Summary
이 프로토콜은 초파리에서 labellar 맛 뉴런에 의해 트리거되는 액션 잠재적 인 반응의 세포 녹음을 설명합니다.
Abstract
곤충의 주변 맛 응답 강력 전기 생리학 기술을 조사 할 수 있습니다. 여기에서 설명하는 방법은 연구자가 곤충 신경계는 환경에서 맛의 자극에서받는 감각 입력을 반영, 직접 정량적으로 미각 반응을 측정 할 수 있습니다. 이 프로토콜은이 기술을 수행하는 모든 주요 단계를 설명합니다. 등 필요한 장비 및 녹음에 적합한 환경의 선택과 같은 전기 생리학 장비를 조립에서 중요한 단계가 묘사되어있다. 우리는 또한 적절한 참조 및 기록 전극을 만들어 녹음을 준비하는 방법에 대해 설명하고, tastant 솔루션을 제공합니다. 우리는 상세히 코를 고정화하기 위해 플라이로 유리 기준 전극을 삽입하여 곤충의 제조에 사용되는 방법을 설명한다. 우리는 설탕과 쓴 화합물에 대한 응답으로 맛의 신경 세포에 의해 해고 전기 자극의 흔적을 보여줍니다. 프로토콜의 측면들은 t 아르으로 말하면 도전과 우리는 신호 또는 시스템의 과도한 소음의 부족, 그리고 잠재적 인 솔루션으로 발생할 수있는 몇 가지 일반적인 기술 과제의 광범위한 설명을 포함. 기술은 시간적으로 복잡한 자극을 전달 배달을 자극 직전에 발사 배경을 관찰하거나, 편리 불용성 맛 화합물을 사용할 수없는 등의 제한 사항이 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, (프로토콜에서 참조하는 약간의 변동 사항을 포함한다)이 기술은 화합물을 맛 초파리 신경 세포의 반응을 기록 광범위하게 허용 절차 표준입니다.
Introduction
맛의 감각은 벌레가 녹는 화학 물질의 광대 한 범위를 감지 할 수 있으며 영양 물질의 수용에 중요한 역할, 또는 유해 독성 하나의 거절을한다. 맛도 페로몬 1-5의 검출을 통해, 친구 선택에 역할을하는 것으로 생각된다. 이 중요하고 다양한 기능 감각 시스템은 환경 신호를 관련 행동 출력으로 변환하는 방법에 곤충 맛 시스템 조사의 강력한 대상 만들었습니다.
초파리의 맛 시스템의 기본 단위는 맛 머리, 또는 sensillum입니다. 분자는 팁 2,6에서 기공을 통해 sensillum을 입력합니다. Sensilla는 labellum, 다리, 날개 마진 및 인두 6에서 찾을 수 있습니다. labellum에서 sensilla의 수와 위치는 틀에 박힌됩니다. 길이 (L), 중간 (I), 짧은 (S : 세 가지 형태의 길이에 따라 sensilla의 클래스가 있습니다 ) 7,8 sensilla. 각 sensillum 두 (I 형) 또는 4 개 (L-및 S-타입) 미각 수용체 뉴런 (GRNs) 9 중 하나가 포함되어 있습니다. 다른 GRNs 맛 자극의 서로 다른 카테고리에 응답 쓴, 설탕, 소금, 삼투압 7,10 및 미각 수용체 8,11-13의 다른 하위 집합을 표현한다. 만 I과 S-타입 sensilla 쓴 응답 GRNs 8,10가 포함되어 있습니다. subesophageal 신경절 (SOG)과 맛의 분자에 의해 자신의 활성화에 GRNs 프로젝트는 행동 반응 6 결과, 디코딩을위한 높은 중추 신경계로 전달된다. 뉴런의 상대적으로 적은 수의 분자 및 행동 분석에 복종 할 의무가 초파리의 맛 시스템 일반적으로 미각 시스템의 조사를위한 훌륭한 모델을합니다. 시스템이 유전 적 돌연변이 또는 GAL4-UAS 발현 시스템을 통해 조작 될 수있는 상대적 용이성은 또한 유용한 도구 14,15로서 기능한다.
이러한 sensilla가 labellum의 표면으로부터 돌출되어 있기 때문에 "ontent> 이들은 전기 생리학에 대한 우수한 표적을 만든다. GRNs의 소성은 세포 외 기록을 사용하여 모니터링 할 수있다. 역사적 삽입 유리 전극을 사용하여 측벽 기록 방법, sensillum 신경 활성을 기록하는, (26)이 사용되었다. 그러나,이 방법을 실시 할 기술적 도전과 롱 각 제제로부터 대해 기록하는 것이 곤란하다. 전극과 뉴런의 응답을 측정 팁 기록 방법, 즉 동시에 tastant을 제공, 이후 선택 9,16의 방법이되고있다. 그것은 초파리 8,10,17,18의 맛 시스템뿐만 아니라 다른 곤충 종의 19 ~ 23의 숫자를 조사하기 위해 활용되고 있습니다. 그것은이 크게 보상하여 팁 기록 방법의 주요 단점 중 하나를 극복 tastePROBE 증폭기의 개발에 의해 촉진 된GRN의 활동 전위가 과도한 증폭 또는 필터링 (24)없이 기록 할 수 있도록 상기 기준 전극 및 곤충 sensillum간에 큰 전위차. 또 다른 중요한 발전은 기록 전해질 (25) 등 tricholine 구연산을 사용했다. TCC는 삼투압에 민감한 GRN에서 반응을 억제하고 25 분석 훨씬 쉽게 쓴 설탕 tastants에 의해 생성 된 응답을하고, 소금에 민감한 GRN를 자극하지 않습니다.여기에서 우리는 초파리 labellar의 sensilla의 팁 녹화가 현재 칼슨 실험실에서 수행되는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 전기 생리학 방법 비행을 준비하는 장비, 방법과 맛 녹음을 수행하는 방법을 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 작업을 사용하는 경우 우리는 또한 초파리 sensilla의 하위 집합뿐만 아니라, 몇 가지 일반적인 문제와 발생할 수있는 잠재적 인 솔루션에서 기록하여 얻은 몇 가지 대표적인 데이터를 제공기술.
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Protocol
다음 프로토콜은 예일 대학의 모든 동물 보호 지침을 준수합니다.
1. 시약 및 장비 제조
- 녹화 장비 설치 (그림 1A).
- 온도 나 습도에 큰 변화의 무료 또한 냉장고, 원심 분리기 등의 전기 및 기계 소음의 원인으로부터 격리 장비 설치를위한 공간을 선택합니다.
그림 1. 녹화 장비 설치의 (A) 개요. 실체 (a)는 미세 조작기를 통해, (b). 기준 전극 홀더 (c)가 headstage (d) 대향 플랫폼 상에 장착되는 진동 방지 플랫폼에 장착된다. 비행 준비에 지시 가습 공기 흐름을 제공하는 아울렛 플라스틱 관 (E)도 t에 장착플랫폼 그. headstage는 PC (h)에 접속되어 디지털 수집 시스템 (DAS) (g)에 접속되는 증폭기 (f)에 접속되어있다. 전극과 출구 관 (B) 구성 :. 기준 왼쪽에 전극, 오른쪽에 기록 전극 및 비행 준비에 직접 공기 흐름 배출 튜브 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 방진 테이블이나 플랫폼의 중심에 마운트 실체.
- 자기 스탠드를 사용하여 각각 현미경의 왼쪽과 오른쪽에 기준 전극 / 곤충 준비와 headstage / 기록 전극 용 미세 조작기를 연결합니다.
- 관 개구가 비행 준비의 위치를 향해 지적되도록 지향 현미경의 후방합니다 (그림 1B 참조)에 대한 제 3의 미세 조작기에있는 마운트 출구 플라스틱 튜브.
- 에서, 유연한 플라스틱 튜브를 사용하여부분적으로 물이 가득 진공 플라스크에 타코미터 출구 플라스틱 튜브. 플라이 향해 출구 플라스틱 튜브를 통해 가습 된 공기 스트림을 생성하는, 플라스크 내의 물을 통해 버블 공기 소형 수족관 펌프를 연결한다.
- 직접 준비 아래 흰색 카드 종이 조각을 통해 빛을 반사하여 준비를 조명 출력을 향하게 진동 테이블로 마운트 광섬유 광원. 광원 테이블에 올려 놓지 않도록하십시오. 참고 : 종이 디스크에 광원을 반영하는 이점은 두 가지이다 : 그것은 시각화 sensilla 더 쉽게, 콘트라스트를 향상하고, 직접 빛으로부터 초래 준비의 가열을 방지합니다.
- 공급 업체의 설명서에 따라, 디지털 수집 시스템 (DAS) 및 개인 컴퓨터에 DAS에 tastePROBE 앰프를 연결합니다. 에 발 페달 트리거를 연결하고 작업 공간에서 준비한다. 참고 : 전기적으로 절연 벽 앰프 용 소켓 및 DAS가 매우한다 desir 있습니다수.
- 전기 악어 클립 및 절연 전선 및 전기 테이프의 길이를 사용하여 테이블에 금속 부품을 연결하여 현미경, 미세 조작기, 광원을 접지. 전기 접지 또는 전원 플러그를 통해 접지 DAS를, 건물에 연결하여 금속 플랫폼을 접지.
- 개인용 컴퓨터에 대한 선택의 DAS에 대한 적절한 수집 소프트웨어를 설치합니다. 참고 : 디지털 획득 드라이버는 PC의 운영 체제와 호환되는지 확인합니다.
- 소프트웨어 증폭 (10-100X)를 구성하고, 신호를 필터링하고 샘플링 레이트 (적어도 10 KHz에서) (전형적 베셀 대역 통과 필터는 100 Hz에서-3, 000 Hz에서 집합). 참고 : 미각 뉴런에서 신호 진폭이 0.5 MV 범위에서 일반적이다, 그래서 디스플레이 스케일이 자신의 시각화를 용이하게하기 위해 설정된다. 참고 : 100 Hz에서 필터는 외부의 전기적 노이즈를 제외하는 데 도움이 있지만, 그것은 스파이크의 모양을 변경하고 고급 스파이크 정렬 MOR을 만들 수 있습니다전자 도전. 대안 적으로, 1 Hz에서 필터가 사용될 수있다.
- 선택적으로, 패러데이 케이지는 전체 진동 테이블 주위에 설정할 수 있습니다. 단, 알루미늄 박의 작은 시트는 일반적으로 외부 환경 또는 조사에 의해 생성 된 소음을 감소시키기에 충분하다.
- 온도 나 습도에 큰 변화의 무료 또한 냉장고, 원심 분리기 등의 전기 및 기계 소음의 원인으로부터 격리 장비 설치를위한 공간을 선택합니다.
- 유리 전극의 제조
그림 2. 참조 및 기록 전극. (A)와, 기준 전극으로 뽑아 유리 모세관의 확대에 따라 깨진 (B) 끝없이 사진 및 기록 전극 (C). 흰색 막대 2 밀리미터를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.- 참조를 당겨피펫 풀러 악기를 사용하여 유리 모세관에서 전극. 참고 : 피펫 풀러 프로그램의 정확한 설정이 기기에서 기기로 변화 할 것이다. 매우 긴 점차적으로 테이퍼를 달성하려고합니다. 그러나, 충분한 허용하지되는, 전극의 테이퍼 길이의 직경도 너무 얇은 것을 확인; 팁 플라이 제조 (도 2A 및 2B) 전에 갈라지기 때문에 끝에 기공 크기는 중요하지 미각 신경을 손상 시키거나 침샘 파열 수 labellum의 고정, 또는 너무 큽니다.
- 피펫 풀러 악기를 사용하여 필라멘트를 가진 붕규산 유리 모세관에서 기록 전극을 당깁니다. 기준 전극의 그것보다 얕고 테이퍼, 약 10-15 μM (도 2c) (28)의 세공 직경을 달성하려고.
- Tastant 솔루션 준비
- 교구 - 에프 뤼 씨 벨소리 솔루션을 사용하여기 (B & E) 기준 전극 전해질로서. B & E 중 하나 리터하려면, 7.5 g의 NaCl, 0.35 g의 KCl, 및 0.279 g의 염화칼슘을 용해 2 ∙ 초순수 중 하나 리터 2H 2 O. -20 ° C에서 작은 분취를 저장
- 쓴 설탕 GRN 응답을 측정 할 경우, 기록 전극 전해질 및 tastant 솔루션 (25)에 대한 용매로 30 ㎜ tricholine 구연산 용액 (TCC)를 사용합니다. 수상 세포의 반응을 측정 할 경우에 대안 적으로, 1-3 mM의 염화칼륨 용액을 사용할 수있다.
- tastant 솔루션을 만들기 위해 분말 형태로 tastant의 적절한 양을 무게와 초기 재고 농도를 만들기 위해 TCC을 추가 할 수 있습니다. 테스트를 원하는 농도를 얻을이 초기 재고에서 시리얼 희석하기 위해 사용합니다. 참고 : tastants은 물에 쉽게 용해되지 않는 경우, 에탄올과 같은 다른 용매가, 초기 재고 농도를 만들기 위해 사용될 수있다. 적절한 제어 TCC의 솔루션과 tastant없이 용매이 경우에 사용되어야한다.
- -20 ° C에서 저장 분량 씩 장기 tastant의 화학적 특성에 따라 최대 일주일 동안 사용을 기록하는 4 ° C에서 tastant 솔루션 중 하나 일 분취 량을 저장합니다.
2. 초파리 준비
그림 3. 녹음 비행의 준비. 파리의 지느러미 가슴에 기준 전극의 (A) 삽입 위치. 흰색 화살표는 기준 전극을 나타냅니다. (B) 기준 전극의 중간 위치 : 목과 머리를 통해 고급, 코가 아직 확장되지 않습니다. (C, D)는 labellum 내부 전극의 끝, 그리고 코와 최종 위치에서 기준 전극으로 비행완전히 확장. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 온도 및 습도 제어 조건에서 재배 잘 유지 플라이 문화에서 기록 새로 eclosed 파리를 수집하고 기록하기 전에 신선한 문화 유리 병 5 ~ 10 일 동안 저희에게를 나이.
- 비행을 준비하기 전에 15 ~ 30 분 동안 얼음에 현미경 판을 풀어.
- 부드럽게 백필 유리 기준 등 척추 바늘과 1 ML의 주사기로 0.5 mm 직경의 긴, 얇은 플라스틱 바늘을 사용하여 B & E 솔루션 전극과는 거품을 누릅니다. 집게를 사용하여 오프 팁 소량의 휴식과 해부 현미경 하에서 관찰, 조직에 남아있는 거품을 그리는 모세관을 사용합니다.
- 슬라이드 B & 공기 방울을 소개 않도록주의하면서, 기준 전극 홀더의 와이어에 기준 전극을 E-채웠다.
- 대기음 내장 플라이 흡인기를 사용하여 P200 피펫 팁으로 비행튜브에서, 메쉬, 피펫 팁, 30 ~ 60 초 동안 얼음 양동이와 냉기에 29 곳.
- 얼음에서 현미경 플레이트를 제거 습기를 닦아 현미경 아래에 위치. 조심스럽게 현미경 판에 피펫 팁의 비행기로 누릅니다.
참고 : 비행 충분히 쉽게 조작 할 고정되어야한다. - 포셉의 다른 쌍의 흉부의 안정을 유지하면서 낮은 배율에서 부드럽게 집게 일쌍으로 앞다리를 제거합니다. 지느러미 쪽이 위로 향의 복부 측면에 파리를 놓습니다. 참고 : 항상 기계적 손상을 최소화하기 위해 준비 과정에서 항상 집게로 labellum에 손이 닿지 않도록주의하십시오.
- 집게 일쌍과 장소에서 비행을 잡고, 후방 등의 흉부의 중간 선에서 기준 전극을 삽입합니다. 엔트리의 제안 각도 헤드 (도 3a)의 방향으로 약 45도이다.
- 기준 electrod 보안파리가 높은 배율의 현미경 아래에 볼 수 있도록 점토와 전자 홀더. 두 쌍의 집게를 이용하여 기준 전극 홀더를 향해 비행을 슬라이딩하여 목과 머리를 통해 유리 전극 책략 및 각도. 참고 : 신속하지만 부드럽게 작동, 비행 여전히 차가운 (그림 3B)에서 고정되는 동안이 단계를 완료하는 것이 더 쉽습니다.
- 더 유리 기준 전극 아래로 비행을 슬라이딩하면서 전극의 끝이 labellum 내부와 코가 완전히 (그림 3C 및 3D)으로 확장 될 때까지 조심스럽게, 집게 일쌍과 코를 확장합니다. 주 : 이것은 플라이를 손상 및 / 또는 뉴런 맛과 기록 품질에 영향을 미칠 수 있으므로, 코 조직의 일부를 천공하거나 기준 전극으로 labellum의 가장자리를 넓히다 않도록주의.
3. Labellar Sensilla에서 기록
고배율에서 오른쪽에있는 연락처에 대한 정렬 된 기록 전극 왼쪽에 비행 준비의 그림 4. 즉석에서 녹음. (A) labellum. (B) 기록 전극과 높은 배율에서 접촉 labellum에 단일 sensillum은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 항상 전 과정을 기록하는 동안 장비를 터치에 진동 방지 테이블 또는 플랫폼의 금속 표면을 만져 접지! 참고 : 그 회로에 손상을 수 headstage에 정전기를 제공하지 않는 매우 중요합니다.
- 미세 조작기에 대한 보안 기준 전극 홀더 recordin의 공기 테이블에 장착G 장비. 높은 배율 (일반적으로 적어도 140X)에서보기의 현미경 분야에서 labellum의 위치 하나 엽, 가습 공기 흐름에 맞춰.
- 가습 공기 흐름, 컴퓨터, DAS, 앰프의 전원을 켭니다. 열기 수집 소프트웨어.
- 린스 원하는 tastant 유리 기록 전극을 입력합니다.
- 튜브 적어도 10 시간을 통해 소량의 물을 끌어 주사기 및 플라스틱 튜브 (28)를 사용하여 초순수 유리 기록 전극을 헹군다.
- tastant으로 5 배 이상을 기록 전극을 씻어. 약 3 분의 1 tastant와 반쯤 전체 기록 전극을 채우고 튜브에서 제거합니다. 기포가있는 경우에, 방출 또는 단순히 전극 리필 탭.
- 공기 방울을 도입하지 않도록 신속하고 원활하게 headstage의 실버 와이어에 전극을 밀어 넣습니다.
- tastant 가득한 기록 전극과 하나의 sensillum을 자극한다.
- micromanipu를 사용그 sensillum에 맞춰 기록 전극을 가지고 lator.
- 앰프의 수집 모드를 실행하기 위해 발 페달을 누릅니다.
- 이 sensillum과 녹음이 시작됩니다의 끝이 닿을 때까지 조심스럽게 미세 조작기의 미세 조절 손잡이로 기록 전극을 사전.
- 1 ~ 2 초 후 전극을 제거합니다.
- 원하는 경우, 다른 sensilla와 단계 5를 반복합니다. 참고 : 같은 sensillum에 프리젠 테이션 사이에 최소 1 분을 기다립니다. 오랜 시간 동안 하나의 tastant로 촬영하면 tastant 솔루션은 건조 할 수 있으며 팁의 솔루션은 더 집중되고있다. 이 부드럽게, 모세관 작용에 의해 소량의 액체를 제거하기 위해 부드러운 종이, 유리 전극의 선단을 접촉시킴으로써 해결할 수있다.
- 다른 tastant에 대한 응답을 기록 씻어 새 tastant와 부하 기록 전극 및 3.4 단계를 반복합니다. 참고 : 철저 tastants 사이의 전극을 헹구는 복근이다교차 오염을 방지하기 위해 olutely 매우 중요합니다.
- 날짜, 유전자형 및 tastants 등의 정보를 식별 주기적으로 데이터 파일을 저장합니다. 참고 : 데이터 분석에 대한 세션을 녹음하는 동안 tastant 각 프리젠 테이션의 sensillum 정체성의 서면 기록을 유지하는 것이 중요합니다.
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Representative Results
그림 (a)는 설탕, 자당 L의 sensillum의 반응을 보여줍니다. 같은 sensillum가 쓴 화합물에 반응하지 않는, 베르베린. 그림 (b)는 쓴 반응 신경 세포를 포함하는 I 형 sensillum는, 베르베린에 대한 응답으로 큰 진폭 스파이크, 자당에 대한 응답으로 작은 진폭 스파이크를 표시 것을 보여줍니다. 내가 TCC 사실상 응답 (그림 5)를 표시하지 sensilla 동안 L은, 용매 제어, TCC에 대한 최소한의 배경 응답을 표시 sensilla. labellar GRNs의 소금과 물을 반응에 대한 자세한 내용은 Hiroi 10을 참조하십시오.
그림 5. 야생형 초파리 labellar 응답의 대표 흔적 (A) L의 sensillu 100 MM의 자당 (SUC), 1 ㎜의 베르베린 (BER), 30 mM의 TCC. (B)에 M 응답 나는 SUC, BER 및 TCC에 대한 응답을 sensillar. 화살촉은 각 기록의 시작 부분에 발생하는 접촉 이슈를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 대표 차선 전기 생리학 결과. (A) 신호의 완전한 부족 (B) 50 / 60 Hz에서 "잡음"(C) 확률 소음 (D) 형 (E) 쓴 GRN (오픈 삼각형)과 mechanosensory 신경을 (발사 mechanosensory 신경 발사 두 삼각형)을 채웠다./ www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Labellar sensilla 인해 형태와 해부학 적 조직의 차이에 따라 기록의 용이성에 따라 다릅니다. 때때로 sensillum은 어떤 tastants에 긍정적 인 반응을 유도하는 것으로 알려져 한 마리도 응답하지 않습니다. 이 문제가 발생하는 빈도는 sensillum 유형에 따라 달라집니다. L의 sensilla 가장 일관되게 응답하는 인해 자신의 길이에 접근하기가 비교적 쉽다. 일반적으로, S의 sensilla는 지속적으로 반응하지만, 자신의 짧은 길이와 labellum에 위치가 좋은 상대가 도전합니다. I는 제제의 각도에 따라,보다 용이하게 액세스 할 수 sensilla 있지만, 그들은 더 자주 응답이다. 주어진 비행 준비에, 나는이 sensilla의 큰 비율은 L 또는 S의 sensilla 이상 응답하지 않을 수 있습니다. 유전 적 배경뿐만 아니라 미 반응의 일관성에 영향을 미칠 수있다. 형질 전환 유전자가 GE에 영향을 미칠 것으로 추정하기 때문에 예를 들어, 일부 형질 전환 초파리는 야생형보다 일관된 응답을 표시 할 수 있습니다파리의 Neral의 건강. 돌연변이 체는 특히에서 기록에 도전하는 - 우리는 w를 관찰했다.
더 스파이크가 (그림 6A)도 발생하지 않습니다 즉, 하나의 일반적인 기술적 인 문제는 신호의 부족이다. 같은 즉석에서 같은 클래스의 다른 사람이 응답 할 수있는 한편, 때로는 하나의 특정 sensillum이 응답하지 않을 수 있습니다. 둘째, 기록 전극이나 기준 전극에 기포가있을 수있다. 기록 전극이 의심되는 경우, 이것은 단순히 제거하고 유리 전극을 보충 가볍게 두드리고 기포가 존재하지 않는 확인하기 위해 배율에서 검사하여 고정 할 수 있습니다. 기준 전극이 새로운 비행으로 준비를 리메이크, 기포를 포함하는 의심되는 경우이 문제를 해결하는 가장 쉬운 방법입니다. 셋째, 때때로 전기 신호를 전달하는 전선이 제대로 연결되지 않을 수 있습니다. 넷째, 때때로 수신되는 전압 신호보다 더 높은, 또는 낮은 일 수있다앰프가 측정 할 수있는 범위. tastePROBE 앰프를 사용하는 경우, 클립 위 또는 표시 등을 클립 하나가 켜져 있는지 확인합니다. 클립까지 표시등이 켜져 있으면 중간 이상하지를 채우기 위해 치료를 복용하고 수분을 제거하기 위해 외부를 닦는 문제를 해결할 수 있지만, 자주 제거하고 유리 기준 전극을 보충. 유리 전극의 외측의 습기는 증폭기의 범위 외의 신호를 전송하는, 전극과 배선의 금속 케이스 사이에 전기 접속을 만들 수있다. 즉, 문제, 또는 클립 아래 표시 등을 해결하지 못할 경우에, 시스템의 전기 노이즈를 방지하기 위해 다음 단락의 제안을 고려하고 있습니다. 다섯째, 때로는 비행 준비 중에 죽거나 준비의 건강한 모습에도 불구하고, 그렇지 않으면 응답하지 수 있습니다. 이러한 습도, 온도, 연령, 음식 품질 및 미생물뿐만 아니라, 덜 건강한 유전 배경으로 성장 조건은 더 올릴 수"응답"파리의 비율. 마지막으로, 거의, 장비의 조각은 작동하지하지 않을 수 있습니다. headstage, 증폭기, 디지타이저 : 신호가 지속적으로 달성되지 않는 모든 다른 가능성이 소진 된 경우, 각 장비의 기능을 조사 할 필요가있다. 이 작업을 수행하는 가장 쉬운 방법은 기능 것으로 알려져 장비에서 다른 장비로의 조각을 교체하는 것입니다. 하나의 장비는 실험실에있는 경우, 신호 생성기는 전자 부품의 기능을 테스트하기 위해 사용될 수있다.
또 다른 일반적인 기술적 인 문제는 미각 자극 (그림 6B-E)에 대한 응답으로 발사 신경 세포의 활동 전위를 나타 내기 위해 표시되지 않습니다 관찰 된 신호 "소음"의입니다. 첫째, 신호는 가까운 기록 장비 또는 다른 장비 (그림 6B)에서 50 / 60 Hz에서 전기 노이즈가 발생할 수 있습니다. 기준 전극에 대한 비행 금지, 직접와LY는 링거액의 방울을 기록 전극과 기준 전극을 연결하고 업 버튼을 눌러 증폭기에 통과 모드로 들어간다. 잡음 통과 신호에 관찰 할 경우,이 가능성 잡음 플라이 제제의 외부에 있다는 것을 의미한다. 모든 장비 장비가 제대로 접지하고 주석 호일 실드가 제자리에 있는지 확인합니다. 소음이 제거되어 있는지, 또는 추가 구성 요소를 보호하기 위해 근처에있는 다른 장치의 플러그를 뽑아보십시오. 둘째, 소음 확률 (그림 6C)를 나타날 수 있습니다. 이 경우, 50 / 60 Hz 노이즈에 대한 세부 단계는 여전히 수행되어야한다. 또한, 녹음 장비의 서로 다른 구성 요소, 특히 headstage 및 / 또는 앰프를 분리 또는 교체하려고합니다. 전극이 직접 연결되어있을 때 소음이 관찰되지 않는 경우, 소스 가능성 플라이 제제 자체이다. 그것은 파리의 손상을 최소화하기 위해주의하면서 녹화를위한 새로운 비행을 준비하는 것이 간단합니다. 셋째, 활성화sensillum에 포함 된 mechanosensory 신경 세포 (그림 6D 및 6E)을 관찰 할 수있다. sensillum이 편향 또는 기록 전극의인가시에 절곡 또는 접촉 동안 범핑 경우 mechanosensory 뉴런이 활성화 될 수있다. 스파이크가 불규칙한 패턴에 의해 화학 감각 스파이크에서 일반적으로 구별 일반적으로 기계적인 중단이 아닌 미각 자극의 응용 프로그램과 함께 조정 나타나는. Mechanosensory 소성 sensillum로 기록 전극을 정렬하고 sensillum의 팁과 접촉하도록 필요한만큼만 작게 부드럽게 전진시킴으로써 최소화 될 수있다. 넷째, "파열"확률 스파이크 관찰 할 수 있으며,이 신경 세포의 발화과 유사하게 나타납니다,하지만, 높은 주파수와 진폭이다, 자극에 대한 응답으로 조정하지. 이것은 통상 기기로부터, 플라이 프렙 자체로부터 결과 및 상기 기준 전극에 의해 방해 신경 때문일 수있다. </ P>
세 번째 일반적인 기술적 인 문제는 자료가 labellum이 sensillum 어려운와 연결을하게하는, 이동하는 원인, 이동 것입니다. 첫째, 비행 준비가 불안정 할 수 있습니다. 기준 전극이 올바른 위치에 있는지 확인하고, 필요한 경우 다시 조정합니다. 둘째, 상기 기준 전극은 코와 labellum의 움직을 보유하는 선단에 너무 얇을 수있다. 비행을 준비하기 전에 끝의 긴 양을 파괴하십시오. 그 부족하다면 기준 전극의 형상을 변경하는 데 필요한, 피펫 풀러 설정 재조정 테이퍼 더 점진적이고 직경이 약간 증가되도록. 셋째, 파리가 비정상적으로 활성화 될 수 있습니다. 새 플라이 준비를 리메이크.
일반 전기 생리학 정보 및 문제 해결에 대한 지침은 축삭 가이드 (30)를 참조하십시오.
이 publicat에 나와있는 팁 기록 방법에 대한 몇 가지 제한 사항이 있습니다이온. 한 가지 제한이 전해질과 함께 기록 전극에 전달로 tastant는, 수용성해야한다는 것입니다. DMSO 같은 용매의 사용이 가능 페로몬 4 일부 녹음을했다하지만 이것은 탄화수소 화합물과 기록의 어려움을 증가시킨다. 대체 접근법 sensillum의 소켓베이스에서 기록을 수행하기 위해 선명 화 텅스텐 전극을 사용하거나 tastant가 기록 전극 중에서 독립적으로 전달되는 둘 다에서 sensillum의 측벽에서 레코딩을 수행하기 위해 유리 전극을 사용하고자 (26, 27). 그러나 이러한 기술은 도전하고 측벽 녹화 맛 기관에 더 해롭다. 또 다른 한계는 처리량을 감소 tastant 용액 (프로토콜 단계 3.3)를 교환하는데 필요한 시간의 양이며, 종종 후각 레코딩 보이는 복잡한 자극 패러다임의 사용을 제한한다. 미각 수용체 뉴런은 약간의 변화를 전시진폭이 스파이크 주파수에 따라 달라집니다. 이 기능은 신경 세포의 정체성의 평가를 복잡하고 고급 스파이크 25,31-33 더 어려워 정렬 할 수 있습니다. 일반적 후각 레코딩 에서처럼 또 때문에 팁 기록 방법의 특성 중 하나는, 직전 자극의 전달에 기초 소성을 기록 할 수 없다. 이러한 단점에도 불구하고, 팁 - 기록 방법은 성공적 초파리 및 다른 종 8,10,17,19,21-23 맛볼 코딩의 많은 원리를 설명하기 위하여 사용되었다.
여기에 설명 비행 준비 기술은 단지 하나의 가능한 방법입니다. 이 제조 방법에서는 코는 또한 sensillum 함께 기록 전극의 접촉을 용이하게하기 위해 연장 된 위치에 고정되고, 기준 전극은 동물에 삽입된다. 기타 제조 방법은 점토의 볼에 동물의 실장과의 얇은 스트립의 사용을 포함코 (34)를 고정하는 테이프. 실제로, 한 조직 안정화 및 기준 전극 배치의 기본 파라미터가 충족되는 한, 다른 지역 또는 다른 종으로부터 sensilla는 거의 같은 방법에서 기록 될 수있다. 예를 들어, 다리 sensilla 약간 35 유리의 가장자리 떨어져 다리 플레잉 미세 곤충 핀 SYLGARD 코팅 된 현미경 슬라이드에 플라이의 신체를 고정함으로써에서 기록 될 수있다. 또한 미각 수용체 뉴런에서 신호 전달을 조사하기 위해 기록 전극을 통해 sensilla에 약리 제제를 전달하는 것이 가능하다. 그것은 단순히 원하는 결과를 위해 가장 적합한 방법을 결정하기위한 실험의 작업입니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 (RD에) NRSA predoctoral 부여 1F31DC012985에 의해 JC에 NIH 보조금에 의해 지원되었다
우리는 도움을 컴파일하는 인물에 대한 원고, 라이언 박사 요셉에 도움이 코멘트 박사 리니 와이즈에게 감사하고, 도움이 기술적 조언 박사 프레드릭 마리온 - 설문 조사 것이다. 우리는 또한 네 개의 검토의 도움 의견을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
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