Summary
Questo protocollo descrive registrazione extracellulare delle possibili azioni di risposta sparati dai neuroni del gusto labellar in Drosophila.
Abstract
La risposta gusto periferico degli insetti può essere potentemente indagato con tecniche elettrofisiologiche. Il metodo qui descritto consente al ricercatore di misurare le risposte gustative direttamente e quantitativamente, riflettendo l'input sensoriale che il sistema nervoso dell'insetto riceve da stimoli di sapore nel suo ambiente. Questo protocollo descrive tutti i passaggi chiave nello svolgimento di questa tecnica. I passaggi critici nel montaggio di un impianto di elettrofisiologia, come la scelta delle attrezzature necessarie e di un ambiente adatto per la registrazione, sono delineati. Abbiamo anche descritto come prepararsi per la registrazione facendo opportuni elettrodi di riferimento e di registrazione, e le soluzioni sapida. Descriviamo in dettaglio il metodo per preparare l'insetto mediante inserimento di un elettrodo di riferimento in vetro al volo per immobilizzare proboscide. Noi mostriamo tracce di impulsi elettrici sparati da neuroni gusto in risposta ad uno zucchero e un composto amaro. Aspetti del protocollo sono tecnicamente impegnativo e includiamo una descrizione dettagliata di alcune sfide tecniche comuni che si possono incontrare, come la mancanza di segnale o rumore eccessivo nel sistema, e le possibili soluzioni. La tecnica ha limitazioni, come l'incapacità di fornire stimoli temporalmente complessi, osservare sfondo cottura immediatamente prima stimolo consegna o usare i composti gusto insolubili in acqua convenientemente. Nonostante questi limiti, questa tecnica (comprese variazioni minori si fa riferimento nel protocollo) è uno standard, procedura ampiamente accettato per la registrazione di risposte neuronali Drosophila al gusto composti.
Introduction
Il senso del gusto permette un insetto per rilevare una vasta gamma di prodotti chimici solubili e svolge un ruolo importante nella accettazione di una sostanza nutriente, o il rifiuto di uno nocivi o tossici. Gusto è anche pensato di svolgere un ruolo nella selezione del partner, attraverso il rilevamento di feromoni 1-5. Queste funzioni importanti e diverse hanno reso il sistema del gusto insetto bersaglio irresistibile di indagine come i sistemi sensoriali traducono stimoli ambientali in output comportamentali rilevanti.
L'unità principale del sistema di gusto Drosophila melanogaster sono i capelli gusto, o sensillum. Le molecole entrano nel sensillum attraverso un poro al suo 2,6 punta. Sensilli si trovano sul labello, le gambe, il margine dell'ala, e la faringe 6. Sul labello, il numero e la posizione dei sensilli è stereotipati. Ci sono tre classi morfologiche dei sensilli basati sulla lunghezza: lungo (L), intermedio (I), e brevi (S ) Sensilli 7,8. Ogni sensillum contiene o due (I-type) o quattro (L e S-type) neuroni recettori gustativi (GRN) 9. Diversi GRN rispondono a diverse categorie di stimoli gusto: amaro, zucchero, sale e osmolarità 7,10 ed esprimono diversi sottoinsiemi di recettori gustativi 8,11-13. Solo io e S-type sensilla contengo amaro-reattiva GRN 8,10. Il progetto GRN al ganglio subesophageal (SOG) e la loro attivazione da molecole sapide viene trasmesso al sistema nervoso centrale superiore per la decodifica, causando una risposta comportamentale 6. Il numero relativamente piccolo di neuroni e la riconducibilità di analisi molecolare e comportamentale rendono il sistema gusto Drosophila un ottimo modello per lo studio di sistemi gustativi in generale. La relativa facilità con cui il sistema può essere manipolato tramite mutazione genetica o il sistema di espressione GAL4-UAS serve anche come uno strumento prezioso 14,15.
ONTENUTO "> Poiché questi sensilla sporgono dalla superficie del labello, fanno ottimi bersagli per elettrofisiologia. lo sparo della GRN può essere monitorato tramite registrazione extracellulare. Storicamente, il metodo di registrazione parete laterale, che utilizza un elettrodo di vetro inserita nel sensillum per registrare l'attività neuronale, 26 è stato utilizzato. Tuttavia, questo metodo è tecnicamente difficile da eseguire, ed è difficile da registrare per lungo da ciascun preparato. Procedimento punta-registrazione, che misura la risposta dei neuroni con un elettrodo che offre allo stesso tempo una sapida, da allora è diventato il metodo di scelta 9,16. Esso è stato utilizzato per studiare il sistema del gusto di Drosophila melanogaster 8,10,17,18 così come un certo numero di altre specie di insetti 19-23. Ha stato notevolmente facilitato dallo sviluppo dell'amplificatore tastePROBE, che ha superato uno dei principali inconvenienti del metodo punta-registrazione compensandola grande differenza di potenziale tra l'elettrodo di riferimento e l'sensillum insetto, permettendo ai potenziali d'azione GRN da registrare senza eccessivo amplificazione o filtraggio 24. Un altro importante sviluppo è stato l'uso di tricholine citrato come elettrolita registrazione 25. TCC sopprime le risposte dal GRN osmolarità sensibile e non stimola il GRN sensibili al sale, rendendo risposte generate dal tastants amaro e zucchero molto più facile da analizzare 25.Qui si descrive come la registrazione punta di Drosophila labellar sensilli è attualmente eseguita in laboratorio Carlson. Questo protocollo spiegherà come stabilire un impianto adatto elettrofisiologia, come preparare al volo, e come eseguire le registrazioni di gusto. Presentiamo anche alcuni dati rappresentativi ottenuti dalla registrazione da sottoinsiemi di Drosophila sensilli, nonché alcuni problemi comuni e le possibili soluzioni che si possono incontrare quando si usa questatecnica.
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Protocol
Il seguente protocollo è conforme a tutte le direttive cura degli animali della Yale University.
1. Reagenti agricole per la preparazione
- Registrazione installazione attrezzature (Figura 1A).
- Scegliere una sala per l'installazione impianto che è libero di ampie variazioni di temperatura o umidità e anche isolata da fonti di rumore elettrico e meccanico, come i frigoriferi e centrifughe.
Figura 1. (A) Presentazione di installazione impianto di registrazione. Stereomicroscopio (a) è montato sulla piattaforma anti-vibrazione (b) portaelettrodo. Riferimento (c) è montato sulla piattaforma opposta headstage (d), tramite micromanipolatori. Un tubo di plastica scarico (e) fornire flusso di aria umidificata diretto alla preparazione mosca è montato anche su tegli piattaforma. Headstage è collegato all'amplificatore (f), che è collegato al sistema di acquisizione digitale (DAS) (g), che è collegato ad un PC (h). (B) Configurazione degli elettrodi e del tubo di scarico:. Elettrodo di riferimento a sinistra, elettrodo di registrazione a destra, e il flusso d'aria tubo di scarico diretto in preparazione fly Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita. - Mount stereomicroscopio al centro del tavolo anti-vibrazione o piattaforma.
- Attaccare micromanipolatori per la preparazione elettrodo di riferimento / insetto e headstage / elettrodo di registrazione rispettivamente a sinistra ea destra del microscopio, utilizzando supporti magnetici.
- Mount presa tubo di plastica in una terza micromanipolatore al retro del microscopio, orientato in modo tale che l'apertura del tubo è puntato verso la posizione di mosca prep (vedere Figura 1B).
- Utilizzando tubi di plastica flessibile, apresa tachimetro tubo di plastica ad una beuta da vuoto parzialmente riempito con acqua. Collegare una piccola pompa acquario a bolla d'aria attraverso l'acqua nel pallone, generando un flusso d'aria umidificata attraverso il tubo plastico scarico verso la mosca.
- Mount fibra ottica sorgente luminosa dal tavolo vibrazione, orientando le uscite per illuminare la preparazione riflettono la luce con un foglio di carta bianca della carta direttamente sotto la preparazione. Accertarsi che la sorgente di luce non poggia sul tavolo. Nota: il vantaggio di riflettere la sorgente di luce su un disco di carta è duplice: migliora il contrasto, rendendo sensilla più facile da visualizzare, e impedisce il riscaldamento del preparato che deriverebbe dalla luce diretta.
- Inserire tastePROBE amplificatore nel sistema di acquisizione digitale (DAS), e la DAS in un personal computer, secondo il manuale fornitore. Collegare piede grilletto pedale e organizzare in area di lavoro. Nota: prese a muro elettricamente isolate per l'amplificatore e DAS sono altamente auspicabilegrado.
- Elettricamente a terra microscopio, micromanipolatori, e la sorgente luminosa per il collegamento di componenti metallici per tavolo con morsetti a coccodrillo e lunghezze di filo elettrico isolato e nastro isolante. Elettricamente a terra piattaforma di metallo collegandosi alla costruzione di terra o DAS, che viene messa a terra tramite spina di alimentazione.
- Installare il software appropriato di acquisizione per la DAS di scelta sul personal computer. Nota: Assicurarsi che i driver di acquisizione digitali sono compatibili con il sistema operativo del PC.
- Configurare l'amplificazione software (10-100x), il filtraggio del segnale (tipicamente un filtro passa-banda Bessel impostato da 100 Hz-3, 000 Hz), e frequenza di campionamento (almeno 10 KHz). Nota: ampiezze di segnale dai neuroni gustative sono tipicamente nel range 0,5-2 mV, per cui la scala di visualizzazione è impostato per facilitare la loro visualizzazione. Nota: Il filtro 100 Hz consente di escludere il rumore elettrico estraneo, tuttavia, cambia la forma delle punte e può fare advanced picco ordinamento more impegnativo. In alternativa, un filtro 1 Hz può essere utilizzato.
- Facoltativamente, una gabbia di Faraday può essere impostato intorno all'intera tavola vibrante. Tuttavia, piccoli fogli di alluminio sono in genere sufficienti per ridurre il rumore generato dall'ambiente esterno o investigatore.
- Scegliere una sala per l'installazione impianto che è libero di ampie variazioni di temperatura o umidità e anche isolata da fonti di rumore elettrico e meccanico, come i frigoriferi e centrifughe.
- Glass elettrodi Preparazione
Elettrodi Figura 2. Riferimento e di registrazione. Fotografie sotto l'ingrandimento di capillari di vetro tirato in elettrodo di riferimento, con (A) e senza (B) punta rotta, e elettrodi di registrazione (C). Barra bianca rappresenta 2 mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.- Tirare il riferimentoelettrodo da un capillare di vetro usando una pipetta strumento estrattore. Nota: Le impostazioni esatte del programma pipetta estrattore possono variare da strumento a strumento. Provare a raggiungere un lungo cono graduale. La dimensione dei pori sulla punta non è fondamentale perché la punta sarà rotto prima preparazione fly (Figure 2A e 2B), tuttavia, assicurarsi che il diametro della lunghezza conica dell'elettrodo è né troppo sottile, che non consente una sufficiente immobilizzazione del labello, né troppo grande, che potrebbe danneggiare i neuroni gustative o rottura delle ghiandole salivari.
- Estrarre l'elettrodo registrazione da un capillare di vetro borosilicato con filamento con uno strumento pipetta estrattore. Cercare di ottenere un cono che è minore di quella dell'elettrodo di riferimento, e un diametro dei pori di circa 10-15 micron (Figura 2C) 28.
- Soluzioni sapida preparazione
- Utilizzare soluzione Ringer Beadle-Ephrussizione (B & E) come elettrolita elettrodo di riferimento. Per fare un litro di B & E, sciogliere 7,5 g di NaCl, 0,35 g di KCl, e 0,279 g di CaCl 2 ∙ 2H 2 O in un litro di acqua ultrapura. Conservare aliquote inferiori a -20 ° C.
- Utilizzare 30 mM soluzione tricholine citrato (TCC) come elettrolita elettrodo di registrazione e solvente per soluzioni sapida 25, se le risposte GRN amaro o zucchero sono da misurare. In alternativa, 1-3 mM soluzione di cloruro di potassio può essere utilizzata se le risposte della cellula acqua devono essere misurate.
- Per rendere le soluzioni sapida, pesare la quantità appropriata di sapida in polvere e aggiungere al TCC per fare uno stock concentrazione iniziale. Usare questo per fare diluizioni seriali di questo stock iniziale per produrre la concentrazione desiderata per il test. Nota: Se tastants non facilmente si dissolvono in acqua, un altro solvente, come etanolo, può essere usato per fare magazzino concentrazione iniziale. Una soluzione di controllo adeguato di TCC e solvente senza sapidadovrebbe essere utilizzato in questo caso.
- Il negozio di aliquote lungo termine a -20 ° C. Memorizzare un aliquota di lavoro di una soluzione sapida a 4 ° C per la registrazione all'uso fino a una settimana, a seconda delle proprietà chimiche del sapida.
2. Drosophila Preparazione
Figura 3. Preparazione di volare per la registrazione. (A) Posizione di inserimento dell'elettrodo di riferimento nel torace dorsale di volare. La freccia bianca indica l'elettrodo di riferimento. (B) la posizione intermedia di elettrodo di riferimento: avanzare attraverso il collo e la testa, non proboscide ancora esteso. (C, D) volare con elettrodo di riferimento in posizione finale con la punta di elettrodo all'interno labello, e proboscidecompletamente esteso. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
- Raccogliere le mosche appena eclosed per la registrazione da culture fly ben curati, cresciute sotto-e temperatura condizioni di umidità controllata, e invecchiare 5-10 giorni in flaconi di coltura fresco prima di registrare.
- Raffreddare piastra microscopio su ghiaccio per 15-30 minuti prima di preparare mosca.
- Backfill elettrodo di riferimento vetro con B & E soluzione con un lungo, plastica sottile ago di 0,5 mm di diametro, ad esempio un ago spinale e siringa da 1 ml e delicatamente toccare eventuali bolle. Rompere piccola quantità di punta fuori con pinze e usare un'azione capillare per tirare fuori tutte le bolle rimanenti con un fazzoletto, osservando sotto microscopio da dissezione.
- Presentazione B & E-riempita elettrodo di riferimento sul filo del porta elettrodi di riferimento, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.
- Aspirare volare in una punta di pipetta P200, utilizzando fly aspiratore incorporatodalla tubazione, maglia e puntale; 29 posto nel secchiello del ghiaccio e freddo per 30-60 sec.
- Rimuovere la piastra microscopio da ghiaccio, eliminare ogni residuo di umidità, e la posizione sotto il microscopio. Battere delicatamente volare fuori punta della pipetta sulla piastra microscopio.
Nota: la mosca dovrebbe essere sufficientemente immobilizzato per manipolare facilmente. - Sotto basso ingrandimento, rimuovere delicatamente le zampe anteriori, con un paio di pinze, mentre si tiene la stalla torace con l'altra coppia di pinze. Posizionare la mosca sul suo lato ventrale, lato dorsale verso l'alto. Nota: essere sempre attenti a non toccare il labello con le pinze in qualsiasi momento durante il processo di preparazione per minimizzare i danni meccanici.
- Tenendo la mosca in posizione con un paio di pinze, inserire l'elettrodo di riferimento alla linea mediana della dorsale posteriore del torace. Un angolo suggerito di entrata è di circa quarantacinque gradi, in direzione della testa (Figura 3A).
- Fissare l'elettrodo di riferimentoe supporto con plastilina in modo che la mosca è visibile sotto il microscopio ad alto ingrandimento. Manovra e l'angolo l'elettrodo di vetro attraverso il collo e la testa, facendo scorrere la mosca nei confronti del titolare elettrodo di riferimento utilizzando due paia di pinze. Nota: Lavorate in fretta, ma senza problemi, è più facile per completare questo passaggio, mentre la mosca è ancora immobilizzata dal freddo (Figura 3B).
- Estendere delicatamente la proboscide con una coppia di pinze, facendo scorrere la mosca ulteriormente l'elettrodo di riferimento vetro, finché la punta dell'elettrodo è all'interno del labello e la proboscide è completamente estesa (figure 3C e 3D). Nota: Fare attenzione a non forare qualsiasi parte del tessuto proboscide o distendere il bordo del labello con l'elettrodo di riferimento, in quanto ciò potrebbe danneggiare il volo e / o sapore neuroni e compromettere la qualità di registrazione.
3. Registrazione da Labellar Sensilla
Figura 4. Registrazione da mosca. (A) labello di preparazione volare sulla sinistra con elettrodo di registrazione in linea di contatto a destra, in alto ingrandimento. (B) elettrodo di registrazione e single sensillum sul labello in contatto, in alto ingrandimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
- Mettere sempre a terra toccando la superficie metallica del tavolo anti-vibrazione o piattaforma prima di toccare qualsiasi apparecchiatura durante il processo di registrazione! Nota: E 'estremamente importante non fornire una carica elettrostatica al headstage come che possono danneggiare i circuiti.
- Sicuro titolare elettrodo di riferimento al micromanipolatore montato sulla tavola un'aria di Recording rig. Posizione un lobo del labello in campo microscopio di vista, in alto ingrandimento (in genere almeno 140X), in linea con il flusso di aria umidificata.
- Accendere il flusso di aria umidificata, computer, DAS, e l'amplificatore. Software di acquisizione Apri.
- Sciacquare e riempire elettrodo di registrazione vetro con sapida desideri.
- Risciacquare elettrodo di registrazione di vetro con acqua ultrapura utilizzando una siringa e tubo di plastica da 28 a tirare piccole quantità di acqua attraverso il tubo almeno dieci volte.
- Sciacquare elettrodo di registrazione con sapida almeno cinque volte. Riempire elettrodo di registrazione di circa un terzo a pieno a metà con sapida e togliere dal tubo. Se ci sono bolle d'aria, toccare per rilasciare o semplicemente riempire l'elettrodo.
- Infilare elettrodo sul filo di argento headstage rapidamente ed uniformemente in modo da non introdurre bolle d'aria.
- Stimolare singolo sensillum con elettrodo di registrazione sapida-riempita.
- Utilizzare il micromanipupressione della bombola per portare l'elettrodo di registrazione allineato sensillum di interesse.
- Premere il pedale per avviare la modalità di acquisizione dell'amplificatore.
- Avanzare l'elettrodo di registrazione con la manopola di regolazione fine della micromanipolatore attenzione fino a quando non entra in contatto con la punta di sensillum e la registrazione comincia.
- Rimuovere l'elettrodo dopo 1-2 sec.
- Ripetere passo 3.5 con altri sensilli, se lo si desidera. Nota: Attendere almeno 1 minuto tra presentazioni alla stessa sensillum. Se la registrazione con un singolo sapida per un periodo prolungato di tempo, la soluzione sapida potrebbe seccarsi e la soluzione nella punta può diventare più concentrato. Questo può essere risolto contattando delicatamente la punta dell'elettrodo di vetro con carta liscia per rimuovere una piccola quantità di liquido per capillarità.
- Per registrare le risposte a un altro sapida, risciacquare e elettrodo di registrazione del carico con il nuovo sapida e ripetere il punto 3.4. Nota: accuratamente sciacquare l'elettrodo tra tastants è absolutely fondamentale per evitare la contaminazione incrociata.
- Salvare i file di dati periodicamente con informazioni di identificazione, come data, genotipo, e tastants. Nota: E 'importante tenere una copia scritta della sapida e dell'identità sensillum di ogni presentazione durante la sessione di registrazione per l'analisi dei dati.
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Representative Results
Figura 5A mostra la risposta di una L sensillum ad uno zucchero, saccarosio. Lo stesso sensillum non risponde ad un composto amaro, berberina. Figura 5B mostra che un tipo I sensillum, che contiene un neurone reattivo amaro, visualizza maggiori picchi di ampiezza in risposta alla berberina, e picchi di ampiezza più piccoli in risposta al saccarosio. L sensilla visualizzare una minima risposta di fondo al controllo solvente, TCC, mentre sensilla visualizzo praticamente alcuna risposta al TCC (Figura 5). Per ulteriori informazioni su sale e acqua risposte di GRN labellar, consultare Hiroi 10.
Figura 5. Tracce rappresentative della wild-type risposte Drosophila labellar (A) L sensillu m risposta al saccarosio 100 mm (SUC), berberina MM 1 (BER), e 30 TCC mm. (B) I sensillar risposta al SUC, BER, e TCC. La freccia indica il manufatto contatto che si verifica all'inizio di ogni registrazione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 6. Rappresentante dei risultati elettrofisiologici non ottimali. (A) completa assenza di segnale (B) 50/60 Hz "rumore" (C) rumore stocastico (D) neurone mechanosensory sparare solo (E) amaro GRN (triangoli aperti) e neurone mechanosensory ( triangoli) riempito entrambi cottura./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Sensilla Labellar variano nella facilità della registrazione a causa delle differenze nella morfologia e l'organizzazione anatomica. A volte un sensillum non risponde ad alcuna tastants, anche uno che è noto per suscitare una risposta positiva. La frequenza con cui ciò si verifica varia a seconda del tipo di sensillum. L sensilla sono più costantemente reattivo e sono relativamente facili da accedere a causa della loro lunghezza. In generale, S sensilli sono sempre reattivo, ma la loro corta lunghezza e la posizione sul labello fare un buon contatto impegnativo. I sensilli si può accedere più facilmente, a seconda dell'angolo del preparato, tuttavia, sono più frequentemente risponde. In qualsiasi preparazione fly, una maggiore proporzione di I sensilli può non rispondere a L o S sensilli. Background genetico può influenzare la consistenza delle risposte gusto pure. Ad esempio, alcune mosche transgeniche possono visualizzare le risposte meno consistenti rispetto wild-type, presumibilmente perché i transgeni influenzano la gesalute nerale della mosca. Abbiamo osservato che w - mosche mutanti sono particolarmente difficili da registrare.
Un problema tecnico comune è la mancanza di segnale, cioè senza picchi si osservano (Figura 6A). In primo luogo, a volte un particolare sensillum può non rispondere, mentre altri di quella stessa classe sullo stesso volo possono rispondere. Secondo, ci potrebbe essere una bolla d'aria nel elettrodo di registrazione o l'elettrodo di riferimento. Se l'elettrodo di registrazione è sospettato, questo può essere risolto semplicemente rimuovendo e ricarica l'elettrodo di vetro, picchiettando delicatamente e controllo sotto ingrandimento per garantire che non siano presenti bolle. Se l'elettrodo di riferimento è sospettato di contenere una bolla d'aria, rifare la preparazione con una nuova mosca è il modo più semplice per risolvere questo problema. Terzo, a volte non possono essere collegati saldamente i fili che trasportano il segnale elettrico. Quarto, occasionalmente il segnale di tensione che è ricevuto può essere superiore o inferiorela gamma l'amplificatore può misurare. Se si utilizza l'amplificatore tastePROBE, verificare se sia la clip verso l'alto o verso il basso la clip spia è accesa. Se la spia di clip up è acceso, spesso rimozione e ricarica l'elettrodo di riferimento in vetro, avendo cura di compilare non oltre la metà e pulire la parte esterna per rimuovere l'umidità risolverà il problema. Umidità all'esterno dell'elettrodo di vetro può effettuare un collegamento elettrico tra la cassa del metallo dell'elettrodo e il filo, che invia il segnale fuori portata dell'amplificatore. Se questo non riesce a risolvere il problema, o la spia di clip in giù sono su, prendere in considerazione i suggerimenti nel successivo paragrafo per combattere disturbi elettrici nel sistema. Quinto, a volte una mosca può morire durante la preparazione o altrimenti non risponde, nonostante l'aspetto sano della preparazione. Condizioni di crescita, quali umidità, temperatura, età, qualità alimentare, e microbiota, nonché un background genetico meno sano potrebbero contribuire a una maggiorepercentuale di mosche "non risponde". Infine, raramente, un pezzo di equipaggiamento può essere non funzionali. Se non è costantemente essere raggiunto segnale e tutte le altre possibilità sono state esaurite, potrebbe essere necessario studiare la funzionalità di ogni pezzo di materiale: headstage, amplificatore, e digitalizzatore. Il modo più semplice per farlo è quello di sostituire un apparecchio con un altro da un impianto che è noto per essere funzionale. Se un solo impianto è presente in un laboratorio, un generatore di segnale può essere utilizzato per verificare la funzionalità dei componenti elettronici.
Un'altra questione tecnica comune è quella di "rumore", che è un segnale osservato che non sembra rappresentare potenziali d'azione neuronali sparati in risposta ad uno stimolo gustativo (Figure 6B-E). In primo luogo, il segnale può derivare da 50/60 Hz rumore elettrico di apparecchi registrazione o altre apparecchiature nelle vicinanze (Figura 6B). Con la no fly sul elettrodo di riferimento, direttoly collegare gli elettrodi di registrazione e di riferimento attraverso una goccia di soluzione di Ringer e accedere alla modalità passthrough sull'amplificatore premendo il tasto up. Se il rumore è osservabile sul segnale passthrough, questo probabilmente significa che il rumore è esterno alla preparazione mosca. Assicurarsi che tutte le apparecchiature rig sia collegata a terra e che gli scudi di latta foglio sono a posto. Provare a scollegare gli apparecchi vicini per vedere se il rumore viene eliminato, o proteggere i componenti aggiuntivi. In secondo luogo, il rumore può apparire stocastico (Figura 6C). In questo caso, i passaggi dettagliati per 50/60 Hz rumore devono ancora essere intraprese. Inoltre, provare a scollegare o sostituire diverse componenti dell'apparecchio di controllo, in particolare la headstage e / o amplificatore. Se nessun rumore si osserva quando gli elettrodi sono collegati direttamente, la sorgente è probabile la preparazione mosca stesso. Di solito è più semplice per preparare una nuova mosca per la registrazione, avendo cura di minimizzare i danni alla mosca. In terzo luogo, l'attivazionedel neurone mechanosensory contenuto nel sensillum possono osservare (Figure 6D e 6E). Il neurone mechanosensory può essere attivato se il sensillum viene deviata o piegato su richiesta del elettrodo di registrazione, o urtato durante il contatto. Le punte sono solitamente distinguibili da picchi chemiosensoriali dal loro irregolare, che di solito appare coordinato con la distruzione meccanica, non l'applicazione di uno stimolo gustativo. Cottura mechanosensory può essere minimizzato allineando l'elettrodo di registrazione con il sensillum e avanzando delicatamente solo quanto è necessario per entrare in contatto con la punta del sensillum. Quarto, stocastico spike "rottura" può osservare, questo sembra simile neuronale, ma è di alta frequenza e ampiezza, non coordinato in risposta ad uno stimolo. Normalmente si ottiene dalla mosca preparazione stessa, non dall'apparecchiatura, e può essere dovuto ad un nervo perturbato dall'elettrodo di riferimento. </ P>
Una terza questione tecnica comune è che la preparazione è mobile, causando il labello a muoversi, il che rende il collegamento con una difficile sensillum. In primo luogo, la preparazione mosca potrebbe essere instabile. Verificare che l'elettrodo di riferimento è posizionata correttamente, e la macchina se necessario. In secondo luogo, l'elettrodo di riferimento può essere troppo sottile alla punta per tenere la proboscide e labello immobile. Prova a rompere una quantità più lungo della punta prima di preparare al volo. Se questo non è sufficiente, regolare nuovamente le impostazioni estrattore pipetta come necessario per cambiare la forma di elettrodo di riferimento in modo tale che il cono è più graduale e il diametro è leggermente aumentata. In terzo luogo, la mosca potrebbe essere insolitamente attivo. Remake della preparazione con una nuova mosca.
Per informazioni elettrofisiologia generale e più orientamento risoluzione dei problemi, fare riferimento alla Guida Axon 30.
Ci sono alcune limitazioni al metodo punta di registrazione descritte in questo publicatione. Una limitazione è che la sapida deve essere solubile in acqua, in condizioni di fornitura nella elettrodo di registrazione con l'elettrolita. Questo aumenta la difficoltà di registrazione con composti idrocarburici, sebbene l'uso di un solvente come DMSO ha fatto qualche registrazione con feromoni possibili 4. Approcci alternativi sono di utilizzare un elettrodo di tungsteno affilato effettuare le registrazioni dalla base della presa del sensillum, o utilizzare un elettrodo di vetro effettuare registrazioni dalla parete laterale del sensillum, in entrambi i quali la sapida viene consegnato indipendentemente l'elettrodo di registrazione 26,27. Tuttavia, queste tecniche sono impegnativi e registrazioni della parete laterale sono più dannosi per l'organo gusto. Un'altra limitazione è la quantità di tempo necessario per scambiare la soluzione sapida (protocollo punto 3.3), che riduce la velocità, e limita l'uso di paradigmi stimolo complicati spesso visto nelle registrazioni olfattivi. Neuroni recettori gustativi mostrano una certa variabilitàin ampiezza che dipende dalla frequenza spike. Questa funzione può complicare la valutazione d'identità neuronale e fare picco advanced classificare più difficile 25,31-33. Inoltre, a causa della natura del metodo punta-registrazione non si può registrare la cottura basale immediatamente prima della consegna di uno stimolo, come viene comunemente fatto in registrazioni olfattivi. Nonostante questi inconvenienti, il metodo di punta di registrazione è stato utilizzato con successo per chiarire molti dei principi di codifica gusto in Drosophila e di altre specie 8,10,17,19,21-23.
La tecnica di preparazione mosca qui descritto è solo un possibile approccio. In questo metodo di preparazione la proboscide è fissato in una posizione estesa per facilitare il contatto dell'elettrodo di registrazione con il sensillum di interesse, e l'elettrodo di riferimento viene inserito nel animale. Altri metodi di preparazione comprendono il montaggio dell'animale ad una palla di plastilina e l'uso di sottili strisce dinastro per fissare la proboscide 34. Infatti, fintanto che incontra i parametri fondamentali di stabilizzazione tessuto e posizionamento degli elettrodi di riferimento, sensilla in altre posizioni o da specie diverse può essere registrato da meno allo stesso modo. Ad esempio, gamba sensilla può essere registrato da fissando il corpo di una mosca un vetrino da microscopio sylgard rivestite con sottili spilli insetti, divaricazione delle gambe dal bordo del vetro leggermente 35. È possibile rilasciare agenti farmacologici per il sensilla tramite l'elettrodo di registrazione per indagare la trasduzione del segnale nei neuroni recettoriali gustative. Si tratta semplicemente di un compito di sperimentazione per determinare quale approccio funziona meglio per il risultato desiderato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un predoctoral 1F31DC012985 sovvenzione NRSA (a RD) e da sovvenzioni NIH per JC
Vorremmo ringraziare il Dott. Linnea Weiss per gli utili commenti sul manoscritto, il dottor Ryan Joseph di aiuto per la compilazione figure, e il dottor Frederic Marion-Poll per utili consigli tecnici. Vorremmo inoltre ringraziare gli utili commenti di quattro utenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
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