Summary
Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.
Abstract
Test du sort des souches cellulaires dérivés embryonnaires pluripotentes ou dans les protocoles in vitro a conduit à des résultats controversés qui ne reflètent pas nécessairement leur potentiel in vivo. De préférence, ces cellules doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin d'acquérir leur phénotype défini. En outre, la lignée cellulaire de traçage études chez la souris après marquage des cellules avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux est resté la plupart du temps limitée à des embryons de souris à un stade précoce avec les organes encore peu développées. Pour surmonter ces limitations, nous avons conçu des protocoles de micro-injection standard et échographie médiation pour injecter différents agents dans les régions ciblées du cœur dans des embryons de souris à E9.5 et stades de développement. Explants ou embryons embryonnaires sont ensuite cultivées ou à gauche pour développer in utero. Ces agents comprennent des colorants fluorescents, des virus, des shRNA ou des cellules souches progénitrices dérivées de cellules. Nos approches permettent la préservation de la function de l'organe tout en surveillant la migration et le devenir des cellules marquées et / ou injectées. Ces technologies peuvent être étendues à d'autres organes et seront très utiles pour aborder des questions biologiques clés en biologie du développement.
Introduction
Il ya plus d'une décennie, les cellules souches embryonnaires humaines (HuESCs) ont été obtenues à partir de blastocystes humains 1. Depuis lors, ces cellules ont fait l'objet d'un important domaine de recherche qui porte sur des questions non satisfaits en biologie du développement humain. HuESCs ont en outre fourni des espoirs en médecine régénérative. Au cours des dernières années, les cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) ont été générés à partir de cellules somatiques du patient spécifique, en fournissant des modèles de maladie génétique 2. Beaucoup dans les protocoles in vitro pour la différenciation des cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites vers différentes lignées cellulaires, y compris les lignées de coeur 3, ont été rapportés. Les cellules différenciées sont souvent phénotypées par analyse de l'ARN et l'expression de la protéine, une immunocoloration, et / ou dans des tests fonctionnels in vitro. Cependant, les dérivés pluripotent de cellules souches doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin de vérifier si elles acquièrent entièrement la cell sort de leurs homologues embryonnaires et si ils récapitulent la véritable fonction in vivo en réponse à des signaux régionaux. Alors que l'ingénierie tissulaire est prometteuse, elle ne fournit pas encore tous les repères connus et inconnus de la bonne in vivo développement des tissus embryonnaires 4,5.
étiquetage portable avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux dans les embryons, y compris les embryons de souris, ont apporté des informations importantes sur l'origine embryonnaire des lignées de cellules au cours du développement cardiaque 6. Par exemple, la teinture injection dans l'espace péricardique d'embryons de souris ex vivo, suivie par la culture in vitro des coeurs isolés, a été utilisé pour marquer des cellules épicardiques et leurs descendants 7. Cependant, colorant et l'étiquetage des cellules rétroviral ont été principalement appliqué à des embryons de souris au début avec les organes encore peu développés, ou des embryons de poulet, qui sont plus facilement accessibles 8. Une exception est le cerveau, ce qui est plus facile à une cible dans l'embryos 9,10. Une telle approche n'a pas encore été appliquée au coeur de la souris embryonnaire battre.
Pour compléter l'étiquetage direct avec des colorants ou des virus et d'effectuer le suivi dans la lignée des embryons plus avancés de souris de scène et de souris adultes, l'approche de marquage des cellules a été associée à l'analyse de souris transgéniques à l'aide de la technologie Cre / Lox. L'approche Cre / Lox 11 dispose cependant quelques limitations dues à la spécificité spatio-temporelle des régions régulatrices génomiques utilisés pour diriger l'expression de la recombinase, et l'efficacité de la recombinaison Cre / Lox 12. En outre, cette approche ne répond pas pleinement aux questions spécifiques d'acquisition axée sur la migration des cellules du destin cellulaire, car il ne peut marquer un précurseur après activation de la région régulatrice utilisée pour conduire l'expression Cre. Il peut également ne s'applique pas aux embryons humains à des questions éthiques évidentes.
Compte tenu de ces limitations, nous avons conçu une série de nouveaux protocoles pour injecter une variété d'agents de marquage de cellules tels que des colorants fluorescents, des virus, des modulateurs de l'expression génique tels que des shRNA et des vecteurs d'étiquetage de la cellule à base d'ADN, ou des cellules dans l'embryon de souris à E9.5 et des stades ultérieurs de développement dans les régions ciblées de l' cœur.
Les injections d'ADN / cellulaires utilisent une loupe binoculaire et un dispositif de micro-injection simple combinée avec la culture ex vivo embryon jusqu'à 48 h, ou le cœur isolé ou de la culture des explants embryonnaires pendant 48-72 h. Nous présentons également un protocole de micro-injection ultrasons médiation dans les coeurs de souris embryonnaires in utero. Cette technique permet de suivre l'évolution des embryons 13 et permet à long terme de suivi des injectates et / ou des cellules marquées.
Nous avons constaté que ces approches préservent la fonction de l'organe et fournissent un environnement plus représentatif de l'essai in vitro du potentiel des cellules souches. Il offre également la possibilité de suivre la migrationde marqué et / ou injecté des cellules de contrôler leur destin. En fin de compte, ce qui devrait donner une meilleure compréhension de la structuration du tissu régional et processus biologiques essentiels.
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Protocol
1. Préparation
procédures animales
Obtenir l'approbation d'un comité d'éthique animale et suivre les directives institutionnelles pour le travail avec le virus, HuESC et / ou iPSC (le cas échéant) la manipulation de la souris, ainsi que, l'obtention d'embryons de souris, et effectuer une chirurgie de la souris. Pour les accouplements heures, le jour de la fiche est considéré comme le jour embryonnaire (E) 0,5 / 0,5 jours post-coït.
- les aiguilles de microinjection:
Ex utero microinjection, tirer des pipettes en verre (tubes diamètre borosilicate capillaires externes 1,2 mm) à l'aide d'un extracteur de pipette / biseauteur pour obtenir une um de diamètre de pointe interne 1 ou 10 et une forme pointue et conique pointe à injecter de l'ADN ou des cellules, respectivement. Pour les injections d'échographie médiation, l'utilisation adaptée des aiguilles stériles, ayant un diamètre extérieur / intérieur (OD / ID) de 1,14 mm mm/0.53, avec une pointe 50/35 um OD / ID. - Des boîtes de Petri remplies de silicium:
Préparer le silicium, comme décrit dans le manuel. Remplirune boîte de Petri d'un diamètre de verre propre de 60 mm avec une couche d'élastomère d'environ 1 cm. Éviter les bulles d'air. - Instruments:
Gardez tous les instruments chirurgicaux stériles avant et pendant la procédure. - préparation d'ADN:
Ajouter 3 pg d'ADN et 12 pi Opti-MEM dans un tube. Ajouter 3 pi Lipofectamine 2000 et 12 pi Opti-MEM dans un autre tube. Incuber pendant 5 min à température ambiante et mélanger les deux solutions. Utiliser immédiatement. - Préparation des cellules:
Préparer une suspension de 10 6 cellules / ml de DMEM (milieu de Eagle de Dulbecco, haute teneur en glucose et du sérum de rat à 50%). 50 ul de la suspension cellulaire finale est suffisant pour 8 à 10 embryons. - Teindre préparation:
Utilisez le fluorescente verte CDCFDA-SE à 25 mg / ml de DMSO. Préparer 20 aliquotes et conserver à -20 ° C. Diluer 1:100 / 1:200 dans une solution saline stérile ou STP avant l'utilisation. - préparation de virus:
Utilisez une PGK-GFP exprimant lentivirus 3 e génération commercial avec un titre de 10 ~ 9 -10 10 transducing unités / ml de DMEM. Pour la préparation des lentivirus, voir Tiscornia et al. 14 Porter un équipement de protection individuelle et utiliser en toute sécurité et éliminer le virus.
2. Collection de E9.5 et E10.5 embryons pour Ex vivo Injection
- Euthanasier une souris enceinte au jour embryonnaire 9.5 ou 10.5.
- Stériliser la poitrine et l'abdomen de la souris avec 70% d'éthanol.
- Faire une incision médiane ventrale pour ouvrir l'abdomen et récupérer la corne utérine à la température ambiante dans du PBS et le transférer après deux lavages PBS pour un plat de silicone remplie de Pétri avec un milieu M16.
- Epingler la corne utérine avec des épingles insectes à la couche de silicone de sorte que le côté vascularisée de l'utérus est en bas.
- Couper la surface de l'utérus avec une pince fine, et un plafond de la caduque à 1 mm en dessous de la surface.
- Retirer délicatement l'embryon dans le sac jaune en étalant les murs de la caduque.
- Stocker les embryons à 37 °; C en milieu M16 avant l'injection des cellules. Pour l'injection, chaque embryon est transféré dans le moule en silicone remplie de milieu M16 pré-chauffé à 37 ° C.
3. L'ADN cellulaire ou injection sous un stéréomicroscope
- Remplir la pipette de verre à l'arrière avec une seringue Hamilton et secouer la pipette pour éliminer les bulles à la pointe.
- Régler la pipette sur le support de la micro-injection; régler la pression de maintien à 50 (ADN) ou 30 (cellules) hPa, et la pression d'injection de 150 (ADN) et 300 (cellules) hPa. Réglez l'heure de l'injection de 0,2 sec (ADN) ou 0,5 sec (cellules). Ces paramètres peuvent varier légèrement en fonction du type de micro-injecteur et la pipette.
- Pin de l'embryon vers le bas de silicone à travers le sac vitellin, sans toucher l'embryon approprié. Regarder la région du cœur et ouvrir le sac juste au-dessus de cette région.
- Ajouter 4 broches autour de l'embryon pour empêcher tout mouvement pendant l'injection des cellules.
- Utilisation du micromanipulateur (mis à manuel), slowly la position de la pointe de la pipette à un angle de 45 ° au-dessus du péricarde, juste au-dessus de la région du coeur qui doit être injecté (figure 1).
- Déplacer la pipette dans la région d'intérêt et de déclencher l'injection. Prenez la pipette aussi rapidement que possible. Assurez-vous que le coeur est bien battre après injection d'ADN / cellule.
4. L'embryon, le coeur isolé, et Explantation Culture
- Culture des embryons E9.5 à 25% de milieu M2 et du sérum de rat à 75%, supplémenté avec de la pénicilline / streptomycine, pré-chauffé à 37 ° C et oxygénée avec 40% d'O 2.
- Ajouter 2 ml de milieu de culture dans un tube en verre de 25 ml, ajouter doucement l'embryon, et oxygéné avec 40% O 2 avant de visser le bouchon sur le tube. Incuber jusqu'à 36 heures à 37 ° C tout en faisant tourner ou en agitant (30 tours / min).
- Au point de temps désirée (par exemple 24 heures), disséquer le cœur avec soin pinces fines, sans toucher les cœurs, d'abord decapitating les embryons; le cœur est facile à accise en le tirant à l'aide de la voie d'éjection distale.
- Culture du coeur isolé pour un autre 36-48 heures dans du DMEM avec 50% de FCS sur un insert Matrigel revêtu mettre dans une plaque de 12 puits. Voir Dyer et Patterson (2013) pour un protocole amélioré de la culture du cœur 15.
- Faire aucune explant de la région d'intérêt. A titre d'exemple, disséquer le canal auriculo-ventriculaire (AVC) et de la culture pendant 48 h sur le collagène de type 1 de 16 gel.
5. Injection guidée par échographie dans le coeur je n utero
- Configuration de la machine à ultrasons et micro-injecteur:
- Utilisez le système d'échographie à haute résolution avec un transducteur de 40 MHz et installation de micro-injection sur un rail.
- Réglez le volume d'injection sur le micro-injecteur à 69 nl par injection. Consultez le manuel de micro-injection du fabricant pour la programmation du micro-injecteur.
- Préparation de la microiconfiguration njection et injection:
- Placer une micropipette de verre dans le micro-injecteur. Pour assurer l'efficacité d'injection, la première couche du côté intérieur de la pipette avec de l'huile minérale par aspiration jusqu'au volume maximum. Puis éjecter l'huile à nouveau, laissant 1-2 mm d'huile dans l'aiguille.
- Aspirer le produit à injecter jusqu'à volume maximum est atteint. Veillez à ne pas toucher les surfaces avec la pointe de l'aiguille car cela émousser la pointe et faire une injection plus difficile.
- Pour stabiliser la corne utérine contenant les embryons lors de l'injection, utiliser un plat modifié Petri avec un trou au milieu (2,5 cm de diamètre), recouverte d'une membrane de silicone mince avec une petite fente découpée dans le centre, et le positionner au-dessus du site d'incision . Stabiliser la boîte de Pétri sur la table de manipulation de la souris en plaçant 3-4 touffes d'argile sous les bords de la coupelle.
- procédure d'injection:
- Raser l'abdomen d'une souris enceinte (au stade embryonnaire désiré) avant anesthésiesie pour enlever les poils. Traiter l'abdomen avec un agent de l'épilation chimique pour enlever les poils résiduelle et stériliser à 70% d'éthanol.
- Anesthésier une souris enceinte avec de l'oxygène / isoflurane via un masque facial. Utilisation 3-5% d'isoflurane dans de l'oxygène à 100% pendant l'anesthésie initiale, suivie par de 1 à 1,5% pendant le reste de la procédure. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésié en pinçant doucement ses pattes et / ou la queue.
- Placez le décubitus dorsal de la souris sur la table de manipulation de la souris (mis à chauffer à 37 ° C) et couvrir les yeux avec un lubrifiant pour éviter la déshydratation de la cornée.
- Appliquer le gel d'électrode sur les électrodes et collez les pattes aux électrodes pour surveiller le rythme cardiaque, le rythme respiratoire, et l'ECG. Positionner un thermomètre rectal pour surveiller la température du corps.
- Vérifiez d'abord que la souris est enceinte en visualisant et en comptant les embryons par ultrasons. Appliquer un gel à ultrasons sur l'abdomen et positionner la tête de balayage au-dessus de la vessie. Par souci de cohérence, de visualiser la vessie premier,et compter les embryons in gauche et droite cornes utérines, à partir de la position de la vessie. Veiller à ce que les cœurs embryonnaires battent normalement.
- Si la souris est enceinte, placez la boîte de Pétri au-dessus du futur site de l'incision avec de l'argile. Appuyez sur le plat légèrement sur l'abdomen ainsi que le plat est en contact direct.
- Retirer le plat et stériliser à nouveau l'abdomen. Faire une incision médiane ventrale 1,5-2 cm, environ 0,75-1 cm au-dessus du vagin, d'ouvrir l'abdomen et du péritoine. Éviter les blessures aux organes internes.
- Extérioriser la gauche ou la corne utérine droite avec une pince, tirez-le doucement à travers la membrane de silicium du plat, et de stabiliser le plat sur la terre battue de nouveau. Empêcher vaste tirant ou manipulation, car cela peut provoquer des saignements des vaisseaux utérins et la mort prématurée de la femme et / ou d'embryons.
- Compter les embryons de nouveau pour assurer la tenue de dossiers adéquate des embryons qui ont été injectés.
- Appliquer le gel d'ultrasons sur le uterine cornes à l'image du cœur et pour prévenir la déshydratation.
- L'image du premier embryon à injecter. Vérifiez battement normal du coeur embryonnaire et tenir des registres de l'orientation crânio-caudale et gauche-droite de l'embryon. Si nécessaire, repositionner la corne utérine légèrement pour assurer une orientation correcte. Si cela s'avère difficile, passer à la prochaine embryon.
- Perforer l'utérus soigneusement avec l'aiguille de micro-injection pour positionner l'aiguille à un angle de 45 ° au-dessus de l'embryon, légèrement en dehors du péricarde (Figure 3). Pour l'étiquetage des cellules épicardiques, l'image du coeur en vue de quatre chambre et positionner l'aiguille de sorte qu'il pointe vers la gorge auriculo-ventriculaire (Figure 3). Si l'angle doit être ajusté, retirez l'aiguille, et repositionner. Ne pas ajuster l'angle de l'aiguille dans l'utérus, ce qui risque de casser l'aiguille. Éviter de percer d'autres tissus, tels que les membres ou le placenta.
- Déplacer l'aiguillesur la paroi péricardique et percer avec un mouvement doux, mais rapide. En général, il y aura une certaine résistance, mais le déplacement de l'aiguille trop rapide peut provoquer la pointe de l'aiguille à percer le cœur lui-même. La pointe devrait se retrouver dans l'espace péricardique de la gorge auriculo-ventriculaire. Dans le cas d'une hémorragie péricardique, les globules sera visible en tant que motif de neige comme le blanc. Si c'est le cas, arrêtez l'injection de l'embryon et de passer à un autre embryon.
- Injecter le produit à injecter. Injecter au maximum 700 nl dans l'espace péricardique pour éviter l'effet négatif sur le développement de coeurs. Surveillance de l'injection proprement dite par une légère enflure, temporelle du péricarde.
- Après l'injection, retirez l'aiguille et confirment que le produit à injecter peut encore être éjecté de s'assurer que l'aiguille n'a pas été bouché par des fragments de tissus.
- Repositionner la table de manipulation de l'image et injecter la prochaine embryon. Maintenir le nombre d'embryons injectés au maximum à 3-4 (dans une corne utérine) pour empêcherétendu l'anesthésie, pour permettre embryons de contrôle dans la corne utérine opposée, et de veiller à ce que la procédure n'a pas perturbé le développement embryonnaire.
- Après l'injection le nombre désiré d'embryons, éliminer le gel échographique excès et placez doucement la corne utérine dans l'abdomen dans sa position correcte.
- Fermer l'abdomen de la mère à l'aide d'une couche de fil de suture pour le péritoine et les muscles abdominaux, et une seconde couche de fil de suture à la peau.
- Injecter la souris avec la première dose de médicaments contre la douleur. Utilisez une injection de 0,05-0,1 mg / kg buprénorphine 15 minutes avant de mettre fin à l'anesthésie et trois injections supplémentaires avec des intervalles de 12 h.
- Cesser l'anesthésie et surveiller la souris pour la récupération adéquate de la procédure. Maison de la souris enceinte dans une cage individuelle pour la durée souhaitée de suivi.
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Representative Results
En utilisant les protocoles d'injection décrites ci-dessus, les cellules peuvent être marquées et / ou injectées dans le cœur de souris embryonnaires. Comme preuve de concept, plusieurs exemples sont présentés dans lequel le protocole d'injection et ex vivo AVC explant, coeur isolé, ou la culture d'embryons ont été combinées ensemble (figure 1).
La figure 1 montre la préparation de l'embryon avant l'injection des cellules. L'embryon de E9.5 est retiré de son caduque tout en maintenant l'intégrité de la membrane vitelline (Figure 1A). Le sac jaune est ouvert juste au-dessus du cœur (figure 1B). La pipette est approché (figure 1C) et les cellules injectées. Le cœur conserve sa forme (figure 1D) et reste de battre.
Pour répondre à une question biologique plus spécifique en biologie du développement tels que l'épithélium de transition mésenchyme (EMT), une explantation E9.5 AVC a été injecté avec un shARN qui régule à la baisse pour une protéine nécessaire pour la transition de l'endothélium-mésenchymateuse des cellules endocardiques (Figure 2A). L'embryon de contrôle a été injecté avec un squelette vecteur vide. De même, les teintes des cellules pré-valvulaires endothéliales dérivées de cellules exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur de Sox9 ont été injectés dans l'AVC à E10.5, suivie par 48 heures explantée culture cardiaque. Ces cellules acquièrent des marqueurs tels que la périostine EMT similaire aux cellules endocardiques endogènes (figures 2B et 2C).
Ces approches ex vivo sont relativement faciles, mais limités à court terme du suivi (maximum 48-72 h). La procédure d'injection guidée par échographie fournit une approche techniquement plus difficile, mais avec l'option de long terme, même après la naissance, in utero suivi. L'injection in utero de colorant ou des vecteurs viraux pour marquer des cellules dans les régions cardiaques spécifiques est illustrée dans les figures 3A-3 C. Avec cette méthode, le marquage spécifique des cellules épicardiques peut être réalisé avec des colorants fluorescents (figures 3D et 3E) ou virales (figure 3F), et le procédé peut être étendu à des cellules ou des injectates alternatives.
Figure 1 injection de cellules dans le coeur A:... E9.5 embryon dans le sac jaune B: visualisation du coeur après l'ouverture du sac jaune juste au-dessus du cœur. L'encart ci-dessous montre un grossissement du cœur et souligne le canal AV C:. Approche de la pipette vers le AVC D:. Injecté embryon après 48 heures de culture (H = coeur).
. Figure 2 Injection d'un shRNA dans l'AVC d'un embryon de E9.5 qui empêche EMT ex vivo de cellules endocardiques dans un explant cardiaque A:. Du squelette du vecteur de commande ou un shRNA ont été injectés en même temps que dans l'AVC lipotectamine d'un E9.5 embryon de souris; 3 h plus tard, l'AVC a été disséqué et cultivées sur un gel de collagène afin de déclencher EMT de cellules endocardiques. Le shRNA downregulated une protéine qui est nécessaire pour EMT BC:. Teintes cellules valvulaires dérivés de cellules modifiées pour exprimer la GFP sous contrôle du promoteur de Sox9 ont été injectés dans l'AVC d'embryons E10.5. Le cœur a été cultivé pendant 2 jours (B), puis fixées et colorées avec un anticorps anti-périostine (C). L'encart montre un agrandissement de la région AVC.
.. Figure 3 Dans injection in utero A: schéma représentant le dispositif expérimental. La souris est positionné en décubitus dorsal enceinte et une boîte de Pétri avec la membrane de silicone est stabilisée au-dessus du site de l'incision. . 1 = microinjecteur, 2 = transducteur, 3 = boîte de Pétri avec une membrane de silicone, 4 = gel d'échographie, 5 = souris avec des cornes utérines (rouge), 6 = argile Play-Doh, 7 = souris table de traitement B: arrêt sur image d'un film ultrasons (mode M) représentant la position de l'aiguille et le cœur embryonnaire avant l'injection. L'ECG femelle est affiché en bas (vert), et le rythme cardiaque et la respiration en bas à droite (jaune). H = coeur C:. L'image de l'échographie montrant la position de l'aiguille et le cœur embryonnaire lors de l'injection. Encart: la pointe a passé le péricarde, mais ne touchez pas le myocarde, de sorte que l'injectionATE peut être injecté dans l'espace péricardique de la rainure auriculo-ventriculaire. Pointillés noirs marquent les frontières de l'atrium (A) et le ventricule (V) D:. Toute l'image de montage d'un embryon de souris E11.5 montrant une forte fluorescence du colorant dans l'espace péricardique E:. Représentatif d'un E11.5 cœur embryonnaire de la souris montrant le marquage cellulaire péricardique et épicardique avec un colorant fluorescent (CDCFDA-SE, vert) 4 heures après l'injection. Noyaux sont marqués au DAPI (bleu). LA = oreillette gauche, LV = ventricule gauche, RA = oreillette droite, RV = ventricule droit F:. Représentatif d'un coeur de souris embryonnaires E14.5 montrant mosaïque marquage cellulaire épicardique avec lentivirus exprimant la GFP 3 jours après l'injection. Pour confirmer la spécificité de la GFP, la protéine GFP a été également colorées avec un anticorps anti-GFP (en rouge). Noyaux sont marqués au DAPI (bleu).
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Discussion
Les ex vivo protocoles d'injection intra-cardiaques décrits ci-dessus sont conçus pour préserver la fonction myocardique pendant au moins 48 heures à la mi-étape (E9.5-E11.5) des embryons de souris. Ces approches permettent d'injection pour l'injection dans l'espace ciblée de l'ADN ou des cellules. Les quelques exemples présentés dans les figures 1-3 fournissent une preuve de concept pour délimiter ex vivo et in vivo des mécanismes moléculaires des processus de développement qui ont lieu dans les régions cardiaques restreints, tels que les EMT de cellules endocardiques ou épicardique. Plus important encore, ces protocoles prévoient la possibilité de suivre la migration et le devenir des cellules injectées telles que des cellules embryonnaires humaines ou des dérivés de huESC dans un environnement embryonnaire bon, un défi jusqu'à présent non satisfaits. In vivo étiquetage (comme les cellules épicardiques de la figure 3) avec saturation ou limiter les dilutions de colorant ou virus permet la lignée traçage des cellules (sous-) populations sur un court comme à long terme basis, sans avoir besoin de la technologie Cre / lox (bien que la combinaison de ces techniques peut être utile aussi bien).
Plusieurs étapes critiques tandis que l'application de ces protocoles ont été observés. Tout d'abord, les embryons sont très sensibles à la lumière. Il est donc recommandé de pratiquer le protocole d'injection sous un stéréomicroscope de sorte que la procédure peut être réalisée avec une grande reproductibilité et d'efficacité dans les 15 min par embryon. Dans la même ligne, l'ensemble de la procédure d'injection ultrasons médiation doit être effectuée dans les 30 min pour préserver une bonne viabilité des embryons et de ne pas compromettre leur développement in utero. La manipulation de l'utérus doit être maintenu à un minimum. En outre, il convient de noter que la chirurgie sur des souris gravides a tendance à entraîner un accouchement prématuré (1-2 jours plus tôt que la normale). Cependant, les nouveau-nés doivent être généralement en bonne santé et se développer normalement. En outre, la pénétration de la pipette à travers la paroi utérine, du sac vitellin et de l'embryonpour atteindre le péricarde et enfin le myocarde est une procédure délicate (étape 5.3.13). Cette étape doit être effectuée avec soin et doucement. Pour l'optimisation, il est recommandé d'effectuer plusieurs injections de colorant à court terme pour déterminer la reproductibilité et d'exclure l'injection dans les zones non ciblées. Enfin, nous n'avons pas trouvé de malformations cardiaques de développement liés à la procédure d'injection pour les exemples donnés ci-dessus. Cependant, une analyse plus détaillée, étape par étape, l'analyse morphologique et fonctionnelle doit être effectuée pour déterminer complètement le développement et le fonctionnement normal pendant les phases d'intérêt.
Les limites de ces technologies sont multiples. (I) L'injection sous le microscope stéréoscopique est limitée par la lumière et la température de la sensibilité des embryons de souris. Ceci peut être surmonté par la pratique de la procédure de micro-injection pour être aussi rapide que possible, en remplaçant régulièrement ou réchauffant le milieu, et de travailler dans une pièce sombre. (Ii) L'ex vivo culture des embryons ou des explants est limitée dans le temps, contrairement à l'injection in utero guidée par ultrasons, ce qui permet à long terme de suivi. Colorants vitaux ont tendance à étiqueter presque immédiatement cellules et restent visibles jusqu'à trois à quatre jours après l'injection. Toutefois, l'intensité du colorant sera diluée par des divisions cellulaires successives. Marquage des cellules avec un lentivirus peut surmonter ce problème. Toutefois, l'absorption du virus prend plusieurs heures et d'expression est optimale après 24-48 h, ce qui empêche l'analyse à court terme. (Iii) L'injection d'ultrasons à médiation est limitée par le coût de l'équipement. La résolution du transducteur de 40 MHz est suffisante pour milieu et des embryons à un stade avancé, mais plus limitant pour les étapes préalables à E11.5.
En résumé, nous proposons que les protocoles d'injection cardiaques décrits ci-dessus doivent être utilisés dans des embryons de souris à mi-étape. La technique ex vivo est compatible avec la culture des embryons, des coeurs isolés, ou explants. La procédure in vivo permet à long terme de suivi, y compris le développement post-natal. Ces techniques aideront considérablement à tester le potentiel de différenciation des dérivés de cellules souches humaines dans un environnement adéquat, ainsi que dans le traitement des questions spécifiques de la biologie du développement, tels que la migration des cellules et des indices régionaux, qui sont des événements clés de la route vers l'élaboration d'un coeur fonctionnel . De plus, nos méthodes et celles des autres 10 peuvent à l'avenir être utilisés pour la recherche d'autres organes que le coeur, dépendant ex vivo protocoles de culture disponibles et / ou le stade de développement in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent la Fondation Leducq (MITRALE) et l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR Specistem) pour financer cette recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
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