Summary
Этот протокол описывает внеклеточный запись потенциала действия ответов, выпущенных labellar вкусовых нейронов у дрозофилы.
Abstract
Периферийное вкус реакция насекомых может быть мощно исследованы с электрофизиологических методов. Описанный здесь метод позволяет исследователю измерять вкусовые ответов непосредственно и количественно, отражая сенсорной информации, что насекомое нервная система получает от вкусовых раздражителей в окружающей среде. Этот протокол описывает все основные этапы выполнения этой техники. Критические шаги в сборке в электрофизиологии буровой установки, такие как выделение необходимого оборудования и подходящей среды для записи, очерчены. Мы также описать, как для подготовки к записи путем внесения соответствующих справочных и записи электроды, и tastant решения. Мы подробно описать метод, используемый для приготовления насекомое путем вставки стекла электрода в лету, чтобы обездвижить хоботок. Мы покажем, следы электрических импульсов, выпущенных вкусовых нейронов в ответ на сахар и горькой соединения. Аспекты протокола являются тechnically сложным, и мы включают широкий описание некоторых общих технических проблем, которые могут возникнуть, например, отсутствия сигнала или чрезмерного шума в системе, и потенциальных решений. Метод имеет ограничения, такие как неспособность доставить временно сложные стимулы, наблюдать фон обжига непосредственно перед стимул доставки, или использовать нерастворимые в воде вкусовые соединения удобно. Несмотря на эти ограничения, этот метод (в том числе небольшими вариациями упомянутых в протоколе) является стандартным, широко распространенная операция для записи Drosophila нейронные ответы на вкус соединений.
Introduction
Чувство вкуса позволяет насекомое, чтобы обнаружить широкий спектр растворимых химикатов и играет важную роль в принятии питательного вещества, или отказ от вредных или токсичных один. Вкус также полагают, играет роль в выборе партнера, через обнаружение феромонов 1-5. Эти важные и разнообразные функции сделали насекомое вкус система убедительным цель расследования, как сенсорные системы перевести экологические сигналы в соответствующие поведенческие выходов.
Основной единицей MELANOGASTER вкус системе Drosophila это вкус волосы, или сенсиллы. Молекулы введите сенсиллы через поры на ее наконечника 2,6. Сенсиллы находятся на labellum, ног, края крыла и глотки 6. На labellum, количество и расположение сенсилл стереотипно. Есть три морфологические классы сенсилл на основе длины: длинные (L), промежуточный (Я) и короткие (S ) Сенсилл 7,8. Каждый сенсиллы содержит либо два (I типа) или четыре (L-и S-тип) нейроны вкусовые рецепторов (GRNs) 9. Различные GRNs реагировать на различные категории вкусовых раздражителей: горький, сахар, соль и осмолярность 7,10 и выразить различные подмножества вкусовых рецепторов 8,11-13. Только я и S-типа сенсиллы содержат горькие проблематику GRNs 8,10. Проект GRNs к subesophageal ганглия (SOG) и их активации вкусовых молекул передается с более высокой центральной нервной системы для декодирования, в результате чего поведенческой реакции 6. Относительно небольшое число нейронов и податливость к молекулярному и поведенческого анализа делают вкус система дрозофилы отличная модель для исследования вкусовых систем в целом. Относительная легкость, с которой система может управляться с помощью генетической мутации или системы экспрессии GAL4-UAS также служит в качестве ценного инструмента 14,15.
ontent "> Поскольку эти сенсиллы выступают из поверхности labellum, они делают отличные цели для электрофизиологических. стрельба из GRNs можно контролировать с помощью внеклеточной записи. Исторически сложилось, что способ записи боковой стенки, в которой используется стеклянный электрод, вставленный в сенсиллы записывать нейронную активность, 26 был использован. Однако этот способ технически сложно выполнить, и трудно записать надолго от каждого препарата. Способ зонд-записи, который измеряет реакцию нейронов с электродом, который одновременно обеспечивает tastant, с тех пор стала методом выбора 9,16. Она была использована для исследования вкусовой системы дрозофилы 8,10,17,18 а также ряд других видов насекомых 19-23. Он имеет значительно способствовало развитие усилителя tastePROBE, который преодолел один из главных недостатков метода зонд-записи, компенсируябольшой разности потенциалов между электродом и насекомых сенсиллы, позволяя потенциалы GRN действий должны быть записаны без чрезмерного усиления или фильтрации 24. Другим важным событием стало использование tricholine цитрата в качестве записывающего электролита 25. TCC подавляет ответы от осмолярности чувствительных GRN и не стимулирует чувствительные к соли GRN, что делает ответов, сгенерированные горьких и сахара Tastants гораздо легче анализировать 25.Здесь мы опишем, как наконечник запись Drosophila labellar сенсилл в настоящее время осуществляется в лаборатории Карлсон. Этот протокол будет объяснить, как установить подходящую электрофизиологии Рог, как подготовить муху, и как выполнить вкусовые записи. Мы также представляем некоторые репрезентативные данные, полученные записи с подмножеств Drosophila сенсилл, а также некоторых общих вопросов и потенциальных решений, которые могут возникнуть при использовании этоготехника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол соответствует всем руководящих принципов по уходу за животными в Йельском университете.
1. Реагенты и Подготовка оборудования
- Запись установки оборудования (рис. 1А).
- Выберите место для установки буровой, которая свободна от больших колебаний температуры или влажности, а также изолированы от источников электрических и механических шумов, таких как холодильники и центрифуг.
Рисунок 1. (А) Обзор установки записи буровой установки. Stereomicroscope (а) смонтирован на антивибрационные платформы (б). Электрод держатель (с), установленный на платформе напротив headstage (г), через микроманипуляторов. Выход пластиковая трубка (е) подачу увлажненного поток воздуха, направленный на подготовку летучей также установлен на тон платформа. Headstage подключен к усилителю (F), который подключен к цифровой системы сбора данных (DAS) (г), который подключен к ПК (Н). (В) Конфигурация электродов и выпускной трубы:. Электрода слева, запись электрода справа, и воздушного потока на выходе трубы, направленной на подготовку лету Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение. - Гора стереомикроскоп в центре стола антивибрационной или платформы.
- Прикрепите микроманипуляторами для подготовки электрод / насекомых и headstage / записи электрода слева и справа от микроскопа, соответственно, с использованием магнитных стендов.
- Mount выход пластиковая трубка в третьей микроманипулятором к задней части микроскопа, ориентированных таким образом, что отверстие трубки указал на месте летучей преп (см. рисунок 1b).
- Использование гибкий пластиковый шланг, нана выходе тахометра пластиковая трубка с вакуумным колбу частично заполненной водой. Подключение небольшой аквариум насос к пузырька воздуха через воду в колбе, создавая воздушный поток увлажненного через выпускной пластиковой трубки к лету.
- Гора оптоволоконный источник света со стола вибрации, ориентируя выходы для освещения подготовки, отражая свет через кусок белой карты бумаги непосредственно под подготовки. Убедитесь, что источник света не опирается на стол. Примечание: благо отражает источник света на бумажное диска в два раза: это улучшает контрастность, что делает сенсиллы легче визуализировать, и это предотвращает нагрев подготовке, полученной в результате прямого света.
- Подключите tastePROBE усилитель в цифровой системы сбора (DAS), и DAS в персональном компьютере, в соответствии с инструкцией поставщика. Подключите педаль нажатой и организовать под рабочее пространство. Примечание: электрически изолированные розетки стены для усилителя и DAS очень желательностисостоянии.
- Электрические землю микроскоп, микроманипуляторами и источник света, подключив металлические компоненты для таблицы с помощью крокодил и длины изолированного электрического провода и изоленты. Электрические землю металлическую платформу, подключив к построению земли или DAS, который заземленной через источник питания штекер.
- Установите соответствующее программное обеспечение приобретения для DAS выбора на персональном компьютере. Примечание: Убедитесь, что драйверы цифровые приобретение совместимы с операционной системой на ПК.
- Настройка программного обеспечения усиление (10-100x), фильтрация сигнала (как правило, полосовой фильтр Бесселя установить от 100 Гц-3, 000 Гц) и частоты дискретизации (по крайней мере, 10 кГц). Примечание: амплитуд сигналов от вкусовых нейронов, как правило, в диапазоне 0,5-2 мВ, так что шкала дисплея установлен, чтобы облегчить их визуализацию. Примечание: 100 Гц фильтр позволяет исключить посторонние электрические помехи, однако изменяет форму шипов и может сделать передовые шип сортировки морэ вызов. В качестве альтернативы, 1 Гц фильтр может быть использован.
- По желанию, клетки Фарадея может быть установлен вокруг всей таблицы вибрации. Тем не менее, небольшие листы алюминиевой фольги, как правило, достаточно для снижения шума, генерируемый внешней средой или исследователя.
- Выберите место для установки буровой, которая свободна от больших колебаний температуры или влажности, а также изолированы от источников электрических и механических шумов, таких как холодильники и центрифуг.
- Стеклянный электрод Подготовка
Рисунок 2. Ссылочные записи и электроды. Для съемки при увеличении стеклянных капилляров втягивается в качестве электрода, с (а) и без (B) наконечника нарушена, и записи электродов (C). Белый столбик представляет 2 мм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.- Потяните ссылкуэлектрод из стеклянного капилляра с помощью пипетки съемник инструмент. Примечание: Точные настройки программы пипетки съемник будет варьироваться от прибора к прибору. Попробуйте добиться очень долгое постепенное сужение. Размер пор в наконечнике не важно, потому что кончик будет нарушена перед приготовлением FLY (фиг.2А и 2В), однако, убедитесь, что диаметр конической длине электрода не является ни слишком тонким, что не позволит в течение достаточно иммобилизация labellum, ни слишком большим, что может привести к повреждению вкусовые нейроны или разрыва слюнные железы.
- Потяните записи электрод из боросиликатного стекла капилляра с нити с помощью пипетки съемник инструмент. Попытка достичь конус, который мельче, чем у эталонного электрода и диаметр пор около 10-15 мкм (рис. 2С) 28.
- Подготовка Tastant решения
- Используйте Бидл-Эфрусси звонка Солууравнение (B & E) в качестве электрода сравнения электролита. Чтобы один литр B & E, растворить 7,5 г NaCl, 0,35 г KCl, и 0,279 г CaCl 2 ∙ 2H 2 O в одном литре воды высшей степени очистки. Храните мелкие аликвоты при -20 ° С.
- Используйте 30 мм tricholine цитрат решение (TCC) в качестве записи электрода электролитом и растворитель для tastant решений 25, если горькие или сахара ответы GRN должны быть измерены. В качестве альтернативы, 1-3 мМ раствор хлорида калия можно использовать, если отклики воды клетки должны быть измерены.
- Чтобы tastant решения, взвешивать соответствующее количество tastant в виде порошка и добавить в TCC, чтобы сделать начальную концентрацию акций. Используйте это, чтобы сделать серийные разведения от этого исходного материала для получения желаемой концентрации для тестирования. Примечание: Если Tastants не легко растворяются в воде, другой растворитель, такой как этанол, могут быть использованы, чтобы сделать начальную концентрацию акций. Надлежащий контроль решение TCC и растворителя без tastantдолжны быть использованы в данном случае.
- Храните аликвоты долгосрочная при температуре -20 ° С. Храните один рабочий аликвоты раствора tastant при 4 ° С для записи использовать для до недели, в зависимости от химических свойств tastant.
2. Дрозофилы Подготовка
Рисунок 3. Подготовка лету для записи. (А) Вносимые положение электрода в спинной грудной клетки лету. Белая стрелка указывает на электрод. (В) Промежуточное положение из электрода сравнения: прошли через шею и голову, хоботок еще не продлен. (С, D) Летайте с электродом в конечном положении с кончика электрода внутри labellum и хоботкомполностью выдвинут. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
- Сбор вновь eclosed мух для записи с ухоженными лету культур, выращенных в-и температурных условиях с контролируемой влажностью и возрастом их 5-10 дней в свежих культуры флаконах перед записью.
- Холод микроскопа пластину на льду в течение 15-30 мин перед приготовлением муху.
- Засыпка стекло электрод с B & E раствора с помощью длинной, тонкой пластиковой иглы диаметром 0,5 мм, например, спинного иглы и 1 мл шприц и аккуратно вытряхнуть все пузырьки. Перерыв небольшое количество чаевых от использования щипцов и использовать капиллярное действие, чтобы вытянуть все оставшиеся пузыри с ткани, соблюдая при рассекает микроскопом.
- Презентация B & E заполненные электрод на провода держателя электрода сравнения, заботясь, чтобы не вводить пузырьков воздуха.
- Аспирируйте летать в наводке P200 пипетки, используя летать аспиратор построениз трубы, сетка, и пипетки; 29 место в ведре со льдом и холодом для 30-60 сек.
- Удалить микроскопа пластину из льда, протрите всю влагу, и позиции под микроскопом. Слегка постучите вылететь из пипетки на микроскопа пластины.
Примечание: муха должна быть достаточно иммобилизованных легко манипулировать. - Под малом увеличении, аккуратно удалите передние ноги с одной парой щипцов, удерживая грудной клетки конюшню с другой парой щипцов. Расположите муху на его вентральной стороне, спинной стороной вверх. Примечание: Всегда будьте осторожны, не прикасаясь к labellum пинцетом во все времена в процессе подготовки, чтобы минимизировать механическое повреждение.
- Удерживая муху в месте с одной парой щипцов, вставить электрод в средней линии задней спинной грудной клетки. Предлагаемый угол входа примерно сорок пять градусов, в направлении головы (фиг.3А).
- Закрепите опорный электродэ держатель с пластилином такой, что муха видна под микроскопом при большом увеличении. Маневр и угол стеклянный электрод через шею и голову, сдвинув муху к держателю электрода сравнения использовании двух пар щипцов. Примечание: Работают быстро, но плавно, это проще для завершения этого шага в то время как муха все еще иммобилизованных от холода (рис. 3б).
- Аккуратно расширить хоботок одним парой щипцов, а раздвижные муху дальше опорной стеклянный электрод, пока кончик электрода не находится внутри labellum и хоботок полностью выдвинут (фигуры 3С и 3D). Примечание: Будьте осторожны, не проколоть любую часть хоботка ткани или разбухают края labellum с электродом, так как это может привести к повреждению муху и / или вкус нейроны и влияет на качество записи.
3. Запись с Labellar сенсилл
Рисунок 4. Запись с лету. (А) labellum подготовки летать на левой с записи электрода выровнены для контакта на право, под большим увеличением. (В) записи электрод и один сенсиллы на labellum в контакте, при большом увеличении. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
- Всегда прикоснувшись рукой к металлической поверхности стола антивибрационной или платформы до касания любого оборудования во время записи! Примечание: Крайне важно не поставить статический заряд на headstage поскольку это может привести к повреждению схемы.
- Безопасный держатель электрода сравнения в микроманипулятора установлен на столе recordin воздухаг установка. Позиция одной доли labellum в микроскоп поле зрения, при большом увеличении (обычно по меньшей мере 140x), и в соответствии с увлажненной воздушного потока.
- Включите увлажненной воздушного потока, компьютер, DAS и усилителя. Открытое программное обеспечение приобретения.
- Промыть и заполнить стеклянную записи электрод с желаемой tastant.
- Промыть стекла регистрирующего электрода с сверхчистой воды с помощью шприца и пластиковую трубку 28 тянуть небольшие количества воды через трубу, по крайней мере в десять раз.
- Промыть записи электрод с tastant по крайней мере, пять раз. Заполните записи электрод примерно от одной трети до половины полон tastant и удалить из трубы. Если есть пузырьки воздуха, нажмите, чтобы освободить или просто пополнить электрод.
- Авто-электрод на серебряной проволоки из headstage быстро и плавно, чтобы не вводить пузырьки воздуха.
- Стимулировать одного сенсиллы с tastant заполненные записи электрода.
- Используйте micromanipuLATOR довести записи электрод выровненный с сенсиллы интересов.
- Нажмите педаль, чтобы вызвать режим регистрации усилителя.
- Продвижение записи электрод с тонкой ручкой управления из микроманипулятора тщательно, пока не вступает в контакт с кончика сенсиллы и запись начинается.
- Удалить электрод через 1-2 сек.
- Повторите шаг 3,5 с другой сенсилл, если это необходимо. Примечание: Подождите не менее 1 мин между презентаций для той же сенсиллы. При записи с одним tastant в течение длительного периода времени, tastant решение может высохнуть и полученный раствор в наконечнике может стать более концентрированным. Это может быть исправлено путем осторожного контакте с кончиком стеклянного электрода с гладкой бумаги, чтобы удалить небольшое количество жидкости под действием капиллярных сил.
- Для записи ответов на другой tastant, промыть и записи нагрузки электрод с новой tastant и повторите шаг 3,4. Примечание: Тщательно промывки электрода между Tastants является абсolutely решающее значение для предотвращения перекрестного загрязнения.
- Периодически сохраняйте файлы данных с идентификационной информации, такой как дата, генотипа и Tastants. Примечание: Важно сохранять в письменном о tastant и сенсиллы идентичности каждой презентации во время записи сессии для анализа данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5А показывает ответ на L сенсиллы к сахар, сахароза. То же сенсиллы не реагирует на горький соединения, берберин. 5В показывает, что тип я сенсиллы, который содержит горький отзывчивый нейрон, отображает большие шипы амплитуды в ответ на берберин и меньшие шипы амплитуды в ответ на сахарозы. L сенсилл отобразить минимальное фона ответ на контроль растворителя, ТСС, в то время как я не сенсилл отображения практически никакого ответа на TCC (рис. 5). Для получения дополнительной информации о соли и воды ответов labellar GRNs, пожалуйста, обратитесь к Hiroi 10.
Рисунок 5. Представительства следы дикого типа Drosophila labellar ответов (А) L sensillu м в ответ на 100 мМ сахарозы (SUC), 1 мМ берберина (BER) и 30 мМ TCC. (B) I sensillar ответ на SUC, BER и TCC. Стрелка указывает контактную артефакт, который происходит в начале каждой записи. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 6. Представительства субоптимальные электрофизиологические результаты. (A) полное отсутствие сигнала (В) 50/60 Гц "шум" (С) стохастический шум (D) механосенсорных нейрон стрельбы в одиночку (E) горький GRN (открытые треугольники) и механосенсорных нейрон ( заполнено треугольники) и стрельбы./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Labellar сенсиллы различаются по легкости регистрации из-за различий в морфологии и анатомической организации. Иногда сенсиллы не реагировать на любые Tastants, даже тот, который, как известно, вызывают положительную реакцию. Частота, с которой это происходит, зависит от типа сенсиллы. L сенсиллы наиболее последовательно реагировать и относительно легко получить доступ из-за их длины. В общем, S сенсиллы последовательно реагировать, но их короткая длина и положение на labellum сделать хороший контакт сложной задачей. Я сенсилл можно получить более легко, в зависимости от угла препарата, однако, они более часто не отвечает. В любой подготовки лету, большая часть я сенсилл могут быть не отвечает, чем L или S сенсилл. Генетический фон может повлиять на консистенцию вкусовых ответов, а также. Например, некоторые трансгенные мухи могут отображаться менее последовательные ответы, чем дикого типа, по-видимому, потому что трансгены влияют на GEнераль здоровье лету. Мы заметили, что ж - мутантные мухи особенно сложной для записи с.
Один из распространенных техническая проблема является отсутствие сигнала, т.е. нет шипы не наблюдается (рис. 6А). Во-первых, иногда один конкретный сенсиллы могут быть не отвечает, а другие из того же класса на том же ходу может ответить. Во-вторых, может быть воздушный пузырь в электроде записи или электрода сравнения. Если запись электрод подозревается, это можно исправить, просто удалив и заправки стеклянный электрод, аккуратно постукивая и проверки при увеличении чтобы убедиться в отсутствии пузырьков нет. Если электрод предположительно содержит воздушных пузырьков, переделке преп с новым лету это самый простой способ решить эту проблему. В-третьих, иногда провода, несущие электрический сигнал не может быть надежно подключены. В-четвертых, иногда сигнал напряжения поступают может быть выше или ниже, чемдиапазон усилителя можно измерить. При использовании усилителя tastePROBE, убедитесь в том, либо клип вверх или клип вниз индикатор включен. Если клип до индикатор горит, часто снятия и пополнения опорный стеклянный электрод, в то время как забота, чтобы заполнить не более чем на половину и вытирая вниз за пределы для удаления влаги будет решить эту проблему. Влага на внешней стороне стеклянного электрода может сделать электрическое соединение между металлическим корпусом электрода и провода, посылая сигнал вне диапазона усилителя. Если это не удается решить вопрос, или клип вниз индикатор горит, рассмотреть предложения в следующем пункте по борьбе электрический шум в системе. В-пятых, иногда муха может умереть во время подготовки или иным отвечает несмотря здоровый вид подготовки в. Условия роста, такие как влажность, температура, возраста, качества пищевых продуктов и микробиоты, а также менее здорового генетического фона может способствовать болеедоля "не отвечающих" мух. Наконец, редко, часть оборудования может быть нефункциональным. Если сигнал последовательно не были достигнуты и все другие возможности исчерпаны, это может быть необходимо для расследования функциональность каждой единицы оборудования: headstage, усилитель и дигитайзер. Самый простой способ сделать это, чтобы заменить часть оборудования с другим из установки, что, как известно, чтобы быть функциональным. Если только один установка присутствует в лаборатории, генератор сигналов может быть использован для тестирования функциональности электронных компонентов.
Еще одна распространенная техническая проблема в том, что из "шума", который является наблюдаемый сигнал, который, кажется, не представляют нейронные потенциалы действия уволенных в ответ на вкусовой раздражитель (рис. 6B-E). Во-первых, сигнал может быть результатом 50/60 Гц электрических помех от записывающего оборудования или другого оборудования территории (Рисунок 6B). С не муха на электродом, прямойподключить только те записи и электродов сравнения сквозь каплю раствора Рингера и войти в режим сквозной на усилителе, нажав на кнопку вверх. Если шум наблюдается на проходящий сигнал, это, вероятно, означает, что шум является внешним по отношению подготовке лету. Убедитесь, что все оборудование установки правильно заземлен и что фольга щиты находятся на месте. Попробуйте отключить неподалеку оборудование, чтобы увидеть, если шум устраняется, или оградить дополнительные компоненты. Во-вторых, может появиться шум стохастический (рис. 6C). В этом случае, все равно должны быть предприняты шаги, описанные для 50/60 Гц шума. Кроме того, попробуйте отключить или замены различных компонентов записывающего оборудования, в частности, headstage и / или усилителя. Если никакого шума не наблюдается, когда электроды непосредственно связаны, источник, скорее всего, сам препарат муха. Это, как правило проще подготовить новый муху для записи, заботясь, чтобы свести к минимуму ущерб лету. В-третьих, активизацияиз механосенсорных нейрона, содержащейся в сенсиллы (фиг. 6D и 6E), могут быть соблюдены. Механосенсорных нейрон может быть активирована, если сенсиллы отклоняется или вознамерились применения регистрирующего электрода, или ударе во время контакта. Шипы, как правило, отличается от хемосенсорных шипами их нерегулярный, который обычно появляется согласованы с механическим разрушением, а не применение вкусовой раздражитель. Механосенсорных стрельбы можно свести к минимуму, совместив записи электрод с сенсиллы и продвижения мягко лишь постольку, поскольку это необходимо для установления контактов с кончика сенсиллы. В-четвертых, стохастический шип "разрыва" можно наблюдать, это может выглядеть нейронов стрельбы, но имеет высокую частоту и амплитуду, не скоординированы в ответ на стимул. Это обычно приводит к от самого летучей преп, не от оборудования, и может быть связано с нерва нарушается по электрода сравнения. </ Р>
Третья общая техническая проблема в том, что подготовка мобильная, в результате чего labellum двигаться, что делает связь с сенсиллы трудно. Во-первых, подготовка муха может быть нестабильным. Убедитесь, что электрод установлен правильно, и при необходимости отрегулировать. Во-вторых, электрод может быть слишком тонким на кончике провести хоботок и labellum неподвижно. Попробуйте разрывая более длинное количество кончика перед приготовлением муху. Если этого не достаточно, скорректировать настройки съемник пипетки по мере необходимости, чтобы изменить форму электрода таким образом, что конус является более постепенным, а диаметр слегка увеличивается. В-третьих, муха может быть необычайно активны. Ремейк подготовку с новым лету.
Для получения общей информации электрофизиологии и более руководство по устранению неполадок, обратитесь к Axon Руководство 30.
Есть несколько ограничений метода зонд-записи, изложенные в настоящем публикации поионная. Одним из ограничений является то, что tastant должен быть водорастворимым, как он будет доставлен в регистрирующего электрода вместе с электролитом. Это увеличивает сложность записи с углеводородных соединений, хотя использование растворителя, как ДМСО сделал несколько записей с феромонами возможных 4. Альтернативные подходы могут использовать заостренную вольфрамовым электродом для выполнения записи из гнезда основания сенсиллы, или использовать стеклянного электрода для выполнения записи с боковой стенкой сенсиллы, в оба из которых tastant доставляется независимо от регистрирующего электрода 26,27. Однако, эти методы являются сложными и боковых стенок записи являются более вредными для вкуса органа. Другим ограничением является количество времени, необходимого для обмена tastant решение (протокол шаг 3.3), что снижает пропускную способность, и ограничивает использование сложных стимулов парадигм часто видели в обонятельных записей. Вкусовые нейроны рецептора проявляют некоторую изменчивостьпо амплитуде, который зависит от частоты шипа. Эта функция может осложнить оценку нейронов идентичности и сделать предварительный шип сортировки труднее 25,31-33. Кроме того, из-за природы метода зонд-записи один не может записывать базальную стрельбу непосредственно перед доставкой стимула, как это обычно делается в обонятельные записи. Несмотря на эти недостатки, метод зонд-запись была успешно использована для выяснения многие из принципов, вкуса кодирования у дрозофилы и других видов 8,10,17,19,21-23.
Методика подготовки муха изложил здесь является лишь одним из возможных подходов. В этом способе приготовления хобот зафиксирован в выдвинутом положении, чтобы облегчить контакт с регистрирующим электродом с сенсиллы интереса, а электрод вставлен животного. Другие способы получения включают монтаж животного к шаре пластилина и использование тонких полосоклента исправить хоботок 34. В самом деле, при условии, что основные параметры стабилизации тканей и эталонного электрода размещения выполнены, сенсиллы в других местах или из разных видов могут быть записаны с почти таким же способом. Например, нога сенсиллы могут быть записаны с помощью фиксации тело мухи к Sylgard покрытием предметное стекло с тонкой булавки насекомых, распорных ноги от края стекла слегка 35. Это можно поставить фармакологических агентов в сенсилл через регистрирующего электрода исследовать передачу сигнала в вкусовых рецепторов нейронов. Это просто задача экспериментов, чтобы определить, какой подход лучше всего работает для желаемого результата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана НРСА predoctoral гранта 1F31DC012985 (в РД) и за счет грантов НИЗ в JC
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Linnea Вайс за полезные замечания по рукописи, доктор Райан Иосифа за помощью составления фигур, и д-р Фредерик Марион-Опрос для полезной технических консультаций. Мы также хотели бы отметить полезные комментарии четырех авторам.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
