Summary
Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati.
Abstract
I progressi tecnologici hanno reso i topi geneticamente modificati, compresi transgenici e topi knockout gene, uno strumento essenziale in molti campi della ricerca. Cardiomiociti adulti sono ampiamente accettati come un buon modello per la fisiologia cellulare cardiaca e fisiopatologia, così come per intervento farmaceutico. Topi geneticamente modificati escludono la necessità di processi di infezione cardiomiociti complicati per generare il genotipo desiderato, che sono inefficienti a causa differenziazione terminale cardiomiociti. Isolamento e la coltura di grande quantità e qualità cardiomiociti funzionali drammaticamente a beneficio ricerca cardiovascolare e fornire un importante strumento di segnalazione cellulare di ricerca trasduzione e lo sviluppo di farmaci. Qui, descriviamo un metodo consolidato per l'isolamento di cardiomiociti adulti mouse che possono essere implementati con poca formazione. Il cuore del mouse viene asportato e cannulata per un sistema cuore isolato, poi perfusi con un p privo di calcio e altaotassium tampone seguito dal tipo II collagenasi digestione in Langendorff modalità di perfusione retrograda. Questo protocollo produce un risultato coerente per la raccolta dei cardiomiociti funzionali topo adulto da una varietà di topi geneticamente modificati.
Introduction
Cardiomiociti non sono proliferativa. Ci sono alcune linee cellulari cardiomiociti atriali, come HL-1 e cellule AT-1 derivate da tumori atriali topo; Tuttavia, non ci sono ventricolari adulto linee cellulari di cardiomiociti disponibili per la ricerca. Colture cellulari primarie di cardiomiociti adulti topo forniscono un modello potente per la ricerca di cuore a livello cellulare e molecolare. Ad oggi, sono stati ampiamente utilizzati per la biochimiche, fisiologiche e farmacologiche di ricerca 1. Inoltre, l'uso frequente di topi geneticamente modificati ha richiesto metodi efficaci di isolamento dei cardiomiociti. Coltura pura permette condizioni di libero dall'interazione con altri organi e circolazione sistemica, ad esempio attraverso fattori endogeni neurormonali e ormoni 2,3. Tuttavia, il successo isolamento di cardiomiociti può essere impegnativo.
Il protocollo introduciamo contenute sono basate sulle nostre esperienze con adulti di ratto cardiomyocytes e il metodo descritto da O'Connell et al 4,5. Soprattutto nel 2007 5, hanno descritto le tecniche dettagliate da preparazioni cuscinetto per coltura cellulare e saggio funzionale. Poiché miociti mouse sono molto sensibili alla contrattura rispetto ai cardiomiociti di ratto, i buffer o supporti utilizzati per la perfusione, digestione, Ca 2 + tolleranza, placcatura e cultura nel protocollo del mouse sono integrate con un inibitore di accoppiamento eccitazione-contrazione non specifico, 2, 3-butanedione monoxime (BDM) per inibire la loro contrazione spontanea, e quindi la redditività e la resa dei miociti a forma di bastoncello migliorare in modo significativo. Nel protocollo introdotto qui, i miociti sono separati in un buffer di potassio dal cuore isolato da modificata perfusione Langendorff con collagenasi di tipo II. Collagenase II rompe efficacemente la matrice intercellulare e cellule rilascia. La soluzione perfusione mantiene anche il metabolismo cellulare a un livello basso 6. In additi, il sistema cuore isolato dalla Harvard Apparatus che abbiamo usato qui è ben progettato per un preciso controllo della temperatura e pressione costante 7. Questo approccio fornisce preparazioni altamente riproducibili e popolazioni omogenee di tipo singola cellula, che può essere utilizzato in coltura durante la notte per misurare proteine di segnalazione o coltura 2-3 settimane per saggi ipertrofiche cardiaci.
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Protocol
Tutte le ricerche sui topi è stato fatto secondo le procedure e le linee guida del National Institutes of Health, e i protocolli sono stati approvati dal Comitato delle Università di Toledo Istituzionale cura degli animali ed uso, Collegio di Medicina e Scienze della Vita.
1. Perfusione preparazione sistema
- Il giorno prima isolamento, riempire l'intero sistema di perfusione (compresi serbatoi) con una soluzione di detersivo veloce senza residui alcalini. Lasciare che la soluzione di penetrare nel sistema per poche ore o durante la notte.
- La mattina successiva, regolare la temperatura termociclatore a 37 ° C e lasciare la soluzione di scaldarsi. Rimuovere la soluzione detergente e lavare accuratamente il sistema con acqua distillata sterilizzata. Non dimenticare tutti i rami laterali.
- Riempire il sistema con tampone di perfusione attraverso una pompa peristaltica costante e disegnare le bollicine d'aria dalla camera aorta (gorgogliatore) con una siringa laterale per proteggereil cuore da occlusione coronarica. La portata della pompa peristaltica deve essere controllato regolarmente.
2. Preparazione del buffer, Cultura Media e Piatti
- Perfusione Buffer: Fai 500 ml di tampone di perfusione 1x prima dell'uso. Questo buffer priva di calcio contiene 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0.6 mM Na 2 HPO 4, 1.2 MgSO mm 4, 10 mM Na-HEPES, 12 NaHCO mm 3, 10 KHCO mm 3, 0.032 fenolo mm Rosso, taurina 30 mm, BDM 10 mm, 5,5 mM di glucosio. Regolare il pH a 7.0 con 2 M HCl e filtrare attraverso un filtro di 0,2 micron, conservare a 4 ° C.
Nota: a) La soluzione perfusione deve essere preparata nello stesso giorno in cui viene utilizzato. In alcuni casi, è accettabile per conservare la soluzione per meno di 3 giorni a 4 ° C. b) Questo buffer ha una concentrazione di potassio alti fino a 15,3 millimetri, che può mantenere i cardiomiociti riposo, ridurre ATP cONSUMO e aumentare la capacità di Ca 2 +-tolerant. - Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / cuore): preparare appena prima di perfusione. Pesare 15.000 U di attività totale di tipo II collagenasi, sciogliere in 50 ml di tampone di perfusione in cappa di coltura. Aggiungere 25 ml di 100 mM CaCl 2 (soluzione, filtra sterilizzato) per rendere la concentrazione finale di calcio a 50 micron. Riscaldare il buffer di 37 ° C quando è pronto per l'isolamento. Diversamente tripsina, collagenasi funziona meglio in presenza di 50-100 mM Ca 2 +.
- Arresto Buffer (50 ml / cuore): Operare in cappa di coltura. Miscelare 45 ml di tampone di perfusione con 5 ml sterile FBS.
- Ca 2 + soluzione I (12.5 mM Ca 2 +): Aggiungere 2,5 ml di 100 mM CaCl 2 a 20 ml di tampone di arresto e mescolare.
- Ca 2 + soluzione II (100 mM Ca 2 +): Aggiungere 10 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare.
- Ca 2 + soluzione III (400 mM Ca 2 +): Aggiungere 40 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare.
- Ca 2 + IV soluzione (900 mM Ca 2 +): Aggiungere 90 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare.
- Placcatura medio (50 ml / cuore): Trasferimento 43 ml di MEM contenente 2 mM L-glutammina e 1.26 mM CaCl 2 in una sterile tubo conico da 50 ml in cappa di coltura e aggiungere 5 ml di FBS, 1 ml di soluzione BDM ( 500 mM, sterilizzato per filtrazione), e 0,5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml). Mescolare ed equilibrare per 2-3 ore prima dell'isolamento miociti in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore con i tappi allentati. Proprio prima placcatura miociti, aggiungere 0,5 ml di ATP 200 mM (pH 7.2, soluzione madre, filtra sterilizzato) nel mezzo.
- Terreno di coltura (50 ml / heart): Trasferimento 48 ml di MEM contenente 2 mM L-glutammina e 1.26 mM CaCl 2 in una sterile tubo conico da 50 ml in cappa di coltura e aggiungere 1 ml di soluzione madre BDM (500 mm, filter sterilizzato), e 0,5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml). Mescolare ed equilibrare in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore prima dell'isolamento miociti. Prima dell'uso, aggiungere 0,5 ml di 100 mg / ml di BSA (filtro sterilizzato) nel mezzo.
Nota: L'utilizzo di un incubatore CO 2 2% facilita il mantenimento della cultura medio pH a 6,9-7,0, che aiuta i myoctyes mantengono la loro morfologia a forma di bastoncello fino a 24 ore. - Laminina (1-2 mg / cm 2) piatti rivestiti o piastre: Trasferire 200 microlitri di 1 mg / ml topo naturale laminina a 20 ml di PBS sterile (w / o calcio e magnesio) e mescolare. Aggiungere 1 ml di piatti da 35 mm, 2,5 ml di piatti da 60 mm, o 5 ml di piatti da 100 mm, agitare per coprire uniformemente le superfici, e il luogo in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore fino placcatura miociti.
Nota: Se le stoviglie o piastre non vengono utilizzati il giorno rivestito, possono essere sigillati con parafilm e conservati a 4 ° C per una notte (Coating Lento). Tenuta è required per evitare l'evaporazione e la contaminazione. Piastre rivestite possono essere conservati a 4 ° C per 1 settimana.
3. Rimozione del mouse Cuore e Incannulamento
- Immergere le forbici e pinze nel 70% di etanolo per 30 minuti e lasciare asciugare.
- Pesare il mouse con un'approssimazione di 0,1 grammi. Registrare il suo peso corporeo, ceppo e sesso, e data di nascita.
- Iniettare 200 ml di eparina (100 UI / mouse) ip 10 min prima dell'anestesia per evitare la coagulazione del sangue nelle arterie coronarie. Anestetizzare il mouse con 200 mg / kg di peso corporeo di ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo di xylazina per iniezione ip e attendere per 5-10 minuti fino a quando il mouse non risponde a pizzichi coda / punta.
- Fissare il mouse nella posizione supina fissando delicatamente le zampe anteriori e hindpaws per una superficie di lavoro Pinnable (ad esempio polistirolo) su un vassoio chirurgico animale o panca tavolo vicino al sistema di perfusione.
- Pulire il torace e l'addome con il 70% di etanolo. Fai una pelle i linea medianancision da metà addome al diaframma con una forbice chirurgica.
- Tagliare il diaframma con un altro forbice chirurgica e tenere lo sterno con le pinze dentate curve. Tagliare bilaterale e retroflect gabbia toracica per esporre il cuore.
- Sollevare cuore leggermente utilizzando pinza sottile seghettati e atraumatica curvi e sezionare il cuore fuori della cavità toracica più vicino possibile alla parete toracica dorsale.
- Trasferire il cuore ad un piatto da 100 mm contenente tampone perfusione fredda. Rifilare con cura via i tessuti connettivi come i polmoni, timo, e bronchi.
- Identificare l'aorta e le sue diramazioni del cranio, che di solito sono nascosti da timo e cuscinetto adiposo. Tagliare l'aorta sotto del suo primo ramo 13, afferrare la parete aortica, alzare il cuore, e leggermente scivolare al perfusione cannula aortica pieno di liquido (1,0 mm di diametro cannula in acciaio inox con punta smussata / piatta e tacche 1 e 2 mm dal la punta, o un 22 G alimentazione riutilizzabile ago) utilizzando due ultra fine-tip forceps.
Nota: a) Il liquido di perfusione deve essere gocciolamenti durante incannulazione cardiaca per evitare bolle di gas di entrare arterie coronarie; b) Mantenere la punta della cannula appena sopra la valvola aortica. - Bloccare l'aorta alla cannula e legare l'aorta alla cannula con 6-0 seta chirurgica. L'intero incannulamento dovrebbe prendere meno di 120 sec.
4. Cuore di Perfusione e digestione
- Profumato cuore con tampone di perfusione privo di calcio a portata di 4 ml / min circa 4-5 minuti fino a quando gli effluenti diventano chiari, quindi passare al buffer di digestione contenente 50 mM CaCl 2 e profumato per 3,5-20 min a seconda del ceppo di topi, pressione di perfusione e l'attività collagenasi. Se del caso, aumentare la pressione aorta di 70-80 mmHg durante la digestione. Quando necessario, enzima perfusato può essere ricircolata per la digestione. Tipicamente, 300 tampone U / ml enzima digerire un cuore in 10-12 min ad una velocità di flusso di 4 ml / min;Se applicando pressione post-carico a 70 mmHg, 300 U / ml impiegheranno solo 3.5-5.5 min ad una velocità di flusso di 4 ml / min.
- Fermare la digestione quando il cuore diventa leggermente pallido e flaccido. Dovrebbe essere spugnoso quando pizzicato delicatamente.
5. Celle di dissociazione e Calcio reintroduzione
- Estrarre l'aorta dalla cannula con il 70% pinza etanolo-bagnato e mettere il cuore in un piatto sterile di 60 mm contenente 2,5 ml di tampone di digestione. Spostatevi nella cappa coltura utilizzando materiali sterili, rimanendo consapevoli delle tecniche sterili per questo e gradini di follow-up.
- Rimuovere aorta, atri, e dei grossi vasi con belle forbici chirurgiche. Stuzzicare delicatamente il ventricolo in 10-12 piccoli pezzi con due pinze fine-tip.
- Pipettare delicatamente i pezzi del cuore e le cellule su e giù ~ 10x con una pipetta di trasferimento da 10 ml e poi trasferire in un tubo di polipropilene conica da 15 ml. Sciacquare il piatto con 7,5 ml di soluzione di calcio che contenga 12,5 mM CaCl 2 e il trasferimentoquesto nel tubo, risultante in un volume finale di 10 ml.
- Pipetta delicatamente la sospensione cellulare su e giù con una pipetta fine-tip per disperdere i grandi pezzi di tessuto cardiaco.
- Centrifugare per 3 minuti a 20 xg per separare piccole cellule non miociti quali cellule endoteliali e fibroblasti.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet miociti in 10 ml di soluzione di calcio che con un supplemento di 100 ml di ATP 200 mM (pH 7.2, soluzione madre, filtra sterilizzato). Lasciare il tubo nel cappuccio per 3-5 min.
- Trasferimento duplicare 10 microlitri aliquote ad un emocitometro per contare miociti e rotondo a forma di asta. Calcolare il numero totale di miociti e calcolare la percentuale di miociti astiformi.
- Centrifugare i miociti per 3 min a 20 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di soluzione di calcio II contenente 100 mM CaCl 2. Disperdere i miociti con il trasferimento pipetta fine-tip pipettandosu e giù.
- Ripetere il passaggio precedente (5.8) utilizzando rispettivamente soluzione di calcio III (400 mM CaCl 2) e IV (900 mM CaCl 2).
- Per il mouse miociti coltura primaria, risospendere il pellet miociti finale in 5 ml di placcatura mezzo. Contare il numero totale di miociti e calcolare la percentuale di miociti astiformi.
6. Cell Culture
- Regolare la concentrazione dei miociti a forma di bastoncello a 25.000 a forma di bastoncello miociti / ml in una provetta da 50 ml. Pipettare delicatamente i miociti con una pipetta 10 ml di sospendere bene. Evitare di sedimentazione cella nella pipetta e provetta per garantire densità delle cellule uguali per ogni piatto o piatto.
- Dopo aspirando al largo della soluzione di rivestimento laminina, piatto miociti in quei piatti o piatti. Scorrere delicatamente i piatti o piastre in avanti e da tre a quattro volte arretrate e da lato a lato in un modello a croce sulla superficie della cappa coltura.
- Porre le capsule o le piastre in un 2% di CO2 incubatore a 37 ° C. Incubare per 1-3 ore per consentire attaccamento miociti ad una velocità di circa 80%.
- Dopo l'attacco, delicatamente aspirare fuori dal terreno contenente miociti slegati e detriti cellulari. Aggiungere delicatamente terreno di coltura ai lati dei piatti o piastre. Eseguire questo mezzo cambiamento uno per uno. Restituire immediatamente i piatti o piastre per l'incubatore.
- Dopo coltura O / N, i miociti possono essere modificati per lo stesso mezzo, senza BDM prima studi di segnalazione cellulare a breve termine. Tenere il BDM nella cultura lungo termine per le analisi ipertrofiche o apoptosi.
Nota: BDM (2,3-butanedione monoxime) possono inibire la miosina-ATPasi e prevenire la contrazione. La sua inibizione della contrazione basata miosina-è facilmente reversibile. È stato riferito che BDM può avere alcuni effetti collaterali, come ad esempio in qualità di fosfatasi non specifico, aumentando il rilascio di calcio da SR, e l'alterazione della concentrazione di calcio libero e cellulare prope elettricaproprietā, quindi prima del trattamento, il BDM deve essere rimosso. Inoltre, in alcuni casi, un inibitore specifico blebbistatin miosina II potrebbe essere un farmaco alternativo per inibire la contrazione dei cardiomiociti 8,9. Tuttavia, nel nostro caso, BDM è meglio che blebbistatin per motivi di qualità e quantità dei cardiomiociti.
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Representative Results
1. Quantificazione Isolamento di successo
Due sono i criteri utilizzati per quantificare il successo dell'isolamento: in primo luogo, il numero totale di cardiomiociti isolati, e secondo, il rapporto calcio-tolerant per arrotondare miociti non tolleranti a forma di asta. Generalmente questo protocollo richiede intorno 75-90 minuti dalla rimozione di cuore a placcatura miociti e le rese circa 1 milione di cardiomiociti a forma di bastoncello (70-90% dei miociti totali raccolti) da un cuore di topo adulto. Questo può variare con il peso corporeo del mouse e la tensione. Tipicamente, 0,7-1,0 milioni di miociti a forma di bastoncello possono essere raccolti da un ~ 25 g topo C57BL/6J, 1,2-1.600.000 miociti a forma di bastoncello da un ~ 35 g nero del mouse svizzero, e 0,7-1.200.000 miociti a forma di bastoncello può essere raccolto da un g Na / K-ATPasi eterozigoti ~ 30 (α1 S / R) 10 o ~ 22 g cardiaco specifico NCX-KO topo 11. Isolato miociti normalmente hanno una canna a forma distinta con estremità rettangolari e chiare trasversali striature,mostrato in Figura 1.
2. Identificazione funzione delle cellule
I nostri dati precedenti hanno mostrato chiaramente che in coltura cardiomiociti neonatali di ratto, 100 micron ouabain può attivare PI 3 K-dipendente fosforilazione di Akt e indurre ipertrofia 12. Ad ulteriore conferma di questi risultati in cardiomiociti topo adulto, cardiomiociti di topo C57BL/6J adulto sono state coltivate e trattati con ouabain. Figure 2 e 3 mostrano chiaramente che ouabain può aumentare fosforilazione Akt in maniera dose-dipendente e indurre [3 H]-leucina incorporazione durante la sintesi proteica.
Figura 1. Cardiomiociti a forma di bastoncello normale dal mouse Black svizzera dopo una nottecultura. miociti sono stati fotografati al microscopio a contrasto di fase utilizzando il software fotografico.
Figura 2. Attivazione di Akt da ouabain in colture di cardiomiociti adulti topo C57BL/6J. Miociti sono stati esposti a 0-50 micron ouabain per 5 minuti, e lisati sono stati analizzati per fosforilata (Ser 473) Akt (p-Akt) e Akt da ovest macchie. L'attivazione è stata quantificata come rapporto di fosforilata da Akt totale (n = 5-10). * P <0.05 vs controllo, ** p <0.01 vs controllo.
Figura 3. Ouabain stimola la sintesi proteica in coltura cardiomiociti di topo adulto C57BL/6J Dopo deprivazione di siero 4 hr, miociti sono stati trattati con le condizioni indicate in presenza o assenza di ouabaina o 100 nM ET-1 (controllo positivo) insieme con [3 H]. - leucina (1 uCi / ml) per 12 ore. I lisati cellulari sono stati precipitati con 5% TCA e risospese in 0,2 M NaOH/0.1% SDS, e la radioattività è stato contato in un contatore a scintillazione. La sintesi proteica per campione è stata calcolata cpm / mg di proteina e normalizzato rispetto al controllo.
| Soluzione / Buffer | Perfusione Buffer | Digestion Buffer | Smettere di buffer | Ca 2 + Soluzione | Ca 2 + Solution II | Ca 2 + Solution III | Ca 2 + Solution IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCl, mM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| Na 2 HPO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| MgSO4, mM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO 3, mM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO 3, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Rosso fenolo, mM | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| Taurina, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glucosio, mM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS,% (v / v) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Collagenase II, mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl 2, pM | 0 | 50 | 0 | 12.5 | 100 | 400 | 900 |
Tabella 1. Soluzioni / buffer per cardiomiociti di topo adulto isolamento.
| Nome | Azienda | Catalog # | Preparazione | Conservazione |
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | Aliquote di 25 ml di sterile 50 ml provette a -20 ° C. |
| Albumina sierica bovina (BSA) 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 5 g in 50 ml DIH 2 O, filtra attraverso sterile 0,22 micron siringa sterile filter | 5 ml aliquote in sterili provette da 15 ml a -20 ° C. |
| CaCl 2 100 mm, 100x | Sigma | C4901 | 0,555 g in 50 ml DIH 2 O, e il filtro sterile con 0,22 micron filtro a siringa sterile | 10 ml aliquote in sterili provette da 15 ml a temperatura ambiente. |
| Laminina 1 mg / ml, 100x | Tecnologie della vita | 23017-015 | N / A | 200 microlitri aliquote in sterili da 0,5 ml microprovette a -20 ° C. |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) 500 mm, 50x | Sigma | B0753 | 1.01 g BDM in 20 ml diH 2 O, sterilizzare la soluzione filtrando attraverso 0,22 micron filtro cappa. | conservare a 4 ° C. |
| Adenosina-5'-trifosfato sale disodico (Na 2-ATP) 200 mm, 100x | Sigma | A6419 | Aggiungere 5 ml diH 2 Oa sciogliere 1 g di Na 2-ATP in provetta da centrifuga 50 ml, quindi utilizzare 2 mol / l NaOH per regolare il pH a 7,2 e portare il volume finale a 9 ml con diH 2 O. sterilizzare la soluzione attraverso 0,22 micron filtro a siringa. | Aliquote da 0,5 ml a 1,5 ml microprovette sterili a -20 ° C. |
| NaCl 3.77 M, 33.3x | Sigma | S7653 | 66 g in 300 ml diH 2 O | conservare a 4 ° C. |
| KCl 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 3,5 g in 100 ml diH 2 O | conservare a 4 ° C. |
| KH 2 PO 4 60 mm, 100x | Sigma | P5379 | 0,82 g in 100 ml diH 2 O | conservare a 4 ° C. |
| Na 2 HPO 4 60 mm, 100x | Sigma | S0876 | 0,85 g in 100 ml diH 2 O | conservare a 4 ° C. |
| MgSO 4 120 mm, 100x | Sigma | M-1880 | 3 g in 100 ml diH 2 O | conservare a 4 ° C. |
| HEPES 1 M, 100x | Tecnologie della vita | 15630-080 | N / A | conservare a 4 ° C. |
| NaHCO 3 600 mm, 50x | Sigma | S6014 | 10.1 g in 200 ml diH 2 O | conservare a 4 ° C. |
| KHCO 3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 10.1 g in 100 ml diH 2 O | conservare a 4 ° C. |
| Rosso fenolo 3,2 mm, 100x | Sigma | P5530 | 0,12 g in 100 ml diH 2 O | conservare a temperatura ambiente. |
Tabella 2. Della preparazione della soluzione e di stoccaggio per topo adulto cardiomiociti isolamento e la coltura.
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Discussion
Per la migliore preparazione, i passaggi più critici sono: 1) prontamente agganciando il cuore del mouse alla cannula dopo l'asportazione; 2) perfusione cardiaca appropriata. Si noti inoltre che la qualità dell'acqua, la temperatura perfusione, pH del tampone, la sterilizzazione, la purezza chimica e pulito, tubi e camere non contaminati sono anche fattori importanti. 18.2 mW biologia molecolare-grade H 2 O è altamente raccomandato per la preparazione del buffer. Il pH della soluzione madre ATP 200 mM deve essere regolato a 7.2, un passo che è facilmente perdere.
È essenziale identificare rapidamente l'aorta e tagliare appena sotto il primo ramo come dimostrato da Flynn 13. Per efficiente hook-up, si raccomanda una cannula in acciaio inox di dimensioni adeguate, con tacche e fascetta piccola croce seghettato. Dopo la legatura, la punta della cannula deve essere al di sopra della valvola aortica per aiutare la collagenasi interagire pienamente con tessuto cardiaco durante la circolazione coronarica. A volte, la resa cellulare sembra grande inizialmentema molte cellule sono dopo la fase di tolleranza calcio di forma circolare. Una spiegazione è che il sangue coagulato nei vasi non può essere completamente rimosso dal cuore, che porta alla digestione insufficiente. Un'altra possibilità è sopra digestione del cuore. L'esposizione prolungata a collagenase riduce miociti calcio tolleranza 2. Durante la dissociazione e la reintroduzione di calcio ed è importante anche per gestire i cardiomiociti il più delicatamente possibile per mantenere la vitalità dei miociti.
In sintesi, la cultura cardiomiociti adulti da topi geneticamente modificati è un potente strumento per la ricerca cardiaca. Tuttavia, il lavoro futuro dovrebbe tenere a mente la differenza genetica tra umani e roditori quando si interpretano i risultati.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute di Grant HL-36573. Ringraziamo il Sig. David Sowa per la modifica di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
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