Summary
Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.
Abstract
Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. De huidige platforms verschillende beperkende factoren, zoals arbeidsintensief monster preparaten lage detectiegrenzen, langzame scan snelheden, intensieve methode optimalisatie voor elke metaboliet, en het onvermogen om zowel positief meten en negatief geladen ionen in enkele experimenten. Daarom kon een roman metabolomics protocol metabolomics studies te bevorderen. Amide-gebaseerde hydrofiele chromatografie maakt polaire metabolietanalyse zonder chemische derivatisering. Hoge resolutie MS met behulp van de Q-Exactive (QE-MS) is verbeterd ionenoptiek, verhoogde scansnelheden (256 msec bij een resolutie van 70.000), en heeft de mogelijkheid van het uitvoeren van positieve / negatieve schakelen. Met een koude methanol extractie strategie en koppelen van een amide-kolom met QE-MS maakt robuuste detectie van 168 gerichte polaire metabolieten en duizenden extra functies tegelijk. Dateen verwerking wordt uitgevoerd met in de handel verkrijgbare software uitgevoerd op een zeer efficiënte wijze en onbekende kenmerken geëxtraheerd uit de massaspectra worden opgevraagd in databases.
Introduction
Metabolomics, gedefinieerd als een experiment dat meerdere metabolieten meet tegelijk, heeft een gebied van intense belangstelling geweest. Metabolomics geeft een directe uitlezing van de moleculaire fysiologie en heeft inzicht in ontwikkeling en ziekte zoals kanker 1-4 verstrekt. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) behoren tot de meest gebruikte instrumenten 5-9. NMR name is gebruikt voor flux experimenten omdat zware isotoop gemerkte verbindingen zoals 13C gelabelde metabolieten zijn NMR-actieve 10,11. Echter, deze strategie vereist relatief hoge zuiverheid van het monster en de grote hoeveelheid van het monster, die haar toepassingen in metabolomics beperkt. Ondertussen, gegevens uit NMR moet intensieve analyse en samengestelde toewijzing van complexe NMR spectra moeilijk. GC-MS is op grote schaal gebruikt voor polaire metabolieten en lipide-studies, maar het vluchtige compoun vereistds en daardoor vaak derivatisering van metabolieten, die soms ingewikkelde chemie die tijdrovend zijn en introduceert experimentele noise.
Vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan triple quadrupool massaspectrometrie gebruikt de eerste quadrupool voor het selecteren van de intacte ouder ionen, die vervolgens worden gefragmenteerd in de tweede quadrupool, terwijl de derde quadrupool wordt gebruikt karakteristieke fragmenten of dochter ionen selecteren. Deze methode, waarbij de overgang van ouder ionen specifieke dochter ionen registreert, wordt meervoudige reactie controle (MRM) genoemd. MRM is een zeer gevoelig, specifiek en robuuste methode voor zowel kleine moleculen en eiwitkwantificering 12-15,21. Echter, MRM heeft wel zijn beperkingen. Om een hoge specificiteit te bereiken een MRM methode moet worden gebouwd voor elk metaboliet. Deze methode bestaat uit het identificeren van een bepaald fragment en bijbehorende geoptimaliseerde botsingsenergie, die pre-kennis van de prope vereistrties van de metabolieten van belang, zoals chemische structuur informatie. Daarom, met enkele uitzonderingen waarbij neutrale verlies gemeenschappelijke fragmenten, is het niet mogelijk om onbekende metabolieten identificeren met deze methode.
In de afgelopen jaren hebben een hoge resolutie (HRMS) instrumenten uitgebracht, zoals de LTQ-orbitrap en Exactive serie, de QuanTof en TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan een massa verschaffen verhouding (m / z) van intacte ionen rekening binnen een fout van enkele ppm. Daarom kan een HRMS instrument bediend door het detecteren alle precursorionen (dwz het volledige scan) directe structurele informatie te verkrijgen van de exacte massa en de resulterende elementaire samenstelling van het analyt, en deze informatie kan worden gebruikt om potentiële metabolieten identificeren. Inderdaad kunnen alle informatie over een verbinding worden verkregen met een exacte massa, tot het niveau van structurele isomeren. Ook een volledigscanmethode vereist geen voorkennis van de metabolieten en geen methode optimalisatie nodig. Aangezien alle ionen met m / z vallen in het scanbereik kan worden geanalyseerd HRMS een vrijwel onbeperkte capaciteit in termen van het aantal metabolieten die kunnen worden gekwantificeerd in een enkele run tegenover de MRM methode. HRMS is ook vergelijkbaar met een drievoudige quadrupool MRM kwantitatieve capaciteit vanwege de korte werkcyclus leidt tot een vergelijkbaar aantal gegevenspunten die worden verkregen in een volledige MS scannen. Daarom HRMS biedt een alternatieve benadering voor de kwantitatieve metabolomics. Onlangs is een verbeterde versie van HRMS genoemd Q-Exactive massaspectrometrie (QE-MS) kan in het schakelen tussen positieve en negatieve standen met voldoende snelle cyclustijden in een werkwijze, waarbij het detectiebereik 19 vergroot worden gebruikt. Hier beschrijven we onze metabolomics strategie met behulp van de QE-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van LC-MS reagentia, Oprichting van een Chromatography Method, en Oprichting van Instrument Operating Procedures
- Bereiding van LC Oplosmiddelen
- Bereid 500 ml mobiele fasen. A 20 mM ammoniumacetaat en 15 mM ammoniumhydroxide in 3% acetonitril / water, uiteindelijke pH 9.0; en B is 100% acetonitril.
- Losjes de dop op de fles, plaats het in een waterbad sonificator en ultrasone trillingen gedurende 10 min zonder extra verwarming. (Deze stap is ervoor te zorgen dat alle ammoniumzouten volledig oplost en dat er geen resterende luchtbellen.)
- Overdracht 250 ml oplosmiddel in een 250 ml glazen fles voor LC-MS gebruikt, en houdt de rest bij 4 ° C.
- Bereid de standaardoplossing lage massa bereik. Het is belangrijk om een aangepaste laag massabereik kalibratiemengsel metabolomics toepassingen zodat nauwkeurige massa worden gedetecteerd bij lage molecuulgewichten.
- Weeg 5 mg van beide Sodium fluoracetaat en homovanillinezuur en los ze in 5 ml water tot een eindconcentratie van 1 mg / ml te maken. Los diazinon in methanol tot een eindconcentratie van 10 mg / ml te maken.
- Voor te bereiden 1 ml van negatieve lage massa kalibratie-oplossing, meng 960 ml thermo negatieve kalibratie-oplossing met 20 ml van natrium fluoroaceate en homovanillinezuur oplossing. Aan 1 ml positieve lage massa kalibratie-oplossing, meng 990 ml thermo positieve kalibratie-oplossing en 10 ml diazinon oplossing. (De geringe massa ijkoplossing worden bewaard bij 4 ° C en worden vers bereid elke 2 maanden.)
- Kalibratie van QE-MS bij een geringe massa Range
- Voor het uitvoeren van lage massa bereik kalibratie, het uitvoeren van een standaard massa calibratie (m / z, 150-2,000) in zowel positieve als negatieve standen op basis van instructies van de fabrikant.
- Zodra een regelmatige massa calibratie geeft pas de scan bereik 60-900 m / z in het instrument bedieningspaneelen een bron CID van 25 eV voor positieve modus en 35 eV voor negatieve modus wordt toegepast. (Dit robuuste signalen van de cafeïne fragment ionen en sulfaationen geven. Het scanbereik hier is vastgesteld, omdat de laatste m / z niet groter dan 15x van het uitgangsmateriaal m / z moeten)
- Zodra de ionenbron is stabiel, voer vervolgens de aangepaste kalibratie. Opmerking: Een stabiele bron wordt gedefinieerd als minder dan 10% van de totale ionenstroom variatie in positieve modus, en minder dan 15% in de negatieve modus. De aangepaste kalibratie ionen en bijbehorende m / z zijn vermeld in tabel 1.
- Bepaal de LC-MS instrumentatie voor polaire metaboliet analyse. LC is gekoppeld met een QE-MS metaboliet scheiding en detectie.
- Rust de QE-MS met een verwarmde elektrospray ionisatie (H-ESI). Stel de relevante tuning parameters voor de sonde als opgesomd: heater temperatuur, 120 ° C; schede gas, 30; hulpgas, 10; sweep gas, 3; spuiten voltage, 3,6 kV voorpositieve modus en 2,5 kV voor negatieve modus. Stel de capillaire temperatuur 320 ° C en S-lens 55.
- Bouw een volledige scan methode als volgt: Volledige scan range: 60-900 (m / z); resolutie: 70.000; maximale injectie tijd: 200 msec met typische injectie tijden rond de 50 msec; Automatic Gain Control (AGC): 3.000.000 ionen. Deze instellingen resulteren in een duty cycle van ongeveer 550 msec om scans uit te voeren in zowel positieve als negatieve modus.
- Bepaal de chromatografie-methode. Gebruik van een amide-kolom (100 x 2.1 mm ID, 3,5 mm) voor verbinding scheiding bij kamertemperatuur 13,15. De mobiele fase A is zoals hierboven beschreven en mobiele fase B acetonitril. Gebruik een lineaire gradiënt als volgt: 0 min, 85% B; 1.5 min 85% B, 5,5 min, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 min, 35% B, 14.5 min, 35% B, 15 min, 85% B en 20 min, 85% B. De stroomsnelheid 0,15 ml / min 0-10 min en 15 tot 20 min en 0,3 ml / min 10,5-14,5 min.
2. Preparation van Metabolite Monsters
- Bereid een extractiemiddel. Meng 40 ml methanol (LC-MS grade) en 10 ml water (LC-MS) af in een 50 ml buis, en bewaar het op -80 ° C vriezer gedurende ten minste 1 uur voor gebruik. Opmerking: Deze procedure en de volgende stappen kunnen worden aangepast voor de extractie van biologisch weefsel en vloeistofmonsters.
- Cultuur darmkanker HCT 8 cellen in drie 10 cm schalen of 6-well platen vol groeimedium, RPMI 1640 aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum en 100.000 eenheden / l penicilline en 100 mg / l streptomycine.
- Wanneer de cellen te bereiken 80% confluentie, snel te verwijderen van het medium, en plaats de schaal of bord op de top van droogijs 13,15. Voeg 1 ml extractievloeistof onmiddellijk (80% methanol / water), en breng de plaat om de -80 ° C vriezer. Voor een 10 cm schaal, voeg 3 ml extractieoplosmiddel aan elk putje. (Proberen om het medium te verwijderen zoveel mogelijk het ion onderdrukking effect door restzouten van medium te voorkomen.)
- Laat de plaat gedurende 15 minuten. Haal hem uit de diepvries en schraap cellen in het oplosmiddel op droog ijs. Breng de oplossing 1,7 ml Eppendorf buisjes en centrifugeer met de snelheid van 20.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. (Bereid cel metabolieten uit drie afzonderlijke gerechten tot drie gelijke monsters te maken. Het doel van het houden van twee buizen is een als back-up.)
- Breng de bovenstaande twee nieuwe Eppendorf buizen, en droog ze in een snelheid vacuüm. Dit duurt ongeveer 3-6 uur afhankelijk van de snelheid vacuüm gebruikt. (De monsters kunnen ook 's nachts gedroogd onder stikstofgas.)
- De droge buizen van elk monster in de -80 ° C vriezer. Als u klaar bent, Los een monster in 20 ml water (LC-MS graad), en injecteer 5 ml tot LC-QE-MS voor analyse.
3. Instellen van Sample Sequence
- Zodra de kalibratie correct is uitgevoerd op de QE-MS uitgevoerd, evenwicht LC kolom voor 5 min met 85% A met een stroomsnelheidsnelheid van 0,15 ml / min, hetgeen de begintoestand van de LC gradiënt.
- Het opzetten van de reeks monsters in willekeurige volgorde. Opmerking: Zo distribueert fluctuaties die door de LC-MS aan elk monster en zorgt nauwkeurigere vergelijking tussen verschillende monsters. Elke 6 monsters, voeg een was run, die dezelfde MS-methode deelt, behalve de LC gradiënt 95% A gedurende 10 min, gevolgd door een 5 minuten kolomequilibratiebuffer bij 85% A met een stroomsnelheid van 0,15 ml / min. Voeg blanco monsters (100% water) na elke wasbeurt run om het systeem achtergrond beoordelen en overdracht niveaus.
- Sla de volgorde en zodra de LC kolom toont stabiele druk, ongeveer 400 psi, start de reeks run. Als er geen andere monster worden uitgevoerd nadat deze volgorde, voeg dan een stop vrij aan het einde van de sequentie, die een stroomsnelheid van 0 ml / min in het einde van de gradiënt heeft en kies "standby" na beëindiging volgorde.
- Herstart het hetzelfde monster set 12 uur na de kalibratie. (Dit is om de massa fout fluctuatie beoordelen na kalibratie.)
4. Bericht Analyse Instrument Onderhoud
- Eind sequentie Was de kolom met 95% A bij een stroomsnelheid van 0,2 ml / min gedurende 2 uur, en eventueel omkeren van de kolom voor het wassen.
- Verwijder de kolom LC en LC rechtstreeks aansluiten op de ionenbron door een vakbond. Bereid reinigingsmiddel, water / methanol / mierenzuur (v: v: v, 90:10:0.2), ingesteld MS standby-modus en wash LC-MS systeem met een stroomsnelheid van 0,1 ml / min gedurende 1 uur verwijderen de resterende neergeslagen zouten of andere verontreinigingen. Laat de stroomsnelheid als er te veel systeemdruk.
- Stel de capillaire temperatuur op 50 ° C, en verwijder het ion kooi. Verwijder voorzichtig het ion sweep kegel en het ion verbindingsbuis na de capillaire temperatuur daalt tot 50 ° C. Gebruik een ruwe maas, zoals schuurpapier, om onzuiverheden op het oppervlak van het ion sweep kegel verwijderen.
- Plaats de ion overdrachtbuis in een 15 ml Falcon buis met 10 ml 90% water / methanol met 0,1% mierenzuur. Na sonicating de buis in een waterbad sonicator gedurende 20 minuten, giet het oplosmiddel binnen, te vervangen door 10 ml pure methanol en ultrasone trillingen nog eens 20 minuten. (Indien nodig kan de sonicatie worden uitgevoerd bij 40 ° C of een nog hogere temperatuur een betere reiniging te bereiken.)
Analyse van LC-MS-gegevens 5.
- Om het monster volgorde te laten verlopen, na het beëindigen van de eerste twee monsters in de reeks, kijk pieken voor onbekende metabolieten. Gebruik een CSV-bestand lijst metaboliet namen, neutrale chemische formule en de detectie-modus (positief of negatief), als de input-bestand, en de output bestand bevat uitgepakt pieken en massa fout in ppm. Als de vorm van de piek abnormaal of massa fout uit meer dan 5 ppm, dan de rest van de sequentie moet worden gestopt en probleemoplossing moet worden gedaan.
- Kies de methode van de "piek alignmenten frame extractie "op de handel verkrijgbare software. Selecteer ruwe data van LC-MS en groeperen. Kies monsters in het midden van de run volgorde zoals chromatografie referentiemonster voor piek uitlijning. Upload een frame zaad met inbegrip van bekende metabolieten voor de gerichte metabolieten analyse met gegevens verzameld en de bijbehorende kader zaad.
- Voer data-analyse in positieve en negatieve modus afzonderlijk. Gebruik de standaardinstelling voor andere parameters. Schakel de database zoekfunctie en uitvoeren van de workflow. De verwerkte gegevens exporteren als een Excel-blad met piekoppervlak van elk frame. De eerste sets van frames komen overeen met de metabolieten in de gerichte lijst. Opmerking: Voor een gerichte metabolietanalyse, wordt de metabolieten verkregen informatie gebaseerd op eerdere studies 13,15.
- Voor een ongerichte metabolietanalyse, kies de methode van "component winning". Laad blanco monsters voor achtergrond aftrekken. Stel piek intensiteit drempel eent 10 5, m / z breedte van 10 dpm en signaal-ruis verhouding van 3.
- Gebruik menselijke metabolome databank voor onbekende verbindingen identificatie. Gebruik een CV filter om de componenten met grote cv's binnen identieke monsters te verwijderen. Handmatig doen via elk onderdeel en pak die met goed gedefinieerde piek of relatief groot verschil in verschillende monsters types voor database-search. Exporteer gegevens met hits in de database. (Peak uitlijning kan worden overgeslagen als de piek uitlijning score is te laag.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De nauwkeurigheid van metabolomics data is sterk afhankelijk van de prestaties van LC-QE-MS instrument. Om te bepalen of het instrument werkt in goede staat en of de toegepaste methode worden er ook verscheidene bekende metaboliet LC pieken uit het totale ionchromatografie (TIC), zie figuur 1. Polaire metabolieten, zoals aminozuren, glycolyse tussenproducten , TCA tussenproducten, nucleotiden, vitamines, ATP, NADP + en ga zo maar door hebben goede retentie op de kolom en goede piekvormen in de kolom amide onder de huidige LC omstandigheden. Ondertussen wordt een massa foutentest uitgevoerd binnen 24 uur na lage massa calibratie, zie figuur 2. 6 verschillende concentraties van monsters in drievoud worden tweemaal uitgevoerd na ijking en het hele tijdspanne omvat bijna 24 uur. De massa fout wordt beoordeeld door de gedetecteerde m / z de theoretische m / z gerichte metabolieten. Hier de beoogde metabolieten een m / ztussen 74 (glycine) tot 744 (NADP +). De Y-as vertegenwoordigt hier de cumulatieve percentage van metabolieten binnen bepaalde massa fout bereik. De blauwe curve toont het resultaat 0-12 uur, terwijl de rode curve toont de verzamelde 12-24 uur data. Figuur 2 geeft duidelijk aan dat meer dan 90% van de metabolieten zijn binnen 5 ppm massa fout, wat betekent dat de lage massa bereik kalibratie methode die hier ontwikkeld is voldoende om 5 ppm massa fout behouden voor lage massa range detectie.
Een andere kwestie die moet worden aangepakt, is de gevoeligheid van het instrument met de huidige methode en instelling instrument. Een seriële verdunning van drievoudige monsters van 10 cm Petrischaal werd 5 maal uitgevoerd met een verdunningsfactor van 6, eindigend met 6 verschillende concentraties van monsters. Deze monsters vertegenwoordigen de hoeveelheid metabolieten gewonnen uit 10 7 1,67 x 10 6, 2,78 x 10 5, 4,63 x 10 4, 7,72 x 10 3 en 1.293 x 10 cellen, respectievelijk. Aangezien elke concentratie monster wordt bereid in drievoud totaal 18 monsters geanalyseerd LC-QE-MS. Een gerichte lijst wordt gebruikt om het aantal metabolieten gedetecteerd beoordelen met verschillende concentratie van het monster. Het resultaat in figuur 3 geeft aan dat het optimale aantal gerichte metabolieten waargenomen tussen 2,78 x 10 5 en 1,67 x 10 6 cellen, terwijl 1 x 10 7 cellen bevatten een kleiner aantal gedetecteerde metabolieten, die door ion-onderdrukking. Dit resultaat geeft aan dat de optimale hoeveelheid cellen uittreksel van deze analyse is ongeveer die van een putje van een 6-wells plaat.
Voor ongerichte metabolietanalyse, CV cutoff van 20% en een gemiddelde intensiteitswaarde van 10 7 wordt gebruikt om de lijst Filter. Deze stijve CV en gemiddelde intensiteit drempelwaarden voor deze demonstratie doel. Om reproduceerbaarheid te verbeteren, kan CV cutoff waardenverhoogd (bijvoorbeeld 30%), terwijl de gemiddelde intensiteitswaarden moeten worden verlaagd (bijvoorbeeld 10 5) meer pieken omvatten. Na het handmatig controleren van pieken, worden componenten met goede vormen geselecteerd en gezocht in de menselijke metabolome databank. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 2. Tabel 2A geeft de resultaten van gegevens in positieve modus verzameld, terwijl tabel 2B toont de resultaten van negatieve modus. Enkele metabolieten hier geïdentificeerd overlappen metabolieten in de gerichte lijst, zoals glutathion, proline en dergelijke, maar ondertussen andere metabolieten afwezig bij de gerichte lijst worden onderzocht, zoals methyglyoxal, die kan worden afgeleid van de glycolyse en 1 -palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, die wordt gedetecteerd in positieve met een retentietijd van 3,2 min., wat een redelijk retentie voor fosfolipiden van een amide kolom. Een protocol op ongerichte metaboliet zoeken in databanken is pr geweesteviously gemeld 20.
Figuur 1. Voorbeelden van LC-MS chromatografie pieken. Hier de gereconstrueerde chromatografie wordt gemaakt met een massa raam van 10 ppm (m / z ± 5 ppm). De X-as geeft de retentietijd, terwijl de Y-as geeft de relatieve intensiteit, en de piek intensiteit is genoteerd boven elke metaboliet. A toont pieken gedetecteerd positieve modus, terwijl B toont pieken van negatief-modus. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. 60;. Evaluatie van lage massa bereik kalibratie De Y-as is het cumulatieve percentage van metabolieten met massa detectie fout binnen 5 ppm. De X-as is de massa fout bereik in ppm. Blauwe en rode curves 0-12 uur en 12-24 uur, respectievelijk. Klik hier voor grotere afbeelding.
. Figuur 3 Evaluatie van de hoeveelheid monster -. Aantal gerichte metabolieten gedetecteerd versus aantal HCT 8 cellen Rode vierkantjes vertegenwoordigen metabolieten gedetecteerd in positieve modus, blauwe cirkels betekenen metabolieten gemeten in negatieve modus, en de zwarte driehoeken zijn de totale aantallen van metabolieten van zowel positieve en negatieve modus. De X-as geeft het aantal HCT 8 cellen.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
| Standaarden | M / Z, positieve modus | M / Z, negatieve modus | Neutrale formule | Neutrale massa |
| n-butylamine | 74.096425 | NA | C 4 H 11 N | 73.089149 |
| Cafeïne fragment | 138.066188 | NA | C 6 H 8 N 3 O | 137.058912 |
| Cafeïne | 195.087652 | NA | C 8 H 11 N 4 O 2 | 194.080376 |
| Diazinon | 305.108329 | NA | C 12 H 20 N 2 O 3 PS | 304.101053 |
| MRFA peptide | 524.264966 | <td> NAC 23 H 37 N 7 O 5 S | 523,25769 | |
| Fluoracetaat | N / A | 77.004432 | C 2 H 3 2 FO | 78.011708 |
| Sulfaat | N / A | 96.960106 | H 2 SO 4 | 97.967382 |
| Homovanillinezuur | N / A | 181.050634 | C 9 H 10 O 4 | 182,05791 |
| Dodecyl sulfaat | N / A | 265.147906 | C 12 H 26 SO 4 | 266.155182 |
| Taurocholaat | N / A | 514.2844 | C 26 H 45 NO 7 S | 515.291676 |
Tabel 1. Lage massa bereik kalibratie standaarden en hun exacte m / z.
| CSID | Naam | Formule | Monoisotoop Massa | Zoek Massa | Fout (ppm) | RT (min.) |
| 234 | beta-alanine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04805 | 0,62 | 8.08 |
| 1057 | Sarcosine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4.22 | 8.08 |
| 5735 | alanine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4.22 | 8.08 |
| 568 | Creatinine | C 4 H 7 N 3 O | 113,05900 | 113,05889 | 1.00 | 4,41 |
| 128566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06338 | 0,41 | 7.54 |
| 6050 | L-(+)-valine | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0.18 | 7.42 |
| 7762 | Amylnitriet I | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0.18 | 7.42 |
| 135 | 5-amino valeriaanzuur | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7.42 |
| 242 | trimethylglycine | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7.42 |
| 911 | Niacinamide | C6H6N2O | 122,04800 | 122,04793 | 0,55 | 2.60 |
| 1091 | Taurine | C 2 H 7 NO 3 S | 125,01466 | 125,01469 | 0.20 | 7.61 |
| 1030 | Pyrroline hydroxycarbonzuur | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 7127 | PCA | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 90.657 | N-Acryloylglycine | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 388752 | 5-oxo-D-proline | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 389257 | 3-Hydroxy-3 ,4-dihydro-2H-pyrrool-5-carbonzuur | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 8031176 | Pyrrolidonecarboxylic zuur | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.03 | 8.51 |
| 5605 | Hydroxyproline | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | <td> 131,059015,83 | 8.08 | |
| 79.449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 167744 | l-glutaminezuur-gamma-semialdehyde | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 388519 | 5-Amino-2-oxopentaanzuur | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 134 | Aminolevulinezuur | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 </ Td> | 7.70 | 8.08 |
| 9312313 | 3-hydroxy-L-proline | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 | 7.70 | 8.08 |
| 566 | Creatine | C 4 H 9 N 3 O 2 | 131,06900 | 131,06905 | 0.36 | 8.08 |
| 5880 | L-(+)-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 6067 | L-(+)-isoleucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 19.964 | L-norleucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6.96 </ Td> |
| 388796 | beta-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 548 | Aminocapronzuur | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09455 | 3,48 | 6,96 |
| 6031 | L-(-)-Asparagine | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05348 | 0.10 | 8.31 |
| 109 | Ureidopropionic zuur | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05348 | 3.71 | 8.31 |
| 6026 | L-Ornithine | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0.02 | 10.37 |
| 64.236 | D-Ornithine | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0.02 | 10.37 |
| 5746 | Glutamine | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0.93 | 8.25 |
| 128633 | D-Glutamine | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0.93 | 8.25 |
| 141172 | Ureidoisobutyric zuur | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0.93 | 8.25 |
| 21436 | N-Methyl-<scp> D </ scp>-asparaginezuur | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 21.814 | D-(-)-glutaminezuur | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 30.572 | L-(+)-glutaminezuur | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 58.744 | N-Acetyl-L-serine | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 5907 | L-(-)-methionine | C 5 H 11 NO 2 S | 149,05106 | 149,05095 | 0.70 | 7.39 |
| 6038 | Histidine | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06940 | 0.48 8,33 | |
| 5910 | L-(-)-fenylalanine | C 9 H 11 NO 2 | 165,07898 | 165,07887 | 0,63 | 6.60 |
| 1025 | Pyridoxine | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 4463 | Oxidopamine [USAN: INN] | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 102750 | 5 - (2-aminoethyl)-Pyrogallol | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 388394 | Noradrenaline | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 6082 | L-(+)-Arginine | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1.39 | 10.77 |
| 64.224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1.39 | 10.77 |
| 780 | heteroauxin | C 10 H 9 NO 2 | 175,06300 | 175,06304 | 0.18 | 2,32 |
| 67.261 | Indole-3-aceetaldehyd, 5-hydroxy- | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1.65 | 2,32 |
| 3574185 | Indool-2-AZIJNZUUR | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1.65 | 2,32 |
| 5833 | L-(-)-Tyrosine | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 389285 | 3-Amino-3-(4-hydroxyfenyl) propaanzuur | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 13628311 | L-threo-3-fenylserine | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 425 | 4-hydroxy-4-(3-pyridyl) butaanzuur | C 9 H 11 NO 3 | 181,07401 | 181,07378 | 1.25 | 7,48 |
| 13899 | 3 - (1H-indool-3-yl) acrylzuur | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0.15 | 6.44 |
| 10607876 | Indolacrylzuur | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0.15 | 6.44 |
| 389120 | N6, N6, N6-trimethyl-L-lysine | C 9 H 20 N 2 O 2 | 188,15248 | 188,15221 | 1.45 | 10.87 |
| 388321 | 5 "-S-methyl-5"-thioadenosine | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,08957 | 297,08898 | 2,00 | 2,56 |
| 144 | 9 - (5-s-methyl-5-thiopentofuranosyl)-9H-purine-6-amine | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,09000 | 297,08898 | 3,43 | 2,56 |
| 111188 | Glutathion | C 10H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08345 | 1.14 | 8.02 |
Tabel 2A.
| CSID | Naam | Formule | Monoisotoop Massa | Zoek Massa | Fout (ppm) | RT (min.) |
| 857 | Methylglyoxaal | C 3 H 4 O 2 | 72,02100 | 72,02108 | 1.03 | 7.70 |
| 1057 | Sarcosine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2.33 | 8.19 |
| 5735 | alanine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2.33 | 8.19 |
| 234 | beta-alanine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04747 | 5.93 | 8.19 |
| 55423 | R-melkzuur | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2.91 | 5.12 |
| 61.460 | Hydroxypropionzuur | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2.91 | 5.12 |
| 96.860 | L-(+)-melkzuur | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2.91 | 5.12 |
| 592 | Melkzuur | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 650 | Dihydroxyaceton | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 731 | Glyceraldehyde | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 1086 | Zwavelzuur | H 2 O 4 S | 97,96738 | 97,96683 | 5.63 | 8.13 |
| 128566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06302 | 2.67 | 7.78 |
| 1078 | Barnsteenzuur | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7.72 |
| 466979 | Erythrono-1 ,4-lacton | C4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7.72 |
| 4483398 | D-Erythronic g-lacton | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7.72 |
| 473 | Methylmalonzuur | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5.96 | 7.72 |
| 8527138 | (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-on | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5.96 | 7.72 |
| 140384 | 2-ketocaproic zuur | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 164251 | Methyloxovaleric zuur | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 388419 | (3S)-3-methyl-2-oxopentaanzuur | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 15642233 | Ketoleucine | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 46 | a-Oxo-b-methylvaleriaanzuur | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2.36 | 2.35 |
| 69 | Alpha-ketoisocaproic zuur | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2.36 | 2.35 |
| 134 | Aminolevulinezuur | 131,05800 | 131,05795 | 0.36 | 8.19 | |
| 9312313 | 3-hydroxy-L-proline | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05795 | 0.36 | 8.19 |
| 5605 | HYDROXYPROLINE | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 79.449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 167744 | l-glutaminezuur-gamma-semialdehyde | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 388519 | 5-Amino-2-oxopentaanzuur | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 5880 | L-(+)-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 6067 | L-(+)-isoleucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 19.964 | L-norleucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 388796 | beta-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 548 | Aminocapronzuur | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09419 | 6.18 | 7.09 |
| 109 | Ureidopropionic zuur | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05321 | 1.60 | 8.28 |
| 6031 | L-(-)-Asparagine | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05321 | 2.21 | 8.28 |
| 6026 | L-Ornithine | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10.36 |
| 64.236 | D-Ornithine | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10.36 |
| 193317 | L-(-)-appelzuur | C 4 H 6 O 5 | 134,02153 | 134,02130 | 1.72 | 7.95 |
| 510 | (±)-Appelzuur | C 4 H 6 O 5 | 134,02200 | 134,02130 | 5.25 | 7.95 |
| 133224 | threonic zuur | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7.70 |
| 388628 | 2,3,4-Trihydroxybutanoic zuur | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7.70 |
| 2061231 | DL-erythronic zuur | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7.70 |
| 21436 | N-Methyl-<scp> D </ scp>-asparaginezuur | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 21.814 | D-(-)-glutaminezuur | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 30.572 | L-(+)-glutaminezuur | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 58.744 | N-Acetyl-L-serine | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 6038 | Histidine | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06930 | 1.09 | 8.36 |
| 199 | Allantoïne | C 4 H 6 N 4 O 3 | 158,04401 | 158,04387 | 0,88 | 4,76 |
| 6082 | L-(+)-Arginine | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0.80 | 10.76 |
| 64.224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0.80 | 10.76 |
| 58.576 | N-Acetyl-L-asparaginezuur | C 6 H 9 NO 5 | 175,04807 175,04803 | 0.18 | 7.87 | |
| 996 | Pyrofosforzuur | H 4 O 7 P 2 | 177,94299 | 177,94331 | 1.79 | 8.42 |
| 5589 | Glucose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17893 | Mannose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 58.238 | . ß-D-Glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 71.358 | . A-D-Glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 134838 | 3-deoxy-arabino-print je favoriete acid | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388332 | L-Sorbopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388476 | beta-D-galactopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388480 | . A-D-galactopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388775 | beta-D-Fructofuranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 7,53 | |
| 10239179 | Inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 16736992 | Cis-inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216070 | allose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216093 | L-Sorbose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 201 | hexopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 868 | 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 2068 | Theofylline | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 4525 | 1,7-dimethyl-xanthine | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 5236 | Theobromine | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 1161 | isocitroenzuur | C 6 H 8 O 7 | 192,02701 | 192,02704 | 0.15 | 8.18 |
| 305 | Citric zuur | C 6 H 8 O 7 | 192,02699 | 192,02704 | 0.23 | 8.18 |
| 963 | pantotheenzuur | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6.72 |
| 6361 | D-pantotheenzuur | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6.72 |
| 960 | palmitinezuur | C 16 H 32 O 2 | 256,23999 | 256,24000 | 0.05 | 1,73 |
| 111188 | Glutathion | C 10 H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08339 | 1.35 | 8.03 |
| 388337 | N-acetylneuraminezuur | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7.43 | |
| 392681 | N-acetyl-alfa-neuraminezuur | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7.43 |
| 392810 | Siaalzuur Neu5Ac | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7.43 |
Tabel 2B.
. Tabel 2 Lijst van ongerichte metabolieten gedetecteerd in HCT 8 cellen (2,78 x 10 5 cellen gelijkwaardigheid) tabel 2A en 2B bevatten componenten extractie informatie:. Retentietijd, m / z en massa fout, en ondertussen, databank zoekresultaten: Farmacotherapeutisch Kompas ID ( CSID), naam, formule, enzovoort. Hier de geanalyseerde monsters zijn vergelijkingenl tot metabolieten onttrokken 2,78 x 10 5 cellen, en de intensiteit drempel is 1 x 10 7 tot vervelende resultaat voor demonstratie doel te vermijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen voor een succesvolle metaboliet profilering in cellen met dit protocol zijn: 1) het regelen van het groeimedium en zorgvuldige extractie van de cellen; 2) het aanpassen van de LC-methode gebaseerd op methode setup MS om te zorgen voor voldoende (meestal minstens 10) datapunten over een piek voor kwantificering; 3) het doen van een lage massa calibratie voordat u monsters; 4) het injecteren van niet meer dan 5 ml om te voorkomen retentietijd verschuiven en piekverbreding veroorzaakt door water; en 5) de voorbereiding en uitvoering monsters voor vergelijking in de zelfde partij tot partij effecten te minimaliseren.
De normen (tabel 1) hier gekozen voor lage massa bereik kalibratie zijn uitwisselbaar. Elke bekende verbinding met m / z dat valt in het bereik massa scan is goed gedragen in een H-ESI bron en is oplosbaar in water, methanol of acetonitril redelijk kandidaten voor kalibratiestandaard. Het wordt sterk aanbevolen om alle ijkoplossingen een te slaant 4 ° C cafeïne stabiliseren en ook de verdamping van methanol of acetonitril minimaliseren de ijkoplossing zodat de kalibratie prestaties beter reproduceerbaar zijn. Vergelijking met een gewone massabereik, m / z van 150 tot 2000, lage massa bereik kalibratie moet vaker worden gedaan, ten minste eenmaal per twee dagen.
Deze workflow, van extractie-oplosmiddel, reconstitutie oplosmiddel, LC mobiele fase, te lage massa bereik kalibratie en MS scan bereik is geoptimaliseerd om polaire metabolieten te meten. Dit omvat aminozuren, acetyl aminozuren, glycolyse route tussenproducten, nucleosiden, TCA cyclus tussenproducten, iemand-koolstofmetabolisme pathway intermediairen enzovoort. Echter, wijzigingen van dit protocol voor andere klassen van metabolieten, zoals co-enzym A (CoA) soorten, foliumzuur, fosfolipiden zijn mogelijk. Zo CoA stabieler onder zure omstandigheden, zodat de toevoeging van een zuur aan 80% methanol / water nuttig verbRove CoA gevoeligheid. Ook CoA's en lipiden de neiging om veel grote moleculaire gewichten hebben, dus moet de scan bereik m / z worden aangepast 60-900 naar het juiste bereik die deze metabolieten zal dekken.
Hoewel sommige van de niet-gerichte component databank zoekresultaten overlappen met de gerichte lijst, is het nog steeds van belang voor deze gerichte lijst op basis van het onderzoek prioriteit te bouwen. Sinds de metabolieten in de beoogde lijst zijn lager dan de gemiddelde intensiteit drempel, zal informatie over deze metabolieten tijdens de verwerking worden verwijderd. De gerichte lijst omvat de retentietijd informatie, die ons meer vertrouwen voor de identificatie en kwantificatie metaboliet geeft. Een extra voordeel van de QE-MS opstelling is dat tandem massaspectrometrie kunnen zorgen voor een verdere identificatie van metabolieten.
Een probleem in verband met deze workflow is dat de H-ESI naald insert is gevoelig voor het zoutgehalte van de monsters, de gevoeligheid zal sterk worden aangetast indien er grote hoeveelheden niet-vluchtige zouten. Daarom zal het minimaliseren van zoutgehalte van monsters, en normale reiniging van de kolom en de H-ESI naald insert nuttig zijn om te zorgen voor een goede kwaliteit van de gegevens en de levensduur van de kolom te verhogen.
Kortom, dit protocol maakt gebruik van LC-QE-MS naar polaire metabolieten succesvol analyseren van gekweekte cellen, met een minimale monstervoorbereiding stappen en snelle data-acquisitie. Kleine modificaties in de monstervoorbereiding worden uitgevoerd om gegevens uit andere biologische bronnen, zoals serum en weefsel te verkrijgen. Bijvoorbeeld, omdat zuivere methanol kan worden toegevoegd aan vloeibare serum toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie methanol te brengen in 80% van polaire metabolieten extractie. Voor weefselmonsters, is strikte roeren en mengen moeten een betere extractie efficiëntie. Meestal 10 ml serum of1 mg weefsel is voldoende voor metabolieten analyse. De ruwe data worden geanalyseerd zowel in gerichte stand, als er bekend metabolieten in de monsters, en een niet-gerichte wijze gevolgd door HRMS zoeken in gegevensbanken. HRMS gebaseerde metabolomics is nog in een vroeg stadium. Voor toekomstige ontwikkelingen kan de experimentele technieken verder geoptimaliseerd aanvullende metaboliet HRMS informatie en MS / MS fragmentatie patronen nuttig en relevante algoritmen, zoals uitlijning piek, piek integratie isotoop clustering en dergelijke, kan de efficiëntie en nauwkeurigheid verbeteren gegevensverwerking. Uiteindelijk, echter veel van de vragen die ons lab adressen in de stofwisseling worden beperkt door zorgvuldige interpretatie van de gegevens na verwerking. Met deze grote metabolomics technieken, zijn we vaak beperkt door onze interpretatie van de gegevens en evaluatie hypothesen gegenereerd. Daarom moeten alle metabolomics experimenten worden geformuleerd rond specifieke vragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) en Nathaniel Snyder (Universiteit van Pennsylvania) erkennen voor waardevolle discussies over massa calibratie en dataverwerking. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health Award onder nummer R00CA168997. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
