור כמות קטנה של קצה ממני באמצעות מלקחיים ולהשתמש בפעולת נימים כדי להוציא את כל הבועות שנותרו עם רקמה, התבוננות תחת מיקרוסקופ לנתח.
- שקופיות B & E מלאה אלקטרודה השוואתית על חוט של בעל אלקטרודה השוואתי, נזהר שלא להכניס בועות אוויר.
- לשאוב לטוס לקצה פיפטה P200, באמצעות aspirator זבוב נבנהמצינורות, רשת, וקצה פיפטה; 29 מקום בדלי קרח וצינה ל30-60 שניות.
- הסר את צלחת מיקרוסקופ מקרח, לנגב את כל לחות, ובמקומו מתחת למיקרוסקופ. לטפוח בעדינות לטוס מקצה פיפטה לצלחת מיקרוסקופ.
הערה: הזבוב צריך להיות משותק במידה מספקת כדי לתפעל בקלות. - תחת הגדלה נמוכה, להסיר בעדינות את הרגליים הקדמיות עם זוג אחד של מלקחיים, תוך החזקה יציבה חזה עם זוג מלקחיים האחר. מקם את הזבוב על צד הגחון שלו, צד גב כלפי מעלה. שים לב: תמיד להיות זהיר ולהימנע מלגעת בlabellum עם המלקחיים בכל העת במהלך תהליך ההכנה כדי למזער את הנזק מכאני.
- בעוד מחזיק את הזבוב במקום עם זוג אחד של מלקחיים, להכניס את האלקטרודה ההתייחסות בקו האמצע של בית חזה האחורי גב. זווית הציעה כניסה היא מעלות כארבעים וחמש, לכיוון הראש (איור 3 א).
- Secure electrod ההתייחסות בעל דואר עם פלסטלינה כזה שהזבוב הוא גלוי לעין מתחת למיקרוסקופ בהגדלה גבוהה. לתמרן וזווית אלקטרודת הזכוכית דרך הצוואר והראש, על ידי הזזה לטוס כלפי בעל אלקטרודה ההשוואתי באמצעות שני זוגות מלקחיים. שים לב: עבודה במהירות, אך בצורה חלקה, זה קל יותר להשלים שלב זה בזמן שהזבוב עדיין משותק מהקור (איור 3 ב).
- בעדינות להאריך את חוטם עם זוג אחד של מלקחיים, תוך הזזה לטוס בהמשך אלקטרודה ההשוואתי זכוכית, עד קצה האלקטרודה נמצא בישוב labellum והחוטם מוארך (3C דמויות ו3D) באופן מלא. הערה: שים לב שלא לנקב כל חלק של רקמת חוטם או להתנפח קצה labellum עם אלקטרודה ההשוואתית, כמו זה עלול לגרום נזק לזבוב ו / או טעם נוירונים ולהשפיע על איכות ההקלטה.
3. הקלטה מLabellar Sensilla
gether.within-page = "תמיד"> 
איור 4. הקלטה מזבוב. () Labellum של הכנת זבוב על שמאל עם אלקטרודה הקלטה מיושרת למגע בצד ימין, בהגדלה גבוהה. (ב) אלקטרודה ההקלטה וSensillum היחיד על labellum במגע, בהגדלה גבוהה. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
- תמיד לקרקע את עצמך על ידי נגיעה במשטח המתכת של השולחן נגד רעידות או פלטפורמה לפני שתיגע בציוד במהלך הקלטת תהליך! הערה: חשוב מאוד לא למסור מטען סטטי לheadstage שכיכול לגרום נזק למעגלים.
- בעל אלקטרודה התייחסות מאובטח לmicromanipulator רכוב על שולחן אוויר של recordinמתקן g. אונת עמדה אחת labellum בתחום המיקרוסקופ של נוף, בהגדלה גבוהה (בדרך כלל לפחות 140X), ועולה בקנה אחד עם זרם אוויר humidified.
- הפעל זרם humidified אוויר, מחשב, DAS, ומגבר. רכישת תוכנה פתוחה.
- יש לשטוף ולמלא את האלקטרודה הקלטת זכוכית עם tastant הרצוי.
- יש לשטוף את האלקטרודה הקלטת זכוכית עם המים ultrapure באמצעות מזרק וצינורות פלסטיק 28 למשוך כמויות קטנות של מים דרך הצינור לפחות עשר פעמים.
- יש לשטוף את האלקטרודה הקלטה עם tastant לפחות חמש פעמים. מלא האלקטרודה הקלטה כשליש עד מלא באמצע הדרך עם tastant ולהסיר מצינורות. אם יש בועות אוויר, הקש לשחרר או פשוט למלא את האלקטרודה.
- הסט האלקטרודה על חוט כסף של headstage במהירות ובצורה חלקה, כדי לא להכניס בועות אוויר.
- לעורר Sensillum היחיד עם אלקטרודה הקלטה מלאה tastant.
- השתמש micromanipulator להביא את האלקטרודה ההקלטה מיושרת עם Sensillum של עניין.
- לחץ דוושת רגל כדי להפעיל את מצב רכישה של המגבר.
- לקדם את האלקטרודה ההקלטה עם ידית שליטת קנס של micromanipulator בזהירות עד שהוא יוצר קשר עם קצה Sensillum וההקלטה מתחילים.
- הסר את האלקטרודה אחרי 1-2 שניות.
- חזור על שלב 3.5 עם sensilla אחר, אם תרצה בכך. שים לב: המתן דקות לפחות 1 בין מצגות לאותו Sensillum. אם הקלטה עם tastant אחת לתקופה ממושכת של זמן, פתרון tastant עלול להתייבש והפתרון בקצה עשוי להיות מרוכז יותר. זה ניתן לתיקון על ידי בעדינות לפנות את הקצה של אלקטרודת הזכוכית עם נייר חלק כדי להסיר כמות קטנה של נוזל על ידי פעולת נימים.
- כדי להקליט תגובות לtastant אחרת, לשטוף והאלקטרודה הקלטת עומס עם tastant החדש וחזור על שלב 3.4. הערה: ביסודיות שטיפת האלקטרודה בין tastants היא שרירי הבטןolutely חיוני, כדי למנוע זיהום צולב.
- לשמור קבצי נתונים מעת לעת עם פרטים מזהים, כגון תאריך, גנוטיפ, וtastants. שים לב: חשוב לשמור על תיעוד כתוב של tastant וזהות Sensillum של כל מצגת במהלך הקלטת ישיבה לניתוח נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 5 א מציג את התגובה של Sensillum L לסוכר, סוכרוז. אותו Sensillum אינו מגיב למתחם המר, berberine. איור 5 מראה כי Sensillum סוג I, אשר מכיל תאי עצב מגיב מרים, מציג קוצים גדולים המשרעת בתגובה לberberine, וקוצי משרעת קטנים יותר בתגובה לסוכרוז. L sensilla להציג תגובת רקע מינימאלית לשליטת הממס, TCC, בזמן שאני sensilla להציג כמעט שום תגובה לTCC (איור 5). לקבלת מידע נוסף על תגובות מלח ומים של GRNs labellar, עיין Hiroi 10.
איור 5. עקבות נציג של תגובות labellar דרוזופילה wild-type () sensillu L תגובה מ 'ל100 סוכרוז מ"מ (SUC), berberine 1 מ"מ (BER), ו30 מ"מ TCC. (ב) אני sensillar תגובה לSUC, BER, וTCC. ראש החץ מצביע על חפץ קשר המתרחש בתחילת כל הקלטה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 6. נציג תוצאות לא טובים אלקטרו. חוסר מוחלט של אות (B) 50/60 "רעש" הרץ (ג) רעש סטוכסטיים נוירון mechanosensory ירי לבד (E) GRN המר (משולשים פתוחים) ונוירון mechanosensory ((ד) () מילא משולשים) שני יורים./ "= היעד" _blank www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sensilla Labellar להשתנות בקלות ההקלטה, בשל הבדלים במורפולוגיה וארגון אנטומיים. לפעמים Sensillum אינו מגיב לכל tastants, אפילו אחד, כי ידוע כדי לעורר תגובה חיובית. התדירות שבה זה קורה משתנה בהתאם לסוג Sensillum. sensilla L הם הכי מגיב באופן עקבי וקלים יחסית לגשת בשל אורכם. באופן כללי, sensilla S מגיבים באופן עקבי, אבל האורך הקצר שלהם והעמדה בlabellum ליצור קשר טוב מאתגר. אני sensilla ניתן לגשת בקלות רבה יותר, תלוי בזווית של ההכנה, עם זאת, הם לעתים קרובות יותר שאינם מגיבים. על כל הכנת זבוב נתון, חלק גדול יותר שלי sensilla עלולה שלא להגיב מאשר L או sensilla S. רקע גנטי יכול להשפיע על העקביות של תגובות טעם גם כן. לדוגמא, כמה זבובים מהונדסים עשויים להציג תגובות עקביות פחות פראי מסוג, כנראה משום transgenes משפיע על geבריאות neral של הזבוב. יש לנו ציינו כי w - זבובים שעברו מוטציה הם מאתגרים במיוחד כדי להקליט מ.
בעיה טכנית נפוצה היא חוסר האות, כלומר אין קוצים הם נצפו (איור 6 א). ראשית, לפעמים Sensillum אחד מסוים עלולה שלא להגיב, ואילו אחרים של אותה כיתה באותו הזבוב עשויים להגיב. שנית, ייתכן שיש בועת אוויר באלקטרודה ההקלטה או אלקטרודה השוואתית. אם האלקטרודה ההקלטה חשודה, זה יכול להיות קבוע על ידי הסרת ומילוי אלקטרודת הזכוכית, הקשה על עדינות והבדיקה תחת הגדלה כדי להבטיח שאין בועות נוכחים. אם האלקטרודה ההתייחסות חשודה להכיל בועת אוויר, מציע מחדש את ההכנה עם זבוב חדש הוא הדרך הקלה ביותר כדי לפתור בעיה זו. שלישית, לפעמים החוטים נושאים את האות החשמלי לא יכולים להיות מחוברים באופן מאובטח. רביעית, מדי פעם את אות המתח שקבלה עשויה להיות גבוהה או נמוכה יותר מאשרמגוון המגבר יכול למדוד. אם משתמש במגבר tastePROBE, בדוק אם אחד קליפ או סרטון למטה נורית החיווי דולק. אם נורית חיווי הסרטון למעלה היא על, לעתים קרובות הסרת ומילוי אלקטרודה השוואתי זכוכית, תוך הקפדה על מילוי לא יותר מחץ הדרך ומנגב את מחוץ להסרת לחות תפתור את הבעיה. רטיבות בצד החיצוני של אלקטרודת הזכוכית יכולה לעשות חיבור חשמלי בין מקרה המתכת של האלקטרודה והתיל, שולחת אות מחוץ לטווח של המגבר. אם זה לא יצליח לפתור את הבעיה, או את נורית חיווי הסרטון למטה הוא על, לשקול הצעות בפסקה הבא כדי להילחם ברעש חשמלי במערכת. חמישית, לפעמים זבוב עלול למות במהלך הכנה או בדרך אחרת שאינו מגיב למרות המראה של ההכנה בריא. תנאי גידול, כגון לחות, טמפרטורה, גיל, איכות מזון, וחיידקים, כמו גם רקע גנטי פחות בריא יכולים לתרום לגבוה יותרחלקם של זבובים "לא מגיבים". לבסוף, רק לעתים נדירות, פיסת הציוד עשויה להיות בלתי פעילה. אם האות באופן עקבי אינה מושגת וכל האפשרויות האחרות מוצו, ייתכן שיהיה צורך לחקור את הפונקציונליות של כל חתיכה של ציוד: headstage, מגבר, וdigitizer. הדרך הקלה ביותר לעשות זאת היא להחליף פריט ציוד עם עוד מאסדה שידוע להיות פונקציונלי. אם רק אחד אסדה נמצאת במעבדה, מחולל אותות יכול לשמש כדי לבדוק את הפונקציונליות של הרכיבים האלקטרוניים.
בעיה טכנית נפוצה נוספת היא זו של "רעש", שהיא אות שנצפתה שאינו מופיעה כדי לייצג את פוטנציאל פעולה עצבי שנורה בתגובה לגירוי התעורר אצלם (איורים 6 ב-E). ראשית, האות עלולה לגרום מ50/60 רעש חשמלי הרץ מציוד הקלטה או ציוד אחר בקרבת מקום (איור 6). ללא זבוב על אלקטרודה ההשוואתית, ישירly להתחבר אלקטרודות הקלטה והתייחסות באמצעות טיפה של הפתרון של רינגר ולהיכנס למצב התמסורת על המגבר ידי לחיצה על הכפתור למעלה. אם הרעש הוא הנצפה על אות התמסורת, זה כנראה אומר שהרעש הוא חיצוני להכנה לטוס. ודא שכל ציוד האסדה מעוגן כראוי ושמגיני נייר האלומיניום נמצאים במקום. נסה ניתוק ציוד סמוך כדי לראות אם הרעש מתבטל, או להגן על רכיבים נוספים. שנית, הרעש עלול להופיע סטוכסטיים (איור 6 ג). במקרה זה, עדיין צריכים להתבצע בשלבים המפורטים ל50/60 רעש הרץ. בנוסף, נסה ניתוק או החלפה של רכיבים שונים של ציוד ההקלטה, במיוחד headstage ו / או מגבר. אם אין רעש הוא ציין כאשר האלקטרודות מחוברות באופן ישיר, המקור סביר הכנת הזבוב עצמו. זה בדרך כלל הפשוט להכנת זבוב חדש להקלטה, מטפלת כדי למזער את הנזק לזבוב. שלישית, הפעלהשל נוירון mechanosensory בתוך Sensillum (6D הדמויות ו6E) אפשר לראות. נוירון mechanosensory יכול להיות מופעל אם Sensillum הוא הסיט או כפוף על פי בקשה של האלקטרודה ההקלטה, או נתקל ביצירת קשר. הקוצים הם בדרך כלל להבחין בין הקוצים chemosensory ידי הדפוס לא סדיר שלהם, שמופיע בדרך כלל מתואם עם ההפרעה מכאנית, לא היישום של גירוי התעורר אצלם. ירי mechanosensory ניתן למזער על ידי יישור האלקטרודה ההקלטה עם Sensillum וקידום בעדינות רק עד יש צורך ליצור קשר עם קצה Sensillum. הרביעית, ספייק סטוכסטיים "מתפוצץ" אפשר לראות, זה נראה דומה לירי עצבי, אך הוא בתדר גבוה ומשרעת, אינו מתואם בתגובה לגירוי. זה בדרך כלל תוצאה של הכנת הזבוב עצמו, ולא מהציוד, ויכול להיות בגלל עצבים שיבשו ידי אלקטרודה ההשוואתית. </ P>
בעיה טכנית נפוצה שלישית היא שההכנה היא ניידת, וגרמה labellum לזוז, מה שהופך את החיבור עם Sensillum קשה. ראשית, ההכנה לטוס עשויה להיות לא יציבה. בדוק שאלקטרודה ההשוואתית ממוקמת כראוי, ולתקן במידת צורך. שנית, את האלקטרודה ההתייחסות עשויה להיות רזה מדי בקצה להחזיק את חוטם ונייח labellum. נסה לשבור את סכום יותר של הקצה לפני ההכנה לטוס. אם זה לא מספיק, להתאים מחדש את ההגדרות חולץ פיפטה לפי צורך כדי לשנות את הצורה של האלקטרודה התייחסות כזו שלהתחדד הוא הדרגתי יותר וקוטרו גדל במעט. שלישית, הזבוב יכול להיות בצורה יוצאת דופן פעיל. לסדר את ההכנה עם זבוב חדש.
לקבלת מידע אלקטרופיזיולוגיה הכללית והדרכה לפתרון בעיות נוספת, עיינו במדריך 30 אקסון.
ישנן מספר מגבלות לשיטת טיפ ההקלטה המפורטים בpublicat זהיון. מגבלה אחת היא שtastant חייב להיות מסיס במים, כפי שהוא מועבר באלקטרודה ההקלטה יחד עם אלקטרוליט. זה מגדיל את הקושי של הקלטה עם תרכובות פחמימנים, אם כי שימוש בממס כמו DMSO עשה כמה הקלטות עם פרומונים אפשריים 4. גישות אלטרנטיביים הן להשתמש באלקטרודה טונגסטן חידדה לבצע הקלטות מבסיס השקע של Sensillum, או להשתמש באלקטרודת זכוכית כדי לבצע הקלטות מהקיר הצדדי של Sensillum, בשניהם tastant מועבר באופן בלתי תלוי את האלקטרודה ההקלטה 26,27. עם זאת, טכניקות אלה הן מאתגרות וקיר בצד הקלטות הן יותר מזיקות לאיבר הטעם. מגבלה נוספת היא כמות הזמן הנדרש כדי להחליף את פתרון tastant (שלב פרוטוקול 3.3), אשר מפחית את התפוקה, ומגבילה את השימוש בפרדיגמות גירוי מסובכים נראות לעתים קרובות בהקלטות חוש הריח. נוירונים קולט התעוררו אצלם מפגינים כמה השתנותבמשרעת שתלויה בתדירות ספייק. תכונה זו יכולה לסבך את ההערכה של זהות עצבית ולהפוך את ספייק המתקדם מיון קשה 25,31-33 יותר. כמו כן, בשל אופייה של שיטת טיפ הקלטה אחד לא יכול להקליט את הירי הבסיסי מייד לפני המסירה של גירוי, כפי שנעשה בדרך כלל בהקלטות חוש הריח. למרות החסרונות הללו, שיטת טיפ ההקלטה כבר השתמשה בהצלחה כדי להבהיר רבים מהעקרונות של קידוד טעם בדרוזופילה ומינים אחרים 8,10,17,19,21-23.
טכניקת הכנת הזבוב המתוארת כאן היא רק אחד גישה אפשרית. בשיטת הכנה זו חוטם הוא קבוע בעמדה מורחבת כדי להקל על קשר של האלקטרודה ההקלטה עם Sensillum של עניין, ואת האלקטרודה ההתייחסות מוכנסת לתוך בעלי החיים. שיטות הכנה אחרות כוללות את ההרכבה של בעלי החיים לכדור פלסטלינה והשימוש ברצועות דקות שלקלטת כדי לתקן את חוטם 34. ואכן, כל עוד הפרמטרים הבסיסיים של ייצוב רקמות ומיקום האלקטרודה התייחסות הם נפגשו, sensilla במקומות אחרים או ממינים שונים ניתן להקליט באותה הדרך. לדוגמא, sensilla הרגל יכולה להיות מוקלט על ידי תיקון מהגוף של זבוב לשקופית מיקרוסקופ מצופה sylgard עם סיכות חרקים בסדר, מעביר את הרגליים מעבר לקצה של הזכוכית מעט 35. זה אפשרי, כדי לספק סוכנים תרופתיים לsensilla באמצעות אלקטרודה ההקלטה לחקור הולכים אותות בתאי עצב קולט התעורר אצלם. זה פשוט משימה של ניסויים כדי לקבוע איזו גישה עובד הכי טוב בשביל התוצאה הרצויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי 1F31DC012985 NRSA predoctoral מענק (לRD) ועל ידי מענקי NIH כדי JC
ברצוננו להודות לד"ר Linnea וייס על הערות מועילות על כתב היד, ד"ר יוסף ריאן לדמויות לעזרה באיסוף, וד"ר פרדריק מריון-סקר לייעוץ טכני מועיל. אנחנו רוצים גם להכיר בהערות מועילות של ארבע ביקורות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
