Summary
Denne protokollen beskriver ekstracellulære opptak av handlings potensielle responser avfyrt av labellar smaks nevroner i Drosophila.
Abstract
Det perifere smak respons av insekter kan være kraftfullt undersøkt med elektrofysiologiske teknikker. Metoden som beskrives her tillater forskeren å måle gustatory svar direkte og kvantitativt, som gjenspeiler den sanseinntrykk at insektet nervesystemet mottar fra smaks stimuli i omgivelsene. Denne protokollen skisserer alle viktige skritt i å utføre denne teknikken. De kritiske trinnene i å sette sammen en elektrofysiologi rigg, som for eksempel valg av nødvendig utstyr og et egnet miljø for opptak, er avgrenset. Vi beskriver også hvordan å forberede for opptak ved å gjøre riktige referanse og opptak elektroder, og smaksmiddel løsninger. Vi beskriver i detalj den metode som brukes for fremstilling av insekt ved innsetting av en glassreferanseelektrode i fly for å immobilisere snabel. Vi viser spor av de elektriske impulser avfyrt av smaksnerveceller i respons til et sukker og en bitter forbindelse. Aspekter ved protokollen er technically utfordrende og vi har en omfattende beskrivelse av noen vanlige tekniske utfordringer som kan oppstå, for eksempel manglende signal eller støy i systemet, og mulige løsninger. Teknikken har begrensninger, slik som manglende evne til å levere timelig komplekse stimuli, observerer bakgrunn avfyring umiddelbart før stimulus levering, eller bruke vannuløselige smaksforbindelser beleilig. Til tross for disse begrensningene, er denne teknikken (inkludert mindre variasjoner referert i protokollen) en standard, bredt akseptert prosedyre for opptak Drosophila nevrale responser å smake forbindelser.
Introduction
Smakssansen gjør at et insekt å oppdage et stort spekter av løselige kjemikalier og spiller en viktig rolle i aksept av et næringsrikt stoff, eller avvisning av en skadelig eller giftig ett. Smak er også antatt å spille en rolle i mate valg, gjennom påvisning av feromoner 1-5. Disse viktige og ulike funksjoner har gjort insekt smak systemet en overbevisende målet for etterforskningen i hvordan sansesystemer sette miljømessige signaler i relevante atferds utganger.
Den primære enhet av Drosophila melanogaster smak system er smaken hår, eller sensillum. Molekyler angi sensillum via en pore på spissen sin 2,6. Sensilla er funnet på labellum, bena, vingen margin, og svelget seks. På labellum, er antallet og plasseringen av sensilla stereotyp. Det er tre klasser av morfologiske sensilla basert på lengde: den lange (L), middels (I) og korte (S ) Sensilla 7,8. Hver sensillum inneholder enten to (I-type) eller fire (L-og S-type) gustatory reseptor nevroner (GRNs) 9. Ulike GRNs svare på ulike kategorier av smaks stimuli: bitter, sukker, salt og osmolaritet 7,10 og uttrykke ulike undergrupper av gustatory reseptorer 8,11-13. Bare jeg og S-type sensilla inneholde bitre-responsive GRNs 8,10. Den GRNs prosjektet til subesophageal ganglion (SOG) og deres aktivering ved smaks molekyler blir videresendt til høyere sentralnervesystemet for dekoding, noe som resulterer i en atferdsmessig respons 6.. Den relativt lite antall nerveceller og amenability til molekylær og atferdsanalyse gjør Drosophila smak systemet en utmerket modell for etterforskningen av gustatory systemer generelt. Den relative enkle som systemet kan manipuleres via genetisk mutasjon eller Gal4-UAS uttrykk systemet fungerer også som et verdifullt verktøy 14,15.
ontent "> Fordi disse sensilla stikker ut fra overflaten av labellum, de er utmerkede mål for elektrofysiologi. avfyring av GRNs kan overvåkes ved bruk av ekstracellulære opptak. Historisk sett har side-veggen opptaksmetode, som bruker en glasselektrode innsatt i sensillum å ta opp neuronal aktivitet, 26 har vært i bruk. Imidlertid er denne fremgangsmåte er teknisk vanskelig å utføre, og det er vanskelig å ta for lang tid fra hvert preparat. Spissen-opptaksmetoden, som måler responsen av nervecellene med en elektrode som samtidig leverer et smaksmiddel, siden blitt metoden for valg 9,16. det har blitt anvendt for å undersøke smak system av Drosophila melanogaster 8,10,17,18, samt en rekke andre insektarter 19-23. har blitt betydelig lettere ved utviklingen av tastePROBE forsterkeren, som overvant én av de store ulempene ved tip-opptaksmetoden ved å kompensere forden store potensialforskjell mellom referanseelektroden og den insekt sensillum, slik at grn aksjonspotensialer som skal tas opp uten overdreven forsterkning eller filtrering 24. En annen viktig utvikling var bruken av tricholine citrate ettersom opptakselektrolytt 25. TCC undertrykker svar fra osmolariteten følsomme GRN og stimulerer ikke salt-følsomme GRN, gjør responser generert av bitter og sukker Tastants mye lettere å analysere 25.Her beskriver vi hvordan tips innspillingen av Drosophila labellar sensilla er for tiden utføres i Carlson laboratoriet. Denne protokollen vil forklare hvordan å etablere en egnet elektrofysiologi rigg, hvordan å forberede fly, og hvordan du utfører smaks innspillinger. Vi presenterer også noen representative data innhentet ved opptak fra undergrupper av Drosophila sensilla, samt noen vanlige problemer og mulige løsninger som kan oppstå ved bruk av denneteknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll i samsvar med alle retningslinjene i Yale University dyr omsorg.
En. Reagenser og utstyr Forberedelse
- Opptaksutstyr oppsett (figur 1A).
- Velg et rom for riggoppsettet som er fritt for store variasjoner i temperatur eller luftfuktighet, og også isolert fra kilder av elektrisk og mekanisk støy, som for eksempel kjøleskap og sentrifuger.
Figur 1. (A) Oversikt over opptaksrigg oppsett. Stereomikroskop (a) er montert på anti-vibrasjonsplattform (b). Referanseelektrodeholderen (c) er montert på plattformen på motsatt side av heads (d), via micromanipulators. En utløps plastrør (e) levering av fuktet luftstrøm rettet mot flue preparatet er også montert på than plattform. Den heads er forbundet med forsterkeren (F), som er koblet til den digitale innsamlingssystem (DAS) (g), som er koblet til en PC (h). (B) Konfigurasjon av elektroder og utløpsrør:. Referanseelektrode til venstre, innspilling elektrode på høyre, og luftstrømmen utløpsrøret rettet mot fly forberedelse Klikk her for å se større bilde. - Mount stereo til sentrum av anti-vibrasjonsbord eller plattform.
- Fest micromanipulators for referanseelektrode / insekt forberedelse og heads / opptak elektrode til venstre og høyre for mikroskop, henholdsvis ved hjelp av magnetiske stands.
- Mount utløp plastrør i en tredje mikromanipulator på baksiden av mikroskopet, orientert slik at røret åpningen peker mot plasseringen av fly prep (se figur 1B).
- Ved hjelp av fleksible plastrør, påtach utløps plastrør til en vakuum-kolbe delvis fylt med vann. Koble et lite akvarium pumpe for å boble luft gjennom vannet i flasken, genererer en fuktet luftstrøm gjennom utløpsplastrøret mot fly.
- Mount fiberoptisk lyskilde av vibrasjonsbord, orientere utgangene for å belyse fremstillingen ved å reflektere lys via et stykke hvitt papir kort rett under fremstillingen. Sørg for at lyskilden ikke hviler på bordet. Merk: fordel for å reflektere lys-kilde på en papir-plate er todelt: det forbedrer kontrast, noe som gjør sensilla lettere å visualisere, og det hindrer oppvarming av blandingen som ville resultere fra direkte lys.
- Plugg tastePROBE forsterkeren i den digitale innsamlingssystem (DAS), og DAS inn i en personlig datamaskin, i henhold til leverandør manual. Plugg fotpedal trigger i og ordne etter arbeidsområde. Merk: elektrisk isolert stikkontakter for forsterkeren og DAS er sterkt ønskeligstand.
- Elektrisk bakken mikroskop, micromanipulators, og lyskilde ved å koble metallkomponenter til tabellen ved hjelp krokodilleklemmer og lengder av isolert elektrisk ledning og elektrisk tape. Elektrisk bakken metall plattform ved å koble til byggegrunn eller DAS, som er jordet gjennom støpselet.
- Installerer hensiktsmessig oppkjøpet programvare for DAS av valget på den personlige datamaskinen. Merk: Sørg for at de digitale oppkjøps drivere er kompatible med operativsystemet på PC-en.
- Konfigurere programvaren forsterkning (10-100x), signalfiltrering (typisk en Bessel båndpassfilter satt fra 100 Hz-3, 000 Hz), og samplingsfrekvens (minst 10 KHz). Merk: signalamplituder fra gustatory nevroner er typisk i 0,5-2 mV range, slik at skjermen skalaen er satt til å lette deres visualisering. Merk: 100 Hz filter bidrar til å ekskludere utenforliggende elektrisk støy, men det forandrer form av pigger og kan gjøre avanserte pigg sortering more utfordrende. Alternativt kan et 1 Hz filter anvendes.
- Eventuelt kan et Faraday-bur settes opp rundt hele vibrasjonsbord. Imidlertid, små ark av aluminiumsfolie er vanligvis tilstrekkelig til å redusere støy som genereres av det ytre miljø, eller undersøker.
- Velg et rom for riggoppsettet som er fritt for store variasjoner i temperatur eller luftfuktighet, og også isolert fra kilder av elektrisk og mekanisk støy, som for eksempel kjøleskap og sentrifuger.
- Glass elektrode Forberedelse
Figur 2. Referanse-og opptakselektroder. Fotografi under forstørrelse av glasskapillærer trukket inn i referanseelektrode, med (A) og uten (B) spiss brytes, og opptak elektrode (C). Hvite søylen representerer 2 mm. Klikk her for å se større bilde.- Trekk referansenelektrode fra et glass kapillær ved hjelp av en pipette avtrekker instrument. Merk: De eksakte innstillinger av pipetten avtrekker programmet vil variere fra instrument til instrument. Prøv å oppnå en svært lang gradvis taper. Den porestørrelse på spissen ikke er avgjørende fordi spissen vil bli brutt før fly preparat (figurene 2A og 2B), men sørge for at diameteren av den koniske lengde av elektroden er verken er for tynt, noe som ikke vil gi rom for tilstrekkelig immobilisering av labellum, og heller ikke for stor, noe som kan skade gustatory nevroner eller briste spyttkjertlene.
- Trekk innspilling elektrode fra en borsilikatglass kapillær med filament ved hjelp av en pipette avtrekker instrument. Prøv å oppnå en konus som er grunnere enn den til referanse-elektroden, og en porediameter på omtrent 10-15 mikrometer (figur 2C) 28.
- Smaksmiddel løsninger forberedelse
- Bruk Beadle-Ephrussi Ringer løsningsjon (B-E) som referanseelektrode elektrolytten. For at en liter av B & E, oppløses 7,5 g NaCl, 0,35 g KCl, og 0,279 g CaCl 2 ∙ 2H 2 O i en liter ultrarent vann. Lagre mindre alikvoter ved -20 ° C.
- Bruk 30 mM tricholine citrat-løsning (TCC) som opptakselektrode elektrolytten og oppløsningsmiddel for smaksmiddel løsninger 25, hvis bitre eller sukker GRN responser skal måles. Alternativt kan 1-3 mM kaliumklorid-løsning benyttes dersom responsene til vanncellen skal måles.
- For å gjøre smaksmiddel løsninger, veie passende mengde smaksmiddel i pulverform og legge til TCC å foreta en innledende lager konsentrasjon. Bruk av dette for å lage seriefortynninger fra denne første lager for å gi den ønskede konsentrasjon for testing. Merk: Hvis Tastants ikke lett oppløses i vann, et annet løsningsmiddel, slik som etanol, kan anvendes for å gjøre utgangslager konsentrasjon. En passende kontroll løsning av TCC og væske uten smaksmiddelskal brukes i dette tilfellet.
- Lagre alikvoter lang sikt ved -20 ° C. Oppbevar en arbeider alikvot av et smaksmiddel-løsning ved 4 ° C for å ta opp bruk i opp til en uke, avhengig av kjemiske egenskaper for smaksmiddel.
2. Drosophila Forberedelse
Figur 3. Utarbeidelse av fly for opptak. (A) Insertion stilling referanseelektrode i dorsal thorax av fly. Den hvite pilen angir referanseelektrode. (B) Mellomposisjon av referanseelektrode: Avansert gjennom halsen og hodet, ikke snabel ennå utvidet. (C, D) Fly med referanseelektrode i sluttstilling med spissen av elektroden inne labellum og proboscishelt ut. Klikk her for å se større bilde.
- Samle nylig eclosed fluer for opptak fra godt vedlikeholdte fly kulturer, dyrket under temperatur-og fuktighetskontrollerte forhold, og alder dem 5-10 dager i friske kultur ampuller før opptak.
- Chill mikroskop plate på is i 15-30 min før du forbereder fly.
- Tilbakefylling glass referanseelektrode med B & E-løsning ved hjelp av en lang, tynn plast nål av 0,5 mm diameter, for eksempel en spinal p og 1 ml sprøyte og banke forsiktig ut eventuelle bobler. Bryt liten mengde tips av med pinsett og bruke Kapillarkrefter å trekke ut alle gjenværende bobler med en vev, observere henhold dissekere mikroskop.
- Slide B & E-fylt referanseelektrode på ledningen referanseelektrodeholder, tar seg ikke å innføre luftbobler.
- Sug fly inn i en P200 pipette spissen, bruker fly vifte innefra slangen, mesh, og pipette spissen; 29 plass i isen bøtte og chill i 30-60 sek.
- Fjern mikroskop plate fra isen, tørk av fuktighet, og posisjon under mikroskop. Banke forsiktig på fly ut av pipettespissen på mikroskop plate.
Merk: flua bør være tilstrekkelig immobilisert å manipulere enkelt. - Under lav forstørrelse, forsiktig fjerne forbena med en pinsett, mens du holder thorax stabil med den andre pinsett. Plasser flue på sin ventral side, ryggsiden opp. Merk: Vær alltid nøye med å unngå å berøre labellum med pinsett til enhver tid i løpet av forberedelsesprosessen for å minimalisere mekanisk skade.
- Mens du holder flua på plass med en pinsett, setter referanseelektrode ved midtlinjen av posterior dorsal thorax. En foreslått vinkel på inngangs er ca førtifem grader, i retning av hodet (figur 3A).
- Sikre referansen Electrode holder med modelleringsleire slik at fluen er synlig under mikroskopet ved høy forstørrelse. Manøvrere og vinkle glasselektrode gjennom halsen og hodet, ved å skyve fly mot referanseelektrode holderen bruker to par med tang. Merk: Arbeid raskt, men greit, det er lettere å fullføre dette trinnet, mens fly er fortsatt immobilisert fra kulden (Figur 3B).
- Forsiktig forlenge snabel med en pinsett, mens skyve fly lengre ned på glass-referanseelektroden, inntil spissen av elektroden inne i labellum og snabel er trukket helt ut (fig 3C og 3D). Merk: Pass på å ikke punktere noen del av snabel vev eller distend kanten av labellum med referanseelektrode, da dette kan skade fly og / eller smake nevroner og påvirke opptakskvaliteten.
Tre. Opptak fra Labellar sensilla
Figur 4 Opptak fra fly.. (A) labellum av fly forberedelse på igjen med innspillingen elektrode justert for kontakt på høyre under høy forstørrelse. (B) innspilling elektrode og enkelt sensillum på labellum i kontakt under høy forstørrelse. Klikk her for å se større bilde.
- Alltid jorde deg selv ved å berøre metalloverflaten på anti-vibrasjonsbord eller plattform før du berører noe utstyr under innspillingen prosessen! Merk: Det er svært viktig ikke å levere en statisk ladning til heads som det kan skade kretsene.
- Sikker referanseelektrode holder til micromanipulator montert på luftfortegn recording riggen. Posisjon en flik av labellum i mikroskop synsfelt under høy forstørrelse (typisk minst 140X), og i tråd med luftfuktighet stream.
- Slå på fuktet luftstrøm, datamaskin, DAS, og forsterker. Åpen oppkjøpet programvare.
- Skyll og fyll glasset opptak elektrode med ønsket smaksmiddel.
- Skyll glass opptakselektrode med ultrarent vann ved hjelp av en sprøyte, og plastrøret 28 for å trekke små mengder vann gjennom røret i det minste ti ganger.
- Skyll opptakselektrode med smaksmiddel i det minste fem ganger. Fyll innspillingen elektrode omtrent en tredel til halvveis fullt med smaksmiddel og fjerne fra slangen. Hvis det er luftbobler, trykk for å løsne eller bare fylle på elektroden.
- Skyv elektrode på sølv wire av heads raskt og problemfritt for ikke å innføre luftbobler.
- Stimulere enkelt sensillum med smaksmiddel fylte innspilling elektrode.
- Bruk micromanipulator å la opptaks elektrode på linje med sensillum av interesse.
- Trykk fotpedal for å utløse anskaffelses modus av forsterkeren.
- Advance innspillingen elektroden med den fine bryteren av micromanipulator nøye før den får kontakt med tuppen av sensillum og innspillingen starter.
- Fjern elektroden etter 1-2 sek.
- Gjenta trinn 3.5 med andre sensilla, hvis ønskelig. Merk: Vent minst 1 min i mellom presentasjoner til samme sensillum. Ved innspilling med et enkelt smaksmiddel i en lengre tidsperiode, kan den smaksmiddel-løsning tørke ut og løsningen i spissen kan bli mer konsentrert. Dette kan rettes på ved å forsiktig kontakter spissen av glasselektrode med glatt papir for å fjerne en liten mengde av væske ved kapillærvirkning.
- For å spille inn svarene på en annen smaksmiddel, skyll og lastopptakselektrode med nye smaksmiddel og gjenta trinn 3.4. Merk: Grundig skylling elektroden mellom Tastants er absolutely avgjørende for å unngå krysskontaminering.
- Lagre datafiler med jevne mellomrom med identifiserende informasjon, som dato, genotype, og Tastants. Merk: Det er viktig å holde en skriftlig oversikt over den smaksmiddel og sensillum identiteten til hver presentasjon under opptak sesjon for dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5A viser responsen av en L sensillum til et sukker, sukrose. Det samme sensillum ikke svare på en bitter sammensatte, viser berberin. Figur 5B at en jeg typen sensillum, som inneholder en bitter responsive nevron, viser større amplitude toppene i respons til berberine, og mindre amplitude toppene i respons til sukrose. L sensilla viser en minimal bakgrunns respons til det løsningsmiddel-kontroll, TCC, mens jeg sensilla viser praktisk talt ingen reaksjon TCC (figur 5). For mer informasjon om salt og vann svar av labellar GRNs henvises til Hiroi 10.
Figur 5. Representative spor av vill type Drosophila labellar svar (A) L sensillu m respons til 100 mM sukrose (SUC), 1 mM berberin (BER), og 30 mM TCC. (B) I sensillar respons på SUC, BER, og TCC. Pilspissen indikerer kontakt gjenstand som skjer i begynnelsen av hvert opptak. Klikk her for å se større bilde.
Figur 6. Representative suboptimale elektrofysiologiske resultater. (A) fullstendig mangel på signal (B) 50/60 Hz "støy" (C) stokastisk støy (D) mechanosensory nevron skyte alene (E) bitter GRN (åpne trekanter) og mechanosensory nevron ( fylt trekanter) både avfyring./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Labellar sensilla varierer i den enkle opptak på grunn av forskjeller i morfologi og anatomisk organisasjon. Noen ganger kan en sensillum ikke svare på eventuelle Tastants, selv en som er kjent for å lokke fram en positiv respons. Hvor ofte dette skjer varierer avhengig sensillum type. L sensilla er mest konsistent følsomme og er relativt lett å åpne på grunn av deres lengde. Generelt, S sensilla er konsekvent responsive, men deres korte lengde og posisjon på labellum får god kontakt utfordrende. I sensilla kan nås lettere, avhengig av vinkelen av blandingen, men de er mer hyppig ikke svarer. På en gitt fly forberedelse, kan en større andel av jeg sensilla vil respondere enn L eller S sensilla. Genetisk bakgrunn kan påvirke konsistensen av smaks svar også. For eksempel kan noen transgene fluer vise mindre ensartede responser enn vill-type, antagelig fordi transgener påvirke general helse på flua. Vi har observert at w - mutant fluer er spesielt utfordrende å ta opp fra.
En felles teknisk problem er mangel på signal, dvs. ingen pigger er observert (Figur 6A). Først, noen ganger en bestemt sensillum svarer kanskje ikke, mens andre av samme klasse på samme fly kan svare. For det andre, kan det være en luftboble i opptakselektrode eller referanseelektroden. Hvis det er mistanke om innspillingen elektrode, kan dette fikses ved å fjerne og etterfylling av glasselektrode, banke forsiktig og inspisere under forstørrelse for å sikre at ingen bobler. Hvis det er mistanke referenseelektroden å inneholde en luftboble, remaking prep med et nytt fly er den enkleste måten å løse dette problemet. Tredje, noen ganger ledningene som frakter det elektriske signalet kan ikke være sikkert tilkoblet. For det fjerde, av det spenningssignal som blir mottatt, kan være enten høyere eller lavere ennrekkevidden forsterkeren kan måle. Hvis du bruker tastePROBE forsterker, sjekk for å se om enten klippet opp eller klippet ned indikatorlampen lyser. Hvis klippet opp indikatorlampen er på, ofte fjerne og påfylling glasset referanseelektrode, mens du sørger for å fylle ikke mer enn halvveis og tørke ned på utsiden for å fjerne fuktighet vil løse problemet. Fuktighet på utsiden av glass-elektroden kan lage en elektrisk forbindelse mellom metall saken av elektroden og ledningen, sender signalet utenfor rekkevidde av forsterkeren. Hvis det ikke klarer å løse problemet, eller klippet ned indikatorlampen er på, vurdere forslagene i det følgende avsnitt for å bekjempe elektrisk støy i systemet. Femte, noen ganger en flue kan dø under forberedelse eller er ellers ikke svarer til tross for forberedelse er sunt utseende. Vekstbetingelser, slik som fuktighet, temperatur, alder, matkvalitet, og bakterieflora, samt et helsemessig genetisk bakgrunn vil kunne bidra til en høyereAndelen "ikke svarer" fluer. Til slutt, sjelden, kan en del av utstyret være formålsløse. Hvis signalet er konsekvent ikke blir oppnådd, og alle andre muligheter er uttømt, kan det være nødvendig å undersøke funksjonaliteten til hver del av utstyret: heads, forsterker, og digitaliseringskretsen. Den enkleste måten å gjøre dette på er å erstatte en del av utstyret med en annen fra en rigg som er kjent for å være funksjonell. Hvis bare én rigg er til stede i en lab, kan en signal generator brukes til å teste funksjonaliteten til de elektroniske komponentene.
En annen vanlig teknisk problem er at "støy", som er en observert signal som ikke synes å representere neuronal aksjonspotensialer avfyres som reaksjon på en stimulus gustatory (figurene 6B-E). For det første kan signalet resultere fra 50/60 Hz elektrisk støy fra opptaksutstyr eller annet utstyr i nærheten (figur 6B). Med ingen gli på referanseelektroden, direktely koble opptaks-og referanseelektroder gjennom en dråpe Ringers løsning og gå inn i gjennomgangsmodus på forsterkeren ved å trykke på opp-knappen. Hvis støyen er observerbar på gjennomgangssignalet, betyr dette sannsynlig at støyen er ekstern i forhold til den fly preparatet. Sørg for at all rigg utstyr er jordet og at tinn folie skjold er på plass. Prøv å koble fra nærliggende utstyr for å se om støyen forsvinner, eller skjerme flere komponenter. For det andre kan det forekomme støy stokastiske (figur 6C). I dette tilfelle, bør fremgangsmåten beskrevet for 50/60 Hz støy fremdeles bli foretatt. I tillegg prøve å trekke ut eller erstatte ulike komponenter av opptaksutstyr, særlig heads og / eller forsterker. Hvis ingen støy er observert når elektrodene er direkte forbundet, er kilden sannsynlig flue sammensatte produkt. Det er som regel enklest å forberede en ny flue for opptak, ta vare å minimere skader på fly. Tredje, aktiveringav mechanosensory nevron som finnes i sensillum (Tall 6D og 6E) kan observeres. Den mechanosensory nevron kan aktiveres hvis sensillum får forandret retning eller bøyd på begjæring fra den innspillingen elektrode, eller dunket under kontakt. Piggene er vanligvis skilles fra chemosensory toppene av deres uregelmessige mønster, som vises vanligvis samordnet med den mekaniske avbrudd, ikke anvendelsen av en gustatory stimulus. Mechanosensory avfyring kan minimeres ved å justere opptaks elektroden med sensillum og fremme forsiktig bare så langt det er nødvendig for å få kontakt med tuppen av sensillum. For det fjerde kan stokastisk spike "bursting" observeres, og dette synes lik neuronal avfyring, men er av høy frekvens og amplitude, ikke koordinert respons på en stimulus. Dette resulterer vanligvis fra fly prep seg selv, og ikke fra utstyret, og kan skyldes en nerve avbrutt av referanse-elektroden. </ P>
En tredje felles teknisk problem er at preparatet er mobile, slik at labellum å bevege seg, noe som gjør tilkobling med en sensillum vanskelig. For det første kan flue preparatet være ustabil. Kontroller at referanseelektroden er plassert korrekt, og justere om nødvendig. For det andre kan referanseelektroden være for tynn på spissen for å holde proboscis og labellum immobile. Prøv å bryte av en lengre mengden spissen før forbereder fly. Hvis det ikke er tilstrekkelig, omstille pipetteendene avtrekker innstillinger etter behov for å endre formen på referanseelektrode slik at den taper er mer gradvis og diameteren er litt økt. For det tredje kan fly være uvanlig aktiv. Remake forberedelse med et nytt fly.
For generell informasjon elektrofysiologi og mer feilsøking veiledning, se Axon Guide 30.
Det er noen begrensninger i tip-opptaksmetode som er skissert i denne publication. En begrensning er at smaksmiddel må være vannløselige, slik den leveres i opptakselektrode sammen med elektrolytten. Dette øker vanskeligheten av opptak med hydrokarbonforbindelser, selv om bruken av et løsemiddel som DMSO har gjort noen opptak med feromoner mulige fire. Alternative tilnærminger er å bruke en skjerpet wolframelektrode for å utføre opptak av kontakten bunnen av sensillum, eller bruk av en glasselektrode for å utføre opptak fra sideveggen av sensillum, i begge de smaksmiddel leveres uavhengig av opptakselektrode 26,27. Men disse teknikkene er utfordrende og side-vegg-opptak er mer skadelig for smaken organ. En annen begrensning er hvor mye tid som kreves for å utveksle smaksmiddel løsning (Protokoll steg 3,3), noe som reduserer gjennomstrømningen, og begrenser bruken av kompliserte stimulerings paradigmer ofte sett i olfactory innspillinger. Gustatory reseptor nevroner vise noe variasjoni amplitude som er avhengig av pigg frekvens. Denne funksjonen kan komplisere vurdering av nevronale identitet og gjøre avanserte pigg sortering vanskeligere 25,31-33. I tillegg, på grunn av innholdet av tip-opptaksmetode man ikke kan ta opp basal avfyring umiddelbart før levering av en stimulus, slik som vanligvis gjøres i olfactory innspillinger. Til tross for disse ulempene, har tip-innspilling metoden blitt brukt til å belyse mange av prinsippene i smak koding i Drosophila og andre arter 8,10,17,19,21-23.
Flua forberedelse teknikk skissert her er bare én mulig tilnærming. I denne fremstillingsmetode snabel er festet i en utstrakt stilling for å lette kontakt mellom opptakselektrode med sensillum av interesse, og referanseelektroden er satt inn i dyret. Andre fremstillingsmetoder omfatter montering av dyret til en ball av modelleringsleire og bruk av tynne strimler avtape til å feste snabel 34. Faktisk, så lenge som de grunnleggende parametere av vev stabilisering og referanseelektrodeplassering er oppfylt, sensilla på andre steder eller fra forskjellige arter kan tas opp fra på samme måte. For eksempel, kan leg sensilla tas opp fra ved å feste kroppen av en flue til en Sylgard belagt objektglass med fine insekt pins, utspiling beina utenfor kanten av glasset litt 35. Det er mulig å levere farmakologiske midler til sensilla via opptakselektrode for å undersøke signaltransduksjon i gustatory reseptor-neuroner. Det er rett og slett en oppgave av eksperimentering for å finne ut hvilken metode som fungerer best for det ønskede resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en NRSA predoctoral stipend 1F31DC012985 (til RD) og ved NIH tilskudd til JC
Vi ønsker å takke dr. Linnea Weiss for nyttige kommentarer til manuskriptet, Dr. Ryan Joseph for hjelp kompilere tall, og Dr. Frederic Marion-Poll for nyttig teknisk rådgivning. Vi ønsker også å erkjenne de nyttige kommentarer av fire anmeldelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
