Summary
Vi beskriver en pålitelig metode for isolering av voksen mus kardiomyocytter. Denne protokollen gir et konsistent resultat for kulturen i funksjonelle voksne cardiomyocytes fra en rekke genmodifiserte mus.
Abstract
Teknologiske fremskritt har gjort genmodifiserte mus, herunder genmodifiserte og genet knockout mus, et viktig verktøy i mange forskningsfelt. Voksen cardiomyocytes er allment akseptert som en god modell for hjerte cellulær fysiologi og patofysiologi, så vel som til farmasøytisk intervensjon. Genetisk modifiserte mus utelukker behovet for kompliserte cardiomyocyte infeksjonsprosesser for å generere den ønskede genotype, som er ineffektive på grunn av kardiomyocytter 'terminal differensiering. Isolasjon og kultur av høy kvantitet og kvalitet funksjonelle cardiomyocytes vil dramatisk nytte kardiovaskulær forskning og gi et viktig verktøy for cellesignale transduksjon forskning og legemiddelutvikling. Her beskriver vi en veletablert metode for isolering av voksne mus kardiomyocytter som kan gjennomføres med lite trening. Musen Hjertet ble skåret ut og kanylert til et isolert hjerte-system, og deretter perfusert med et kalsium-fritt og høy potassium buffer etterfulgt av type II collagenase fordøyelsen i Langendorff retrograd perfusjon modus. Denne protokollen gir et konsistent resultat for innsamling av funksjonelle voksen mus cardiomyocytes fra en rekke genmodifiserte mus.
Introduction
Cardiomyocytes er ikke proliferativ. Det er noen atriale cardiomyocyte cellelinjer, som HL-1 og AT-1-celler avledet fra muse atriale tumorer; men det er ingen voksen ventrikkel cardiomyocyte cellelinjer som er tilgjengelige for forskning. Primære cellekulturer fra voksne mus kardiomyocytter gi en kraftig modell for hjerteforskning på cellulært og molekylært nivå. Hittil har de vært brukt mye for biokjemiske, fysiologiske, og farmakologisk forskning en. I tillegg har den hyppige bruken av genmodifiserte mus nødvendig effektive metoder for cardiomyocyte isolasjon. Ren kultur tillater betingelser fri for interaksjon med andre organer og den systemiske sirkulasjon, for eksempel gjennom endogene neurohormonal og hormon-lignende faktorer 2,3. Imidlertid kan vellykket isolering av kardiomyocytter være utfordrende.
Protokollen vi introdusere her er basert på våre erfaringer med voksen rotte cardiomyocytes og fremgangsmåten beskrevet av O'Connell et al 4,5. Spesielt i 2007 5, beskrives de detaljerte teknikker fra buffermidler til cellekultur og funksjonelt assay. Siden muse myocytes er svært utsatt for kontraktur i forhold til de rotte cardiomyocytes, blir buffere eller mediene som brukes for perfusjon, fordøyelse, Ca 2 + toleranse, platekledning og kultur i musen protokollen supplert med en uspesifikk eksitasjon-kontraksjon kopling inhibitor, 2, 3-butandion monoxime (BDM) for å hemme deres spontan sammentrekning, derav levedyktighet og utbytte av stavformede myocytes forbedres vesentlig. I protokollen innføres her, er myocytes separeres i en høy kaliumbuffer fra det isolerte hjertet ved modifisert Langendorff perfusjon med type II kollagen-ase. Kollaqenase II bryter effektivt ned inter matrise og frigjør cellene. Perfusjon løsningen holder også cellenes stoffskifte på et lavt nivå seks. I tilpå, er den isolerte hjertet system fra Harvard Apparatus vi brukte her godt designet for nøyaktig temperatur og konstant trykkregulering 7. Denne fremgangsmåten gir svært reproduserbare preparater og ensartede populasjoner av enkeltcelletype, som kan brukes i over natten kultur for å måle signal proteiner eller 2-3 dagers kultur for kardiale hypertrofiske assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning på mus ble gjort i henhold til prosedyrer og retningslinjer av National Institutes of Health, og protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Toledo, College of Medicine og biovitenskap.
En. Perfusjonssystem Forberedelse
- Dagen før isolasjon, fylle hele perfusjon systemet (inklusive reservoarer) med en oppløsning av fast basisk rest-fritt vaskemiddel. La løsningen suge inn i systemet i noen timer eller over natten.
- Den neste morgen, justere thermocycler temperaturen til 37 ° C og la oppløsningen varmes opp. Fjern såpevann og skyll systemet grundig med sterilisert destillert vann. Ikke glem alle sidegreiner.
- Fyll-system med perfusjon buffer via en konstant peristaltisk pumpe og trekke noen luftbobler ut fra aorta kammeret (bubble-felle) med en sidemontert sprøyte for å beskyttehjertet av koronar okklusjon. Strømningsraten den peristaltiske pumpen skal kontrolleres rutinemessig.
2. Utarbeidelse av buffere, Kultur Media, og Retter
- Perfusjons Buffer: Lag 500 ml 1x perfusjon buffer før bruk. Denne kalsium-free buffer inneholder 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSo4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO 3, 0.032 mM fenolrødt, 30 mM taurin, 10 mM BDM, og 5,5 mM glukose. Juster pH til 7,0 med 2 M HCl og filtreres gjennom et 0,2 mikrometer filter, oppbevar ved 4 ° C.
Merk: a) Perfusjonen løsningen bør være forberedt på samme dag når den brukes. I noen tilfeller, er det akseptabelt å oppbevare oppløsningen i mindre enn 3 dager ved 4 ° C. b) Denne bufferen har en høy kaliumkonsentrasjon opp til 15,3 mm, som kan holde de cardiomyocytes quiescent, redusere ATP-consumption og øke Ca 2 +-tolerant evne. - Fordøyelse buffer (300 U / ml, 25 til 50 ml / hjerte): forberede like før perfusjon. Vei 15 000 U av den totale aktivitet av type II kollagenase, oppløses i 50 ml buffer perfusjon i kultur hette. Tilsett 25 pl av 100 mM CaCl 2 (stock løsning, filtersterilisert) for å gjøre den endelige kalsium-konsentrasjon 50 uM. Varm buffer til 37 ° C når den er klar for isolasjon. I motsetning til trypsin, collagenase fungerer best i nærvær av 50-100 mikrometer Ca 2 +.
- Stopp Buffer (50 ml / hjerte): Brukes på kultur hette. Bland 45 ml perfusjon buffer med 5 ml sterilt FBS.
- Ca 2 + oppløsning I (12,5 mM Ca 2 +): til 2,5 ul av 100 mM CaCl 2 til 20 ml stoppbuffer og bland.
- Ca 2 +-løsning II (100 mM Ca 2 +): Tilsett 10 pl av 100 mM CaCl 2-10 ml stoppbuffer og bland.
- Ca 2 +-løsning III (400 mikrometer Ca 2 +) Til 40 ul av 100 mM CaCl 2 til 10 ml av stoppbuffer og bland.
- Ca 2 + løsningen IV (900 mM Ca 2 +) til 90 ul av 100 mM CaCl 2-10 ml stoppbuffer og bland.
- Plating medium (50 ml / hjerte): Overfør 43 ml MEM inneholdende 2 mM L-glutamin og 1,26 mM CaCl 2 inn i et sterilt 50 ml konisk rør i kultur hetten og tilsett 5 ml FBS, 1 ml BDM stamløsning ( 500 mM, filtersterilisert), og 0,5 ml penicillin / streptomycin (10 000 U / ml). Bland og stabilisering i 2-3 timer før myocyte isolasjon i 2% CO 2, 37 ° C inkubator med caps løs. Rett før myocyte plating, tilsett 0,5 ml 200 mM ATP (pH 7,2, stamløsning, filtrer sterilisert) inn i mediet.
- Kultur-medium (50 ml / hjerte): Overfør 48 ml MEM inneholdende 2 mM L-glutamin og 1,26 mM CaCl 2 inn i et sterilt 50 ml konisk rør i kultur hetten og tilsett 1 ml BDM stamløsning (500 mM, filter sterilisert), og 0,5 ml penicillin / streptomycin (10 000 U / ml). Bland og ekvilibrere i 2% CO2, 37 ° C inkubator før myocyte isolasjon. Før bruk tilsett 0,5 ml 100 mg / ml BSA (filtersterilisert) i mediet.
Merk: Ved hjelp av en 2% CO 2 inkubator letter vedlikehold av kulturmediet pH på 6,9 til 7,0, noe som bidrar til å opprettholde sin myoctyes stavformet morfologi opp til 24 timer. - Laminin (1-2 mikrogram / cm 2)-belagte retter eller plater: Overfør 200 ul av 1 mg / ml naturlig mus laminin til 20 ml med sterilt PBS (w / o kalsium og magnesium) og bland. Tilsett 1 ml i 35-mm skåler, 2,5 ml til 60-mm skåler, eller 5 ml for 100-mm skåler, rystes jevnt dekke overflatene, og plasser i 2% CO2, 37 ° C inkubator inntil myocyte plating.
Merk: Hvis de retter eller platene ikke er brukt på dag belagt, kan de forsegles med Parafilm og lagret ved 4 ° C over natten (Slow Coating). Selfangst er requIRED å hindre fordamping og forurensning. Belagte plater kan holdes ved 4 ° C i opptil 1 uke.
Tre. Mouse Hjerte Fjerning og cannulation
- Bløt saks og pinsett i 70% etanol i 30 min og la dem tørke.
- Vei musen til nærmeste 0,1 gram. Spill sin kroppsvekt, stamme, kjønn og fødselsdato.
- Injisere 200 mL heparin (100 IE / mus) ip 10 min før anestesi for å hindre koagulering av blod i koronararteriene. Anesthetize mus med 200 mg / kg kroppsvekt av ketamin og 10 mg / kg kroppsvekt ip injeksjon av xylazin og vente på 5-10 min inntil musen ikke svarer til halen / tå klyper.
- Fest musen i liggende stilling ved å forsiktig fikse forpotene og hindpaws til overflaten en pinnable arbeid (dvs. styrofoam) på et dyr kirurgi skuffen eller bord benk nær perfusjon system.
- Tørk av brystet og magen med 70% etanol. Lag en midtlinjen hud jegncision fra midten av magen til membranen med en kirurgisk saks.
- Skjær mellomgulvet med en annen kirurgisk saks og hold sternum med buede taggete tang. Skjær bilateralt og retroflect thorax buret for å blottlegge hjertet.
- Løft hjertet litt hjelp av gode buede taggete og atraumatiske tang og dissekere hjertet ut av brysthulen så nært som mulig til dorsal thorax veggen.
- Overfør hjerte til en 100 mm skål med kald perfusjon buffer. Skjær forsiktig bort bindevev som lunger, thymus, og bronkiene.
- Identifiser aorta og dens hjerne grener, som vanligvis er skjult av thymus og fett pad. Skjær aorta under sin første filial 13, tar du tak i aorta, løfter hjertet, og litt skli den videre til perfusjon væskefylte aortic kanyle (1,0 mm OD rustfritt stål kanyle med butt / flat tupp og hakk 1 og 2 mm over tuppen, eller en 22 G gjenbruk fôring nål) ved hjelp av to ultra fin-tip forceps.
Merk: a) Perfusjonen væske bør være dryppende under hjertet cannulation å forhindre gassbobler kommer inn i koronararteriene; b) holde spissen på kanylen like over aorta-ventilen. - Klem aorta til kanylen og å ligere aorta til kanylen med 6-0 kirurgisk silke. Hele cannulation bør ta mindre enn 120 sek.
4. Hjerte Perfusjons og fordøyelse
- Perfuse hjertet med kalsium-free perfusjon buffer på strømningshastighet på 4 ml / min ca 4-5 min før utslipp bli klart, deretter bytte til fordøyelsen buffer som inneholder 50 mM CaCl 2 og perfuse for 3,5 til 20 min avhengig av mus belastning, perfusjon press og kollagenaseaktivitet. Hvis det er aktuelt, øker aorta press til 70-80 mmHg når fordøye. Når det er nødvendig, kan enzymet perfusat resirkuleres for fordøyelsen. Vanligvis vil 300 U / ml enzym buffer fordøye et hjerte i 10-12 min ved en strømningshastighet på 4 ml / min;Ved å anvende afterload trykk ved 70 mm Hg, blir 300 U / ml ta bare 3,5 til 5,5 minutter ved en strømningshastighet på 4 ml / min.
- Stopp fordøyelsen når hjertet blir litt blek og slapp. Det bør være svampete når forsiktig klem.
5. Cells dissosiasjon og Kalsium reintroduksjon
- Trekk aorta fra kanylen med 70% etanol-fuktet tang og sette hjertet i en steril 60-mm Skål inneholdende 2,5 ml fordøyelse buffer. Flytt inn i panseret kultur ved hjelp av sterile produkter, bor mindful av sterile teknikker for dette og oppfølging trinn.
- Fjern aorta, atriene, og store skip med fine kirurgiske saks. Forsiktig erte ventrikkelen i 10-12 små biter med to fine tips tang.
- Forsiktig pipette hjertet stykker og celler opp og ned ~ 10x med en 10-ml overføringspipetten og deretter overføre til en 15-ml polypropylen konisk tube. Skyll formen med 7,5 ml kalsium løsningen jeg inneholder 12,5 mikrometer CaCl 2 og overføringdette inn i røret, noe som resulterer i et endelig volum på 10 ml.
- Forsiktig pipette cellesuspensjonen opp og ned ved hjelp av en fin-tip overføringspipetten å spre de store biter av hjertevevet.
- Deretter Sentrifuger i 3 minutter ved 20 x g for å skille ut små ikke-myocyte celler som endotelceller og fibroblaster.
- Aspirer av supernatanten og resuspender myocyte pelleten i 10 ml oppløsning kalsium I med et tillegg på 100 pl 200 mM ATP (pH 7,2, stock løsning, filtersterilisert). La røret i panseret for 3-5 min.
- Overføring duplikat 10 ul delmengder av en hemacytometer for å telle stavformede og runde myocytter. Beregn det totale antallet myocytter og beregne prosentandelen av stavformede muskelceller.
- Sentrifuger myocytes for 3 min ved 20 x g. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml kalsium-løsning II som inneholdt 100 mM CaCl 2. Spre myocytes med den fine-tip overføringspipetten ved pipetteringopp og ned.
- Gjenta det foregående trinn (5,8) ved hjelp av kalsium-løsning III (400 mM CaCl 2) og IV (900 mM CaCl 2), henholdsvis.
- For mus myocyte primære kultur, resuspender endelige myocyte pellet i 5 ml av plating medium. Telle det totale antallet myocytter og beregne prosentandelen av stavformede muskelceller.
6. Cell Culture
- Juster konsentrasjonen av stavformede myocytes 25.000 stavformede myocytes / ml i en 50 ml-rør. Forsiktig pipette myocytes ved hjelp av en 10-ml pipette å suspendere dem godt. Unngå celle sedimentering i pipetten og rør for å sikre lik celletetthet for hver tallerken eller plate.
- Etter å aspirere av laminin belegg løsning, plate myocytes inn de rettene eller plater. Forsiktig gli serviset eller platene frem og tilbake og fra side til side i et kryss-mønster som tre til fire ganger på overflaten av hetten kultur.
- Plasser de retter eller platene i en 2% CO2 inkubator ved 37 ° C. Inkuber i 1-3 timer for å tillate myocyte feste med en hastighet på ca 80%.
- Etter vedlegg, forsiktig aspirer av medium som inneholder fristilt myocytes og celleavfall. Forsiktig legge kulturmedium til sidene av de retter eller platene. Utfør dette mediet endringen én etter én. Umiddelbart returnere de retter eller platene til inkubatoren.
- Etter at O / N kulturen, kan de myocytes endres til det samme medium uten BDM før studier av korttidscellesignalisering. Hold BDM i langsiktig kultur for hypertrofiske eller apoptose analyser.
Merk: BDM (2,3-butandion monoxime) kan hemme myosin-ATPase og hindre sammentrekning. Dets inhibering av myosin-baserte kontraksjon er lett reversibel. Det er rapportert at BDM kan ha noen potensielle bivirkninger, for eksempel fungere som en uspesifikk fosfatase, økt kalsium frigjøring fra SR, og endring av fritt kalsium konsentrasjon og cellular elektrisk properties, slik at før behandlingen, BDM bør fjernes. Videre, i noen tilfeller kan en spesifikk myosin II-inhibitor Blebbistatin være et alternativ medikament for å hemme kontraksjon cardiomyocyte 8,9. Men i våre saker, er BDM bedre enn Blebbistatin av hensyn til kvaliteten og kvantiteten av cardiomyocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En. Vellykket Isolation Kvantifisering
To kriterier er benyttet for å kvantifisere suksessen av isolerings: for det første det totale antall cardiomyocytes isolert, og for det andre forholdet mellom stavformede kalsiumtolerant å runde ikke-tolerante myocytter. Vanligvis denne protokollen tar rundt 75-90 minutter fra hjertet fjerning til myocyte plating og rentene rundt 1 million stavformede Cardiomyocytes (70-90% av totale myocytes høstet) fra en voksen mus hjerte. Dette kan variere med musen kroppsvekt og belastning. Vanligvis kan 0,7-1,0 millioner stavformede myocytes hentes fra en ~ 25 g C57BL/6J mus, 1,2 til 1.600.000 stavformede myocytes fra en ~ 35 g svart sveitsiske mus, og 0,7 til 1.200.000 stavformede myocytes kan hentes fra en ~ 30 g Na / K-ATPase heterozygot (α1 S / R) 10 eller ~ 22 g hjerte bestemt NCX-KO mus 11. Isolerte myocytes har normalt en distinkt stang-form med rektangulære ender og klare kryss striper,vist på figur 1.
2. Cellefunksjon Identifikasjon
Våre tidligere data har tydelig vist at i dyrkede neonatal rotte cardiomyocytes, kan 100/xM ouabain aktivere PI tre K-avhengige Akt fosforylering og indusere hypertrofi 12. For å bekrefte disse resultatene hos voksne mus cardiomyocytes ytterligere, voksen C57BL/6J mus cardiomyocytes ble dyrket og behandlet med ouabain. Figurene 2 og 3 viser klart at ouabain kan øke Akt fosforylering på en doseavhengig måte og indusere [3 H]-leucin-inkorporering under proteinsyntese.
Figur 1. Normale stavformede cardiomyocytes fra Black sveitsiske mus etter nattenmyocytes ble fotografert under fase kontrast mikroskopi ved hjelp av bildebehandlingsprogram kultur..
Figur 2. Aktivering av Akt etter ouabain i dyrkede voksen C57BL/6J muse kardiomyocytter. Myocytes ble utsatt for 0-50 mikrometer ouabain for 5 min, og lysates ble analysert for fosforylert (Ser 473) Akt (p-Akt) og Akt av vestlige blotter. Aktivisering ble kvantifisert som forholdet mellom fosforylert til total Akt (n = 5-10). * P <0,05 sammenlignet med kontroll, ** P <0,01 vs kontroll.
Figur 3. Ouabain stimulerer proteinsyntese i dyrkede voksen C57BL/6J mus cardiomyocytes Etter 4 timers serum mangel, ble myocytter ble behandlet med de angitte betingelser i nærvær eller fravær av ouabain, eller 100 nM ET-1 (positiv kontroll), sammen med [3-H]. - leucin (1 pCi / ml) i 12 timer. Cellulære lysater ble utfelt med 5% TCA og resuspendert i 0,2 M NaOH/0.1% SDS, og radioaktiviteten ble tellet i en scintillasjonsteller. Den proteinsyntese per prøve ble beregnet til CPM / mg protein og normalisert i forhold til kontrollen.
| Løsning / Buffer | Perfusjons Buffer | Fordøyelse Buffer | Stopp buffer | Ca 2 + løsning Jeg | Ca 2 + Solution II | Ca 2 + Solution III | Ca 2 + Solution IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCl, mM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4, MM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| Na 2 HPO 4, MM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| MgSO4, mM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO 3, MM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO 3, MM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Fenolrødt, mikrometer | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| Taurin, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glukose, mM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS,% (v / v) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Collagenase II mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl 2, mikrometer | 0 | 50 | 0 | 12,5 | 100 | 400 | 900 |
Tabell 1. Solutions / buffere for voksen mus cardiomyocytes isolasjon.
| Navn | Selskapet | Catalog # | Forberedelse | Lagring |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | 25 ml alikvoter i sterile 50 ml rør ved -20 ° C. |
| Bovint serum albumin (BSA), 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 5 g i 50 ml Dih 2 O, sterile filteret gjennom 0,22 mikrometer steril sprøyte fIlter | 5 ml alikvoter i sterile 15 ml rør ved -20 ° C. |
| CaCl 2 100 mm, 100x | Sigma | C4901 | 0.555 g i 50 ml Dih 2 O, og sterilt filter gjennom 0,22 mikrometer steril sprøyte filter | 10 ml alikvoter i sterile 15 ml rør ved romtemperatur. |
| Laminin 1 mg / ml, 100x | Life-teknologi | 23017-015 | N / A | 200 mL alikvoter i sterile 0,5 ml mikrosentrifugerør ved -20 ° C. |
| 2,3-butandion monoxime (BDM) 500 mm, 50x | Sigma | B0753 | 1,01 g BDM i 20 ml Dih 2 O, sterilisere løsningen ved å filtrere gjennom 0,22 mikrometer filter i hette. | oppbevar ved 4 ° C. |
| Adenosin-5'-trifosfat dinatriumsalt (Na 2-ATP) 200 mM, 100x | Sigma | A6419 | Tilsett 5 ml Dih 2 Oå oppløse 1 g Na 2-ATP i 50 ml sentrifugerør, og deretter bruke 2 mol / l NaOH for å justere pH til 7,2, og bringe det endelige volum til 9 ml med DIH 2 O. Steriliser oppløsningen gjennom 0,22 um sprøytefilter. | 0,5 ml aliquoter i 1,5 ml sterile mikrosentrifugerør ved -20 ° C. |
| NaCl 3,77 M, 33.3x | Sigma | S7653 | 66 g i 300 ml Dih 2 O | oppbevar ved 4 ° C. |
| KCl 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 3,5 g i 100 ml Dih 2 O | oppbevar ved 4 ° C. |
| KH 2 PO 4 60 mm, 100x | Sigma | P5379 | 0,82 g i 100 ml Dih 2 O | oppbevar ved 4 ° C. |
| Na 2 HPO 4 60 mm, 100x | Sigma | S0876 | 0,85 g i 100 ml Dih 2 O | oppbevar ved 4 ° C. |
| MgSO 4 120 mM, 100x | Sigma | M-1880 | 3 g i 100 ml Dih 2 O | oppbevar ved 4 ° C. |
| HEPES en M, 100x | Life-teknologi | 15630-080 | N / A | oppbevar ved 4 ° C. |
| NaHCO 3 600 mm, 50x | Sigma | S6014 | 10,1 g i 200 ml Dih 2 O | oppbevar ved 4 ° C. |
| KHCO 3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 10,1 g i 100 ml Dih 2 O | oppbevar ved 4 ° C. |
| Fenolrødt 3,2 mM, 100x | Sigma | P5530 | 0,12 g i 100 ml Dih 2 O | oppbevar ved romtemperatur. |
Tabell 2. Lager løsning forberedelse og lagring for voksen mus kardiomyocytter isolasjon og kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den beste forberedelsen, de mest kritiske trinnene er: 1) umiddelbart trekke opp muse hjerte til kanylen etter eksisjon; 2) passende hjerte perfusjon. Vær også oppmerksom på at vannkvaliteten, perfusjon temperatur, pH i buffer, sterilisering, kjemisk renhet, og ren, ikke-forurenset tubing og kamre er også viktige faktorer. 18.2 mΩ molekylærbiologi-klasse H 2 O er sterkt anbefalt for buffer forberedelse. PH i 200 mM ATP stamløsning bør justeres til 7,2, et skritt som er lett savnet.
Det er viktig raskt identifisere aorta og å kutte like under dens første gren som vist ved Flynn 13.. For effektiv hook-up, er en egnet størrelse rustfritt stål kanyle med hakk og små taggete kryss klemme anbefales. Etter ligering, må spissen av kanylen være over aorta-ventilen for å hjelpe kollagenase fullt interagere med hjertevevet under koronar sirkulasjon. Noen ganger synes cellen avkastning stor i utgangspunktetmen mange celler er avrundet etter at kalsium-toleranse trinn. En forklaring er at koagulert blod i skipene ikke kan fjernes helt fra hjertet, noe som fører til utilstrekkelig fordøyelse. En annen mulighet er over fordøyelse av hjertet. Langvarig eksponering for collage reduserer myocyte kalsium-toleranse to. Ved dissosiasjon og kalsium gjeninnføring, er det også viktig å håndtere cardiomyocytes så skånsomt som mulig for å opprettholde myocyte levedyktighet.
I sammendraget, voksen cardiomyocyte kultur fra genmodifiserte mus er et kraftig verktøy for hjerteforskning. Imidlertid bør fremtidig arbeid huske den genetiske forskjellen mellom mennesker og gnagere ved tolkning resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Vi takker Mr. David Sowa for redigering av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
