Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Summary

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Abstract

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. No entanto, as plataformas atuais têm diferentes fatores limitantes, como o trabalho intensivo preparações de amostra, baixos limites de detecção, velocidades de varredura lenta, otimização de método intensivo para cada metabólito, e a incapacidade de medir tanto positivamente e íons negativamente carregados em experiências individuais. Portanto, um protocolo de metabolômica novela poderia avançar estudos metabolômica. Cromatografia hidrófilo à base de amida permite análise de metabolitos polares sem qualquer transformação química. MS de alta resolução usando o Q-Exactive (QE-MS) melhorou óptica de íons, o aumento da velocidade de varredura (256 ms na resolução 70.000), e tem a capacidade de realizar comutação positivo / negativo. Usando uma estratégia de extracção de metanol frio, e o acoplamento de uma coluna de amida com QE-MS permite a detecção robusta de 168 metabolitos polares alvo e milhares de características adicionais simultaneamente. Datum tratamento é realizado com um software comercialmente disponível de uma maneira altamente eficiente, e características desconhecidas extraídos a partir dos espectros de massa pode ser consultado na base de dados.

Introduction

Metabolomics, definido como um ensaio que mede vários metabolitos simultaneamente, tem sido uma área de grande interesse. Metabolomics fornece uma leitura direta da fisiologia molecular e forneceu insights sobre o desenvolvimento e doenças como o câncer de ^1-4. Ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) estão entre os mais utilizados instrumentos ^5-9. RMN, especialmente foi usado para experiências de fluxo desde que os compostos marcados de isótopos pesados, tais como ¹³ C metabolitos marcados, são RMN-activo ^10,11. No entanto, esta estratégia requer relativamente elevado grau de pureza da amostra e grande quantidade de amostra, o que limita as suas aplicações em metabolômica. Enquanto isso, os dados recolhidos a partir de RMN precisa de análise intensiva e atribuição composto de espectros de RMN complexo é difícil. GC-MS tem sido amplamente utilizada para os metabolitos polares e estudos de lípidos, mas requer os composto volátilds e, portanto, muitas vezes derivação de metabólitos, o que às vezes envolve química complexa que pode ser demorado e introduz ruído experimental.

Cromatografia líquida (LC) acoplada à espectrometria de massa triplo quadrupolo utiliza o primeiro quadrupolo para selecionar os íons pais intactos, que são fragmentados no segundo quadrupolo, enquanto o terceiro quadrupolo é usado para selecionar fragmentos característicos ou íons filha. Este método, que registra a passagem de íons de pais para filha íons específicos, é denominado de monitoramento de reações múltiplas (MRM). MRM é um método muito sensível, específico e robusto tanto para pequenas moléculas e quantificação de proteínas ^12-15,21. No entanto, MRM tem suas limitações. Para alcançar alta especificidade um método MRM precisa ser construído para cada metabólito. Este método consiste na identificação de um fragmento específico de energia de colisão e optimizado, o que requer conhecimento prévio do prope correspondentesrties dos metabólitos de interesse, tais como informações de estrutura química. Portanto, com algumas excepções que envolvem a perda neutra de fragmentos comuns, não é possível identificar metabolitos desconhecidos com este método.

Nos últimos anos, a espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) instrumentos foram lançados, como a série LTQ-Orbitrap e Exactive, o QuanTof e TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS pode proporcionar um rácio de massa para carga (m / z) de iões intactas dentro de um erro de poucos ppm. Portanto, um instrumento HRMS operado pela detecção de todos os iões de precursor (ou seja, modo de varrimento completo) pode obter informação estrutural directa da massa exacta e a composição elementar resultante da substância a analisar, e esta informação pode ser usada para identificar possíveis metabolitos. Com efeito, todas as informações sobre um composto pode ser obtido com uma massa exacta, até o nível de isómeros estruturais. Além disso, um completométodo de verificação não requer conhecimento prévio de metabólitos e não requer método de otimização. Além disso, uma vez que todos os íons com m / z cair na faixa de varredura pode ser analisado, HRMS tem uma capacidade quase ilimitada em termos de número de metabólitos que podem ser quantificados em uma única corrida em comparação com o método MRM. HRMS é também comparável ao de um MRM quadrupolo triplo da capacidade quantitativa devido ao ciclo de trabalho curto, resultando num número comparável de pontos de dados que podem ser obtidos de uma análise completa do MS. Portanto, HRMS proporciona uma abordagem alternativa para o metaboloma quantitativos. Recentemente, uma versão melhorada do HRMS denominada espectrometria de massa Q-Exactive (QE-MS) pode ser operado sob a comutação entre os modos positivos e negativos com tempos de ciclo suficientemente rápido em um único método, o que amplia o alcance de detecção ^19. Aqui nós descrevemos a nossa estratégia metabolômica usando o QE-MS.

Protocol

1. Preparação de LC-MS Reagentes, Estabelecimento de um método de cromatografia, e estabelecimento de procedimentos operacionais de instrumentos Preparação de solventes LC Prepare 500 ml fases móveis. A é acetato de amónio 20 mM e 15 mM de hidróxido de amónio em 3% de acetonitrilo / água, pH final de 9,0; e B é 100% de acetonitrilo. Vagamente tampar a garrafa, coloque-o em um banho de água sonicador e sonicate por 10 minutos sem aquecimento extra. (Este passo é o de assegurar …

Representative Results

A precisão dos dados metabolômica altamente depende do desempenho do instrumento LC-QE-MS. Para avaliar se o instrumento está a funcionar em boas condições, e se o método aplicado é adequado, vários picos LC metabolitos conhecidos são extraídos a partir da cromatografia iónica total de (TIC), como mostrado na Figura 1. Metabolitos polares, incluindo aminoácidos, intermediários glicólise , intermediários de TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, NADPH e assim por diante têm uma boa…

Discussion

Os passos mais críticos para perfilamento metabolito bem sucedida em células, utilizando este protocolo são: 1) o controlo do meio de crescimento e extracção cuidadosa das células; 2) ajustar o método de LC com base em MS configuração método para garantir que não são suficientes (geralmente pelo menos 10) pontos de dados em um pico para a quantificação; 3) fazer uma calibragem baixa massa antes de executar amostras; 4) a injecção de não mais do que 5 ml de evitar um tempo de retenção de deslocamento e…

Materials

Positive calibration mix	Thermo Scientific	#88323	It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix	Thermo Scientific	#88324	Store at 4 °C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert	Fisher Scientific	#1303200	This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column	Waters	#186004860	Guard column is recommend to increase column lifetime.