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Biology

अलगाव और संस्कृति वयस्क माउस सेल संकेतन के लिए cardiomyocytes और की Published: May 21, 2014 doi: 10.3791/51357

Summary

हम वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की एक किस्म से कार्यात्मक वयस्क cardiomyocytes की संस्कृति के लिए एक सुसंगत परिणाम अर्जित करता है.

Abstract

तकनीकी विकास ट्रांसजेनिक और जीन पीटा चूहों, कई अनुसंधान के क्षेत्र में एक अनिवार्य उपकरण सहित, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों बना दिया है. वयस्क cardiomyocytes व्यापक रूप से एक अच्छा हृदय सेलुलर फिजियोलॉजी और pathophysiology के लिए मॉडल है, साथ ही दवा हस्तक्षेप के लिए के रूप में स्वीकार कर रहे हैं. आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की वजह से cardiomyocytes 'टर्मिनल भेदभाव करने के लिए अक्षम हैं जो वांछित जीनोटाइप, उत्पन्न करने के लिए जटिल cardiomyocyte संक्रमण प्रक्रियाओं के लिए की जरूरत रोकना. उच्च मात्रा और गुणवत्ता कार्यात्मक cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति नाटकीय रूप से हृदय अनुसंधान लाभ और संकेतन सेल पारगमन अनुसंधान और दवा के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करेगा. यहाँ, हम छोटे प्रशिक्षण के साथ लागू किया जा सकता है कि वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का वर्णन. माउस दिल excised और एक अलग दिल प्रणाली को cannulated है, तो एक कैल्शियम मुक्त और उच्च पी के साथ perfusedotassium Langendorff प्रतिगामी छिड़काव मोड में प्रकार द्वितीय collagenase पाचन द्वारा पीछा बफर. इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की एक किस्म से कार्यात्मक वयस्क चूहे cardiomyocytes के संग्रह के लिए एक सुसंगत परिणाम अर्जित करता है.

Introduction

Cardiomyocytes proliferative नहीं हैं. एच. एल -1 और माउस आलिंद ट्यूमर से प्राप्त एटी-1 कोशिकाओं की तरह कुछ आलिंद cardiomyocyte सेल लाइनें नहीं हैं; हालांकि, शोध के लिए उपलब्ध नहीं वयस्क निलय cardiomyocyte सेल लाइनें हैं. वयस्क माउस cardiomyocytes की प्राथमिक सेल संस्कृतियों सेलुलर और आणविक स्तर पर हृदय अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करते हैं. तिथि करने के लिए, वे जैव रासायनिक शारीरिक, और औषधीय अनुसंधान 1 के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लगातार उपयोग cardiomyocyte अलगाव के प्रभावी तरीकों जरूरी हो गया है. शुद्ध कल्चर अन्य अंगों के साथ बातचीत से मुक्त परिस्थितियों और ऐसे अंतर्जात neurohormonal और हार्मोन की तरह कारकों 2,3 के माध्यम के रूप में प्रणालीगत संचलन के लिए अनुमति देता है. हालांकि, cardiomyocytes के सफल अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है.

हम साथ साथ परिचय प्रोटोकॉल वयस्क चूहे cardiomyocyt साथ अपने अनुभवों पर आधारित हैतों और O'Connell एट अल 4,5 द्वारा वर्णित विधि. विशेष रूप से 2007 5 में, वे सेल संस्कृति और कार्यात्मक परख करने के लिए बफर तैयारी से विस्तृत तकनीकों का वर्णन किया. माउस myocytes चूहे cardiomyocytes की तुलना contracture को अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं, माउस प्रोटोकॉल में छिड़काव, पाचन, सीए 2 + सहनशीलता, चढ़ाना और संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया buffers या मीडिया, एक nonspecific उत्तेजना संकुचन युग्मन अवरोध करनेवाला, 2 के साथ पूरक हैं उनके सहज संकुचन को बाधित करने के लिए 3 Butanedione monoxime (BDM), इसलिए व्यवहार्यता और छड़ के आकार myocytes की उपज में काफी सुधार होगा. यहां पेश प्रोटोकॉल में, myocytes प्रकार द्वितीय collagenase साथ संशोधित Langendorff छिड़काव द्वारा पृथक दिल से एक उच्च पोटेशियम बफर में अलग हो रहे हैं. Collagenase द्वितीय प्रभावी ढंग कहनेवाला मैट्रिक्स और विज्ञप्ति कोशिकाओं टूट जाती है. छिड़काव समाधान भी एक कम स्तर 6 पर सेलुलर चयापचय रहता है. Additi मेंपर, हम यहां इस्तेमाल हार्वर्ड उपकरण से पृथक हृदय प्रणाली सटीक तापमान और लगातार दबाव नियंत्रण 7 के लिए अच्छी तरह से डिजाइन है. यह दृष्टिकोण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की तैयारी और हृदय hypertrophic assays के लिए संकेत प्रोटीन या 2-3 दिन संस्कृति को मापने के लिए रातोंरात संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है जो एकल कक्ष प्रकार की वर्दी आबादी प्रदान करता है.

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Protocol

चूहों पर सभी अनुसंधान प्रक्रियाओं और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था, और प्रोटोकॉल Toledo के विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, चिकित्सा और जीवन विज्ञान के कॉलेज द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. छिड़काव प्रणाली तैयार

  1. अलगाव से पहले दिन, तेज क्षारीय अवशेषों से मुक्त डिटर्जेंट का एक समाधान के साथ (जलाशयों सहित) पूरे छिड़काव प्रणाली भरें. समाधान कुछ घंटे या रात भर के लिए सिस्टम में सोख करने की अनुमति दें.
  2. अगली सुबह, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए thermocycler तापमान को समायोजित करने और समाधान गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं. डिटर्जेंट समाधान निकालें और निष्फल आसुत जल के साथ अच्छी तरह से सिस्टम फ्लश. सभी पक्ष शाखाओं मत भूलना.
  3. एक निरंतर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से छिड़काव बफर के साथ प्रणाली भरें और किसी भी हवाई रक्षा करने के लिए एक तरफ घुड़सवार सिरिंज के साथ महाधमनी कक्ष (बुलबुला जाल) से बाहर बुलबुले आकर्षितकोरोनरी रोड़ा से दिल. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के प्रवाह की दर नियमित जाँच की जानी चाहिए.

2. बफ़र की तैयारी, संस्कृति, मीडिया, और व्यंजन

  1. छिड़काव बफर: 1x छिड़काव बफर के 500 मिलीलीटर का उपयोग करने से पहले सुनिश्चित करें. यह कैल्शियम मुक्त बफर 113 मिमी NaCl, 4.7 मिमी KCl, 0.6 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 0.6 मिमी ना 2 4 HPO, 1.2 मिमी MgSO 4, 10 मिमी ना HEPES, 12 मिमी 3 NaHCO, 10 मिमी KHCO 3, शामिल 0.032 लाल मिमी फिनोल, 30 मिमी बैल की तरह, 10 मिमी BDM, और 5.5 मिमी ग्लूकोज. 2 एम एचसीएल के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर, दुकान के माध्यम से फिल्टर
    नोट: यह प्रयोग किया जाता है जब एक) छिड़काव समाधान एक ही दिन में तैयार किया जाना चाहिए. कुछ मामलों में, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 दिनों के लिए समाधान स्टोर करने के लिए स्वीकार्य है ख) यह बफर एटीपी सी कम, मौन cardiomyocytes रख सकते हैं, जो 15.3 मिमी के लिए एक उच्च पोटेशियम एकाग्रता ऊपर है,onsumption और सीए 2 + सहिष्णु क्षमता में वृद्धि.
  2. पाचन बफर (300 यू / एमएल, 25-50 मिलीग्राम / दिल): बस से पहले छिड़काव करने के लिए तैयार करते हैं. संस्कृति हुड में 50 मिलीलीटर छिड़काव बफर में भंग, प्रकार द्वितीय collagenase की कुल गतिविधि के 15,000 यू वजन. अंतिम कैल्शियम एकाग्रता 50 माइक्रोन बनाने के लिए 100 मिमी 2 CaCl के 25 μl (निष्फल शेयर समाधान, फिल्टर) जोड़ें. अलगाव के लिए तैयार है जब 37 डिग्री सेल्सियस के लिए बफर गर्म. Trypsin के विपरीत, collagenase 50-100 माइक्रोन सीए 2 + की उपस्थिति में सबसे अच्छा काम करता है.
  3. बंद करो बफर (50 मिलीग्राम / दिल): संस्कृति हुड में संचालित. 5 एमएल बाँझ FBS के साथ छिड़काव बफर के 45 मिलीलीटर मिलाएं.
    1. सीए 2 + समाधान मैं (12.5 माइक्रोन सीए 2 +): स्टॉप बफर के 20 मिलीलीटर के लिए 100 मिमी 2 CaCl के 2.5 μl जोड़ें और मिश्रण.
    2. सीए 2 + समाधान द्वितीय (100 माइक्रोन सीए 2 +): स्टॉप बफर के 10 एमएल के लिए 100 मिमी 2 CaCl के 10 μl जोड़ें और मिश्रण.
    3. सीए 2 + समाधान तृतीय (400 माइक्रोन सीए 2 +): स्टॉप बफर के 10 एमएल के लिए 100 मिमी 2 CaCl के 40 μl जोड़ें और मिश्रण.
    4. सीए 2 + समाधान चतुर्थ (900 माइक्रोन सीए 2 +): स्टॉप बफर के 10 एमएल के लिए 100 मिमी 2 CaCl के 90 μl जोड़ें और मिश्रण.
  4. स्थानांतरण संस्कृति हुड में एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2 मिमी एल glutamine और 1.26 मिमी 2 CaCl युक्त और FBS के 5 एमएल जोड़ने के सदस्य की 43 मिलीलीटर, BDM शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर (: (50 मिलीग्राम / दिल) मध्यम चढ़ाना 500 मिमी, फिल्टर निष्फल), और 0.5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल). मिक्स और 2% सीओ 2, ढीला टोपी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूर्व myocyte अलगाव को 2-3 घंटे के लिए संतुलित करना. राइट myocyte चढ़ाना पहले, मध्यम में 200 मिमी एटीपी की 0.5 मिलीलीटर (7.2 पीएच, शेयर समाधान, निष्फल फिल्टर) जोड़ें.
  5. संस्कृति के माध्यम से (50 मिलीग्राम / दिल): स्थानांतरण 48 कल्चर हुड में एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2 मिमी एल glutamine और 1.26 मिमी 2 CaCl युक्त सदस्य के मिलीग्राम और BDM शेयर समाधान (500 मिमी के 1 मिलीलीटर, filte जोड़आर) निष्फल, और 0.5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल). मिक्स और 2% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पूर्व myocyte अलगाव में संतुलित करना. उपयोग करने से पहले, मध्यम में 100 मिलीग्राम / एमएल BSA के 0.5 मिलीलीटर (निष्फल फिल्टर) जोड़ें.
    नोट: एक 2% सीओ 2 इनक्यूबेटर का प्रयोग myoctyes 24 घंटा अप करने के लिए उनके छड़ के आकार आकारिकी बनाए रखने में मदद करता है जो 6.9-7.0 में संस्कृति के माध्यम पीएच बनाए रखने की सुविधा.
  6. Laminin (1-2 ग्राम / 2 सेमी) में लिपटे बर्तन या प्लेट: निष्फल पीबीएस (डब्ल्यू / कैल्शियम और मैग्नीशियम ओ) के 20 मिलीग्राम और मिश्रण करने के लिए स्थानांतरण / एमएल प्राकृतिक माउस laminin 1 मिलीग्राम के 200 μl. , 100 मिमी व्यंजन को 35 मिमी व्यंजन, 60 मिमी व्यंजन को 2.5 मिलीलीटर, या 5 एमएल 1 एमएल जोड़ें समान रूप से सतहों को कवर करने के लिए हिला, और जगह सीओ 2 2% में, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर myocyte चढ़ाना तक.
    नोट: बर्तन या प्लेट लेपित दिन पर इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, वे Parafilm के साथ सील कर दिया और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (धीरे ​​कोटिंग) में संग्रहीत किया जा सकता है. सील requ हैiRed वाष्पीकरण और प्रदूषण को रोकने के लिए. लेपित प्लेट 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है.

3. माउस दिल हटाने और cannulation

  1. 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में कैंची और संदंश लेना और उन्हें सूखी.
  2. निकटतम 0.1 ग्राम के लिए माउस वजन. अपने शरीर के वजन, तनाव, यौन संबंध, और जन्म तिथि का रिकार्ड.
  3. 200 μl हेपरिन इंजेक्ट (100 आइयू / माउस) आईपी 10 मिनट पूर्व कोरोनरी धमनियों में रक्त की जमावट को रोकने के लिए संज्ञाहरण के लिए. 200 ketamine के / किग्रा शरीर के वजन मिलीग्राम और आईपी इंजेक्शन द्वारा xylazine की 10 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के साथ माउस anesthetize और माउस पूंछ / पैर की अंगुली चुटकी का जवाब देने बंद हो जाता है जब तक 5-10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
  4. धीरे छिड़काव सिस्टम के पास एक पशु शल्य चिकित्सा ट्रे या तालिका बेंच पर एक pinnable काम की सतह (यानी स्टायरोफोम) को forepaws और hindpaws फिक्सिंग से लापरवाह स्थिति में माउस सुरक्षित.
  5. 70% इथेनॉल के साथ छाती और पेट को साफ कर लें. एक midline त्वचा मैं बनाओएक शल्य कैंची के साथ डायाफ्राम के मध्य पेट से ncision.
  6. एक और शल्य कैंची के साथ डायाफ्राम कट और घुमावदार दाँतेदार संदंश के साथ उरोस्थि पकड़. द्विपक्षीय स्तर पर कट और दिल को बेनकाब करने के वक्ष पिंजरे retroflect.
  7. ठीक घुमावदार दाँतेदार और atraumatic संदंश का उपयोग थोड़ा दिल लिफ्ट और पृष्ठीय वक्ष दीवार के लिए संभव के रूप में बंद वक्ष गुहा के बाहर दिल टुकड़े करना.
  8. ठंड छिड़काव बफर युक्त 100 मिमी पकवान को दिल का स्थानांतरण. ध्यान से फेफड़ों, थाइमस, और ब्रांकाई के रूप में संयोजी ऊतक दूर ट्रिम.
  9. आमतौर पर थाइमस और वसा पैड से छिपे हुए हैं जो महाधमनी और उसके कपाल शाखाओं को पहचानें. दिल उठा, महाधमनी दीवार समझ, अपनी पहली शाखा 13 से नीचे महाधमनी कट, और थोड़ा छिड़काव तरल पदार्थ से भरे महाधमनी प्रवेशनी (फ्लैट / कुंद टिप और notches 1 और ऊपर 2 मिमी से 1.0 मिमी आयुध डिपो स्टेनलेस स्टील प्रवेशनी के लिए उस पर पर्ची दो अल्ट्रा ठीक टिप च का उपयोग कर या एक 22 जी पुन: प्रयोज्य खिला सुई), टिपorceps.
    नोट: एक) छिड़काव तरल पदार्थ कोरोनरी धमनियों में प्रवेश करने से गैस बुलबुले को रोकने के लिए दिल केन्युलेशन दौरान टपकता किया जाना चाहिए; ख) बस महाधमनी वाल्व ऊपर प्रवेशनी की नोक रखें.
  10. प्रवेशनी महाधमनी दबाना और 6-0 शल्य रेशम के साथ प्रवेशनी महाधमनी ligate. पूरे केन्युलेशन 120 सेकंड से भी कम समय लेना चाहिए.

4. दिल छिड़काव और पाचन

  1. 4 मिलीलीटर के प्रवाह की दर में कैल्शियम मुक्त छिड़काव बफर के साथ दिल छिड़कना / मिनट के बारे में 4-5 मिनट अपशिष्ट स्पष्ट हो जब तक, फिर 50 माइक्रोन 2 CaCl युक्त पाचन बफर करने के लिए स्विच और माउस तनाव के आधार पर 3.5-20 मिनट के लिए छिड़कना, छिड़काव दबाव और collagenase गतिविधि. यदि लागू हो पचा जब, 70-80 mmHg के लिए महाधमनी दबाव बढ़ा. जब आवश्यक हो, एंजाइम perfusate पाचन के लिए recirculated जा सकता है. आमतौर पर, 300 यू / एमएल एंजाइम बफर मिलीग्राम / मिनट 4 के प्रवाह की दर में 10-12 मिनट में एक दिल पचा जाएगा;70 mmHg में afterload दबाव लागू है, 300 यू / मिलीलीटर 4 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर केवल 3.5-5.5 मिनट का समय लगेगा.
  2. दिल थोड़ा पीला और झूलता हुआ हो जाता है जब पाचन बंद करो. धीरे pinched जब यह स्पंजी होना चाहिए.

5. प्रकोष्ठों हदबंदी और कैल्शियम reintroduction

  1. 70% इथेनॉल से लथपथ संदंश के साथ प्रवेशनी से महाधमनी खींचो और 2.5 एमएल पाचन बफर युक्त एक बाँझ 60 मिमी डिश में दिल डाल दिया. इस के लिए बाँझ तकनीक के प्रति जागरूक रहने और अनुवर्ती कदम, बाँझ आपूर्ति का उपयोग कल्चर हुड में ले जाएँ.
  2. ठीक शल्य कैंची से महाधमनी, अटरिया, और महान जहाजों को हटा दें. धीरे दो ठीक टिप संदंश के साथ 10-12 छोटे टुकड़ों में निलय तंग.
  3. धीरे एक 10 मिलीलीटर हस्तांतरण विंदुक के साथ दिल के टुकड़े और कोशिकाओं और ~ 10x नीचे पिपेट और फिर एक 15 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण. मैं 12.5 माइक्रोन 2 CaCl और हस्तांतरण युक्त 7.5 मिलीग्राम कैल्शियम समाधान के साथ पकवान कुल्लाइस ट्यूब में, 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप.
  4. धीरे से ऊपर और हृदय के ऊतकों के बड़े टुकड़ों को फैलाने के लिए एक ठीक टिप हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर नीचे सेल निलंबन पिपेट.
  5. तो फिर इस तरह के endothelial कोशिकाओं और fibroblasts के रूप में छोटे गैर myocyte कोशिकाओं को अलग करने के लिए 20 XG पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  6. सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण और 10 मिलीग्राम कैल्शियम समाधान में myocyte गोली resuspend 200 मिमी एटीपी की 100 μl (7.2 पीएच, शेयर समाधान, निष्फल फिल्टर) के एक पूरक के साथ मैं. 3-5 मिनट के लिए हुड में ट्यूब छोड़ दें.
  7. स्थानांतरण छड़ के आकार और दौर myocytes गिनती करने के लिए एक hemacytometer के लिए 10 μl aliquots नकल. Myocytes की कुल संख्या की गणना और छड़ के आकार myocytes के प्रतिशत की गणना.
  8. 20 x जी पर 3 मिनट के लिए myocytes अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 100 माइक्रोन 2 CaCl युक्त 10 मिलीलीटर कैल्शियम समाधान द्वितीय में छर्रों resuspend. Pipetting द्वारा ठीक की नोक हस्तांतरण विंदुक के साथ myocytes फैलानेऊपर और नीचे.
  9. क्रमशः कैल्शियम समाधान तृतीय (400 माइक्रोन 2 CaCl) और चतुर्थ (900 माइक्रोन CaCl 2), का उपयोग करके उपरोक्त कदम (5.8) दोहराएँ.
  10. माउस myocyte प्राथमिक संस्कृति के लिए, मध्यम चढ़ाना के 5 मिलीलीटर में अंतिम myocyte गोली resuspend. Myocytes की कुल संख्या की गणना और छड़ के आकार myocytes के प्रतिशत की गणना.

6. सेल संस्कृति

  1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 25,000 छड़ के आकार myocytes / एमएल छड़ के आकार myocytes की एकाग्रता को समायोजित करें. धीरे अच्छी तरह से उन्हें निलंबित करने के लिए एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग myocytes पिपेट. प्रत्येक पकवान या थाली के लिए बराबर सेल घनत्व सुनिश्चित करने के लिए पिपेट और ट्यूब में सेल अवसादन से बचें.
  2. Laminin कोटिंग समाधान बंद aspirating के बाद, उन बर्तन या प्लेट में myocytes थाली. धीरे संस्कृति हुड की सतह पर बर्तन या प्लेटें आगे और पीछे और साइड की ओर एक क्रॉस की तरह पैटर्न में तीन से चार बार स्लाइड.
  3. एक 2% सीओ में बर्तन या प्लेटें प्लेस37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर के बारे में 80% की दर से myocyte कुर्की की अनुमति के लिए 1-3 घंटे के लिए सेते हैं.
  4. कुर्की के बाद, धीरे स्वाधीन myocytes और सेल मलबे से युक्त मध्यम बंद aspirate. धीरे व्यंजन या प्लेटों के पक्षों के लिए संस्कृति के माध्यम जोड़ें. एक एक करके इस माध्यम का परिवर्तन एक कार्य करें. इसके तत्काल बाद इनक्यूबेटर व्यंजन या प्लेटें लौटें.
  5. ओ / एन संस्कृति के बाद, myocytes अल्पावधि संकेतन सेल की पढ़ाई से पहले BDM बिना ही माध्यम को बदला जा सकता है. Hypertrophic या apoptosis assays के लिए दीर्घकालिक संस्कृति में BDM रखें.
    नोट: BDM (2,3-butanedione monoxime) मायोसिन-ATPase रोकना और संकुचन रोका जा सकता है. मायोसिन आधारित संकुचन से इसका निषेध आसानी से प्रतिवर्ती है. यह BDM इस तरह, एक गैर विशिष्ट फॉस्फेट के रूप में अभिनय एसआर से कैल्शियम रिहाई बढ़ रही है, और मुक्त कैल्शियम एकाग्रता और सेलुलर बिजली prope के परिवर्तन के रूप में कुछ संभावित दुष्प्रभावों, हो सकता है कि सूचना दी हैrties, इसलिए इलाज से पहले, BDM हटाया जाना चाहिए. इसके अलावा, कुछ मामलों में, एक विशिष्ट मायोसिन द्वितीय अवरोध करनेवाला Blebbistatin cardiomyocyte संकुचन 8,9 बाधित करने के लिए एक वैकल्पिक दवा हो सकता है. हालांकि, हमारे मामलों में, BDM cardiomyocytes की गुणवत्ता और मात्रा की खातिर Blebbistatin की तुलना में बेहतर है.

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Representative Results

1. सफल अलगाव मात्रा

दो मापदंड अलगाव की सफलता यों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: पहला, कुल पृथक cardiomyocytes की संख्या, और दूसरा, छड़ के आकार कैल्शियम सहिष्णु गोल करने के लिए गैर सहिष्णु myocytes का अनुपात. आम तौर पर इस प्रोटोकॉल दिल हटाने से myocyte चढ़ाना और एक वयस्क माउस दिल से पैदावार लगभग 1 लाख छड़ के आकार cardiomyocytes (काटा कुल myocytes के 70-90%) के लिए चारों ओर 75-90 मिनट लगते हैं. इस माउस शरीर के वजन और तनाव से भिन्न हो सकते हैं. आमतौर पर, 0.7-1.0 मिलियन छड़ के आकार myocytes एक ~ 25 ग्राम C57BL/6J माउस, एक ~ 35 ग्राम काला स्विस माउस से 1.2-1,600,000 छड़ के आकार myocytes, और 0.7-1,200,000 छड़ के आकार myocytes से प्राप्त किए जा सकते हैं कर सकते हैं एक ~ 30 ग्राम ना / कश्मीर ATPase विषमयुग्मजी (α1 एस / आर) 10 या ~ 22 ग्राम हृदय विशिष्ट NCX-KO माउस 11 से एकत्र किया. पृथक myocytes सामान्य रूप से, आयताकार समाप्त होता है और स्पष्ट पार स्त्रिअतिओन्स साथ एक अलग छड़ के आकार दिया हैचित्र 1 में दिखाया गया है.

2. सेल समारोह पहचान

हमारे पिछले डेटा स्पष्ट रूप से संवर्धित नवजात चूहे cardiomyocytes में, 100 माइक्रोन ouabain पीआई 3 कश्मीर पर निर्भर कि AKT phosphorylation को सक्रिय करने और अतिवृद्धि 12 पैदा कर सकते हैं कि पता चला है. आगे वयस्क माउस cardiomyocytes में इन परिणामों की पुष्टि करने के लिए, वयस्क C57BL/6J माउस cardiomyocytes सुसंस्कृत और ouabain साथ इलाज किया गया. 2 और 3 में स्पष्ट रूप से ouabain एक खुराक पर निर्भर ढंग AKT में phosphorylation बढ़ाने के लिए और [3 एच]-leucine समावेश पैदा कर सकते हैं कि दिखाने के आंकड़े प्रोटीन संश्लेषण के दौरान.

चित्रा 1
चित्रा 1. काले स्विस माउस से सामान्य छड़ के आकार cardiomyocytes रातोंरात के बादसंस्कृति. myocytes फोटो सॉफ्टवेयर का उपयोग चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत फोटो खींच रहे थे.

चित्रा 2
सुसंस्कृत वयस्क C57BL/6J माउस cardiomyocytes में ouabain द्वारा AKT का चित्रा 2. सक्रियण. Myocytes 5 मिनट के लिए 0-50 माइक्रोन ouabain से अवगत कराया गया, और lysates पश्चिमी द्वारा phosphorylated (SER 473) AKT (P-कि AKT) और AKT के लिए assayed गया blots. सक्रियण कुल कि AKT को phosphorylated का अनुपात (एन = 5-10) के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था. * पी <0.05 बनाम नियंत्रण, ** पी <नियंत्रण बनाम 0.01.

चित्रा 3
चित्रा 3. Ouabai. 4 घंटा सीरम अभाव के बाद, myocytes साथ साथ ouabain या 100 एनएम एट -1 (सकारात्मक नियंत्रण) की उपस्थिति या अनुपस्थिति [3 एच] में संकेत दिया शर्तों के साथ इलाज किया गया सुसंस्कृत वयस्क C57BL/6J माउस cardiomyocytes में प्रोटीन संश्लेषण को उत्तेजित करता है - 12 घंटे के लिए leucine (1 μCi / एमएल). सेलुलर lysates 5% TCA साथ उपजी और 0.2 एम NaOH/0.1% एसडीएस में resuspended, और रेडियोधर्मिता एक जगमगाहट काउंटर में गिना गया गया. नमूना प्रति प्रोटीन संश्लेषण / मिलीग्राम प्रोटीन और नियंत्रण की तुलना में सामान्यीकृत सीपीएम की गणना की थी.

समाधान / बफर छिड़काव बफर पाचन बफर बफर बंद करो सीए 2 + समाधान मैं सीए 2 + समाधान द्वितीय सीए 2 + समाधान III सीए 2 + समाधान चतुर्थ
113 113 113 113 113 113 113
KCl, एम एम 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7
के.एच. 2 पीओ 4, मिमी 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
ना 2 4 HPO, मिमी 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
MgSO4, मिमी 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
ना HEPES, मिमी 10 10 10 10 10 10 10
3 NaHCO, मिमी 12 12 12 12 12 12 12
KHCO 3, मिमी 10 10 10 10 10 10 10
Phenol लाल, माइक्रोन 32 32 32 32 32 32 32
Taurine, मिमी 30 30 30 30 30 30 30
BDM, मिमी 10 10 10 10 10 10 10
ग्लूकोज, मिमी 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5
FBS,% (v / v) 0 0 10 10 10 10 10
Collagenase द्वितीय, मिलीग्राम / मिलीलीटर 0 1 0 0 0 0 0
2 CaCl, माइक्रोन 0 50 0 12.5 100 400 900

वयस्क माउस cardiomyocytes अलगाव के लिए तालिका 1. समाधान / बफ़र्स.

नाम कंपनी सूचि # तैयारी भंडारण
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) अटलांटा Biolgoicals S11550 N / A -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में 25 मिलीलीटर aliquots
गोजातीय सीरम albumin (BSA) के 100 मिलीग्राम / एमएल, 100x सिग्मा A7906 50 मिलीलीटर DIH 2 हे, 0.22 माइक्रोन बाँझ सिरिंज के माध्यम से च बाँझ फिल्टर में 5 ग्रामilter -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में 5 मिलीलीटर aliquots
2 CaCl 100 मिमी, 100x सिग्मा C4901 0.22 माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर के माध्यम से 0.555 50 मिलीलीटर DIH ओ 2 में जी, और बाँझ फिल्टर कमरे के तापमान पर बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर aliquots.
Laminin 1 मिलीग्राम / एमएल, 100x जीवन टेक्नोलॉजीज 23017-015 N / A -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 200 μl aliquots
2,3-Butanedione monoxime (BDM) 500 मिमी, 50x सिग्मा B0753 20 मिलीलीटर DIH 2 हे में 1.01 जी BDM, हुड में 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से छान कर समाधान बाँझ. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
Adenosine-5'-triphosphate disodium नमक (ना 2-एटीपी) 200 मिमी, 100x सिग्मा A6419 जोड़ें 5 एमएल DIH 2 हे1 ग्राम 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 2 एटीपी ना भंग करने के लिए, तो 7.2 पीएच को समायोजित और DIH 2 ओ के साथ 9 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए 2 मोल / एल NaOH उपयोग 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान बाँझ. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में 0.5 मिलीलीटर aliquots
NaCl 3.77 एम, 33.3x सिग्मा S7653 300 मिलीलीटर DIH 2 हे में 66 ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
KCl 470 मिमी, 100x फिशर साइंटिफिक P217 100 मिलीलीटर DIH ओ 2 में 3.5 जी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
के.एच. 2 पीओ 4 60 मिमी, 100x सिग्मा P5379 100 मिलीलीटर DIH 2 हे में 0.82 जी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
2 4 HPO 60 मिमी, 100x ना सिग्मा S0876 100 मिलीलीटर DIH 2 हे में 0.85 जी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
4 MgSO 120 मिमी, 100x सिग्मा एम-1880 100 मिलीलीटर DIH ओ 2 में 3 जी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
HEPES 1 एम, 100x जीवन टेक्नोलॉजीज 15630-080 N / A 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
3 NaHCO 600 मिमी, 50x सिग्मा S6014 200 मिलीलीटर DIH ओ 2 में 10.1 जी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
KHCO 3 एम 1, 100x फिशर साइंटिफिक P235 100 मिलीलीटर DIH ओ 2 में 10.1 जी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
Phenol लाल 3.2 मिमी, 100x सिग्मा P5530 100 मिलीलीटर DIH 2 हे में 0.12 जी कमरे के तापमान पर स्टोर.

तालिका 2. वयस्क माउस cardiomyocytes अलगाव और संस्कृति के लिए शेयर समाधान तैयार करने और भंडारण.

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Discussion

सबसे अच्छी तैयारी के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) तुरंत छांटना के बाद प्रवेशनी के लिए माउस दिल को hooking; 2) उपयुक्त दिल छिड़काव. इसके अलावा, कि पानी की गुणवत्ता, छिड़काव तापमान, बफर का पीएच, नसबंदी, रासायनिक पवित्रता, और स्वच्छ, गैर दूषित ट्यूबिंग और मंडलों भी महत्वपूर्ण कारक हैं ध्यान दें. 18.2 mΩ आणविक जीव विज्ञान ग्रेड 2 एच ओ अत्यधिक बफर तैयार करने के लिए सिफारिश की है. 200 मिमी एटीपी शेयर समाधान के पीएच 7.2, आसानी से याद किया जाता है जो एक कदम के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.

यह जल्दी से महाधमनी की पहचान करने और फ्लिन 13 से दिखाया के रूप में सिर्फ अपनी पहली शाखा नीचे कटौती करने के लिए आवश्यक है. कुशल हुक अप के लिए, डिग्री और छोटे दाँतेदार पार क्लैंप के साथ एक उपयुक्त आकार के स्टेनलेस स्टील प्रवेशनी सिफारिश कर रहे हैं. बंधाव के बाद, प्रवेशनी की नोक collagenase पूरी तरह कोरोनरी परिसंचरण के दौरान हृदय के ऊतकों के साथ बातचीत में मदद करने के क्रम में महाधमनी वाल्व से ऊपर होना चाहिए. कभी कभी, सेल उपज बड़े शुरू में लगता हैलेकिन कई कोशिकाओं दौर के आकार कैल्शियम सहनशीलता कदम के बाद कर रहे हैं. एक स्पष्टीकरण वाहिकाओं में coagulated खून पूरी तरह से अपर्याप्त पाचन होता है जो दिल से नहीं निकाला जा सकता है. एक और संभावना है दिल की पाचन खत्म हो गया है. Collagenase लंबे समय तक निवेश myocyte कैल्शियम सहिष्णुता 2 कम कर देता है. हदबंदी और कैल्शियम reintroduction के दौरान, यह के रूप में धीरे myocyte व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए संभव के रूप में cardiomyocytes को संभालने के लिए भी महत्वपूर्ण है.

संक्षेप में, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से वयस्क cardiomyocyte संस्कृति हृदय अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. परिणामों की व्याख्या करते हैं, तथापि, भविष्य के काम के मन में मानव और कृन्तकों के बीच आनुवंशिक अंतर रखना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान HL-36573 द्वारा समर्थित किया गया. हम इस पांडुलिपि संपादन के लिए श्री डेविड सोवा धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolated heart system for small rodent Harvard Apparatus IHSR-mouse 73-4019
Aortic Cannula, OD 1.0 mm Harvard Apparatus 73-2816
Dumont #4 Forceps Fine science tools 11294-00
Straight sharp serrated scissors Fine science tools 14070-12
Serrated Graefe forceps Fine science tools 11050-10
Curved, serrated Graefe forceps Fine science tools 11052-10
Straight Mini Serrefines clamps Fine science tools 18054-28
MEM Gibco 11575-032
Collagenase II Worthington 4176
Mucosal universal detergent Sigma Z637181 Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 87 वयस्क माउस cardiomyocytes collagenase अलगाव प्राथमिक सेल संस्कृति
अलगाव और संस्कृति वयस्क माउस सेल संकेतन के लिए cardiomyocytes और की<em&gt; इन विट्रो</em&gt; कार्डियक hypertrophy
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Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X.,More

Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy. J. Vis. Exp. (87), e51357, doi:10.3791/51357 (2014).

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