Summary
Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung.
Abstract
Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Allerdings haben aktuelle Plattformen verschiedene limitierende Faktoren, wie arbeitsintensive Probenvorbereitungen, niedrige Nachweisgrenzen, langsamen Scan-Geschwindigkeiten, intensive Methodenoptimierung für jeden Metaboliten, und die Unfähigkeit, sowohl positiv messen und negativ geladenen Ionen in einzelnen Experimenten. Daher könnte ein Roman Metabolomics-Protokoll Metabolomics-Studien voranzubringen. Amid-Basis hydrophilen Chromatographie ermöglicht polare Metabolitenanalyse ohne chemische Derivatisierung. Hochauflösende MS mit der Q-Exactive (QE-MS) hat Ionenoptik verbessert, erhöhte Scan-Geschwindigkeiten (256 ms bei einer Auflösung von 70.000), und hat die Fähigkeit der Durchführung von positiven / negativen Schalt. Mit einem kalten Methanol-Extraktionsstrategie und Koppeln eines Amid-Säule mit QE-MS ermöglicht robuste Detektion von 168 gezielte polaren Metaboliten und Tausende von zusätzlichen Funktionen gleichzeitig. Dateine Verarbeitung wird mit im Handel erhältlichen Software in sehr effizienter Weise durchgeführt, und unbekannte Funktionen aus den Massenspektren extrahiert können in Datenbanken abgefragt werden.
Introduction
Metabolomics, definiert als ein Experiment, das mehrere Metabolite gleichzeitig misst, hat eine Fläche von großem Interesse. Metabolomics bietet eine direkte Auslesen der molekularen Physiologie und hat Einblicke in Entwicklung und Krankheit wie Krebs 4.1 zur Verfügung gestellt. Kernspinresonanz (NMR) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) gehören zu den am häufigsten verwendeten Instrumente 5-9. NMR, vor allem für Fluss Experimente seit schweres Isotop markierten Verbindungen, wie 13 C-markierten Metaboliten verwendet wurde, sind NMR-aktiven 10,11. Diese Strategie erfordert jedoch relativ hohe Probenreinheit und großen Probenmenge, die ihre Anwendungen in der Metabolomics begrenzt. Inzwischen Daten aus NMR gesammelt braucht intensive Analyse und Zuordnung der komplexen Verbindung NMR-Spektren ist schwierig. GC-MS wurde weithin für Polar-und Lipidstoffwechselstudien verwendet, aber es erfordert flüchtigen Compounds und daher oft Derivatisierung von Metaboliten, die manchmal mit komplexen Chemie, die zeitaufwendig sein kann und führt experimentelle Rauschen.
Flüssigkeitschromatographie (LC), um Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie verwendet den ersten Quadrupol zum Auswählen der intakten Elternionen, die dann in der zweiten Quadrupol fragmentiert werden, während der dritte Quadrupol wird verwendet, um charakteristische Fragmente oder Folgeionen zu wählen. Diese Methode, die den Übergang von der Mutterionen zu bestimmten Tochterionen erfasst wird multiple reaction monitoring (MRM) bezeichnet. MRM ist eine sehr empfindlich, spezifisch und robuste Methode sowohl für Kleinmolekül-und Protein-Quantifizierung 12-15,21. Allerdings MRM hat seine Grenzen. Um eine hohe Spezifität zu erreichen ein MRM-Methode muss für jeden Metaboliten gebaut werden. Dieses Verfahren besteht aus der Identifizierung eines spezifischen Fragments und entsprechend optimierten Kollisionsenergie, die vor der Kenntnis der prope erfordertrties der Metaboliten von Interesse, wie die chemischen Strukturinformation. Daher, mit einigen Ausnahmen, die die neutralen Verlust von gemeinsamen Fragmenten, ist es nicht möglich, unbekannte Metaboliten mit dieser Methode zu identifizieren.
In den letzten Jahren haben die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) Instrumente veröffentlicht worden, wie der LTQ-Orbitrap und Exactive Serie, die QuanTof und TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kann eine Masse bereitzustellen Verhältnis (m / z) von intakten Ionen innerhalb eines Fehlers von einigen ppm berechnen. Daher kann eine HRMS Instrument der Erfassung aller Vorläuferionen (dh Scan-Modus) betrieben direkte Strukturinformation von der exakten Masse und der daraus resultierenden elementaren Zusammensetzung des Analyten zu erhalten, und diese Informationen können verwendet werden, um potentiellen Metaboliten zu identifizieren. In der Tat können alle Informationen über eine Verbindung mit einer exakten Masse erhalten werden, bis auf die Ebene der strukturellen Isomere. Auch eine VollScan-Methode erfordert keine Vorkenntnisse von Metaboliten und nicht Methodenoptimierung erfordern. Darüber hinaus, da alle Ionen mit m / z in den Scan-Bereich fallen, kann analysiert werden, hat HRMS eine nahezu unbegrenzte Kapazität in Bezug auf die Anzahl der Metaboliten, die in einem einzigen Lauf quantifiziert kann im Vergleich zu der MRM-Methode werden. HRMS ist auch vergleichbar mit einem Triple-Quadrupol-MRM in der quantitativen Kapazität aufgrund der kurzen Arbeitszyklus, was zu einer vergleichbaren Anzahl von Datenpunkten, die in einem Voll MS erhalten werden, können zu scannen. Daher stellt HRMS einen alternativen Ansatz für die quantitative Metabolomics. Vor kurzem hat eine verbesserte Version des HRMS bezeichnet Q-Exactive Massenspektrometrie (QE-MS) können unter dem Wechsel zwischen positiven und negativen Arten mit ausreichend schnellen Zykluszeiten in einer einzigen Methode, die den Erfassungsbereich 19 erweitert betrieben werden. Hier beschreiben wir unsere Metabolomics-Strategie mit der QE-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von LC-MS-Reagenzien, Einrichtung einer Chromatographie-Methode und Einrichtung von Instrumenten Operating Procedures
- Herstellung von LC-Lösungsmittel
- Bereiten 500 ml mobilen Phasen. Eine 20 mM Ammoniumacetat und 15 mM Ammoniumhydroxid in 3% Acetonitril / Wasser, End-pH 9,0; und B ist 100% Acetonitril.
- Lose Kappe der Flasche, legen Sie sie in einem Wasser Ultraschallbad und beschallen für 10 Minuten ohne zusätzliche Heizung. (Dieser Schritt stellt sicher, dass alle Ammoniumsalze vollständig zu lösen, und dass es keine Restluftblasen.)
- Übertragungs 250 ml des Lösungsmittels in einen 250 ml Glasflasche für LC-MS verwenden, und halten den Rest bei 4 ° C
- Bereiten Sie die niedrigen Massenbereich Kalibrierungslösung. Es ist wichtig, eine maßgeschneiderte niedrigen Massenbereich Kalibrierung Mischung für Metabolomics-Anwendungen verwenden, um sicherzustellen, dass die genaue Massen werden bei niedrigen Molekulargewichten nachgewiesen.
- Wiegen 5 mg sowohl sodiähm Fluoracetat und Homovanillinsäure und in 5 ml Wasser auflösen, um eine endgültige Konzentration von 1 mg / ml zu machen. Auflösen Diazinon in Methanol, um eine Endkonzentration von 10 mg / ml zu ergeben.
- Um 1 ml negativen geringe Masse Kalibrierungslösung, mischen Sie 960 ml Thermo negativen Kalibrierungslösung mit 20 ml Natrium fluoroaceate und Homovanillinsäure Lösung. Zu 1 ml positive geringe Masse Kalibrierungslösung zu machen, mischen Sie 990 ml Thermo positive Kalibrierungslösung und 10 ml Diazinon Lösung. (Die geringe Masse Kalibrierungslösung bei 4 ° C gelagert werden und alle 2 Monate frisch zubereitet werden.)
- Kalibrierung von QE-MS an einer Low Mass Bereich
- Bevor niedrigen Massenbereich Kalibrierung, Durchführung einer Standard-Massenkalibrierung (m / z, 150-2,000) in positive und negative Arten auf Basis der Anweisungen des Herstellers.
- Sobald eine regelmäßige Massenkalibrierung spielt um 60 bis 900 m / z in der Bedienkonsole einstellen Scan-Bereichund eine Quelle CID von 25 eV für positiven Modus und 35 eV für Negativmodus angewendet wird. (Dies gibt robuste Signale des Koffein-Fragment-Ion und dem Sulfat-Ion. Die Scan-Bereich hier ist festgelegt, weil die letzte m / z sollte nicht größer als 15x des Ausgangs m / z)
- Sobald die Ionenquelle ist stabil, dann die kundenspezifische Kalibrierung. Anmerkung: Eine stabile Quelle wird als weniger als 10% der Gesamtionenstromverlauf in positiven Modus von weniger als 15% im negativen Modus definiert und. Die kundenspezifischen Eichionen und entsprechenden m / z sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Stellen Sie den LC-MS-Instrumentierung für polare Metabolit-Analyse. LC ist mit einem QE-MS für Metabolit Trennung und Detektion gekoppelt.
- Anlegen der QE-MS mit einem Elektrospray-Ionisation Beheizte Sonde (H-ESI). Stellen Sie die entsprechenden Tuning-Parameter für die Sonde wie aufgelistet: Heizungstemperatur, 120 ° C; Gashülle, 30; Hilfsgas, 10; fegen Gas, 3; Spritzspannung 3,6 kV fürpositiven Modus und 2,5 kV für negativen Modus. Stellen Sie die Kapillare Temperatur bei 320 ° C und S-Linse 55.
- Bauen Sie einen Scan-Methode wie folgt: Voll Scan-Bereich: 60 bis 900 (m / z); Auflösung: 70.000; maximale Einspritzzeit: 200 ms mit typischen Einspritzzeiten um 50 ms; automatische Verstärkungsregelung (AGC): 3.000.000 Ionen. Diese Einstellungen führen zu einem Tastverhältnis von etwa 550 ms durchzuführen Scans in positiven und negativen Modus.
- Stellen Sie die Chromatographie-Verfahren. Beschäftigen ein Amid-Säule (100 x 2,1 mm ID, 3,5 mm) für die Verbindung Trennung bei Raumtemperatur 13,15. Die mobile Phase A ist, wie oben beschrieben, und die mobile Phase B ist Acetonitril. Verwenden Sie einen linearen Gradienten wie folgt: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10.5 min 35% B, 14.5 min 35% B, 15 min, 85% B und 20 min, 85% B. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,15 ml / min von 0 bis 10 min und 15 bis 20 min und 0,3 ml / min von 10,5 bis 14,5 min.
2. Preparation Metabolit von Proben
- Bereiten Sie eine Extraktionslösungsmittel. Mischen Sie 40 ml Methanol (LC-MS-grade) und 10 ml Wasser (LC-MS-grade) in einem 50-ml-Tube, und halten Sie sie in -80 ° C-Gefrierschrank für mindestens 1 Stunde vor dem Gebrauch. Hinweis: Dieses Verfahren und die Schritte zur Extraktion von biologischem Gewebe und Flüssigkeitsproben modifiziert werden.
- Kultur Darmkrebs HCT 8 Zellen in drei 10-cm-Schalen oder 6-Well-Platten mit voller Wachstumsmedium RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100.000 Einheiten / l Penicillin und 100 mg / L Streptomycin.
- Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, das Medium schnell zu entfernen und die Schale oder Platte oben auf Trockeneis 13,15. 1 ml Extraktionslösung sofort (80% Methanol / Wasser), und übertragen Sie die Platte an den -80 ° C Gefrierschrank. Für eine 10 cm Schüssel, 3 ml der Extraktionslösung in jede Vertiefung. (Versuchen Sie, das Medium so viel wie möglich, um den Ionenunterdrückungseffekt durch Restsalze aus Medium zu vermeiden entfernen.)
- Lassen Sie die Platte für 15 min. Entfernen Sie es aus der Tiefkühltruhe, und kratzen Zellen in das Lösungsmittel auf Trockeneis. Die Lösung wird in 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen und Zentrifugieren mit der Geschwindigkeit von 20.000 × g bei 4 ° C für 10 min. (Bereiten Zellmetaboliten aus drei verschiedenen Gerichten zu drei Parallelproben zu machen. Zweck des Haltens zwei Röhren ist es, eine als Datensicherung zu haben.)
- Den Überstand in zwei neuen Eppendorf-Röhrchen, und trocknen Sie sie in einer Geschwindigkeit Vakuum. Dies dauert etwa 3-6 Stunden abhängig von der Geschwindigkeit Vakuum verwendet. (Die Proben können auch über Nacht unter Stickstoff getrocknet werden.)
- Nach dem Trocknen die Röhrchen jeder Probe in der -80 ° C-Gefrierschrank. Wenn Sie bereit sind, zu rekonstruieren einer Probe in 20 ml Wasser (LC-MS-grade) und 5 ml injizieren zu LC-QE-MS für die Analyse.
3. Aufbau der Probensequenz
- Nachdem die Kalibrierung ordnungsgemäß ausgeführt wurden, auf der QE-MS, LC-Säule ins Gleichgewicht für 5 min mit 85% A bei einer FlussRate von 0,15 ml / min, die den Ausgangszustand der LC-Gradienten ist.
- Richten Sie die Probensequenz in zufälliger Reihenfolge. Anmerkung: Auf diese Weise verteilt es die durch die LC-MS zu jeder Probe eingeführt Schwankungen und gewährleistet einen genaueren Vergleich zwischen den verschiedenen Proben. Alle 6 Proben, einen Waschdurchlauf, der den gleichen MS-Verfahren teilt, mit Ausnahme der LC-Gradienten von 95% A für 10 min, gefolgt von einer 5 Minuten Äquilibrierung der Säule bei 85% A mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,15 ml / min. Leerproben (100% Wasser) nach jeder Wäsche run um das System Hintergrund bewerten und über die Höhe tragen.
- Speichern Sie die Sequenz, und sobald das LC-Säule zeigt stabile Druck rund 400 psi, starten Sie die Reihenfolge laufen. Wenn es keine anderen Probe nach dieser Reihenfolge ausgeführt werden, dann einen Stoplauf am Ende der Sequenz, die einen Durchfluss von 0 ml / min am Ende des Gradienten hat und "Bereitschaft" nach Beendigung der Folge.
- Re-Run die gleiche Probe eingestellt 12 Stunden nach der Kalibrierung. (Diese is, die Masse Fehler Fluktuation nach der Kalibrierung zu beurteilen.)
4. Beitrag Analysis Instrument Reinigung und Wartung
- Am Ende der Sequenz, Waschen der Säule mit 95% A bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / min für 2 h und falls erforderlich, umgekehrt die Säule vor dem Waschen.
- Entfernen Sie das LC-Säule und direkt an den LC zu der Ionenquelle von einer Gewerkschaft. Bereiten Sie Reinigungsmittel, Wasser / Methanol / Ameisensäure (v: v: v, 90:10:0.2), setzen MS auf den Standby-Modus, und die Wasch LC-MS-System bei einer Durchflussrate von 0,1 ml / min für 1 h zu entfernen die Restausgefällten Salze oder andere Verunreinigungen. Senken Sie die Durchflussmenge, wenn es zu viel Systemdruck.
- Stellen Sie die Kapillare Temperatur bei 50 ° C, und entfernen Sie die Ionen-Käfig. Sie vorsichtig die Ionen-Sweep-Konus und die Ionentransportrohr nach der Kapillar-Temperatur fällt auf 50 ° C. Verwenden eine grobe Maschen, wie Sandpapier, um Verunreinigungen auf der Oberfläche belassen des Ionensweepkonus entfernen.
- Setzen Sie den IonentransferRohr in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen mit 10 ml 90% Wasser / Methanol mit 0,1% Ameisensäure. Nach der Beschallung der Röhre in einem Wasser Ultraschallbad für 20 min, dekantieren des Lösungsmittels im Inneren, ersetzen Sie es mit 10 ml reinem Methanol und beschallen für weitere 20 min. (Wenn notwendig, kann die Ultraschallbehandlung bei 40 ° C oder eine noch höhere Temperatur, um eine bessere Reinigungsergebnisse zu erzielen geführt werden.)
5. Analyse der LC-MS-Daten
- Um die Probensequenz reibungslos abläuft, nach Abschluss der ersten beiden Proben in der Reihenfolge, überprüfen Peaks für unbekannte Metaboliten. Verwenden Sie eine CSV-Datei Auflistung Metabolit Namen, neutral chemische Formel und Erkennungsmodus (entweder positiv oder negativ), wie die Eingabedatei und die Ausgabedatei enthält extrahiert Spitzen und Massenfehler in ppm. Wenn der Peakform anormal oder die Massenfehler ausgeschaltet ist um mehr als 5 ppm beträgt, dann wird der Rest der Sequenz angehalten werden muss und Fehlerbehebung getan werden muss.
- Wählen Sie die Methode der "Spitzen Ausrichtungund Rahmen-Extraktion "auf handelsübliche Software. Wählen Sie Rohdaten von LC-MS und gruppieren Sie sie. Pick-Proben in der Mitte der Ablaufreihenfolge wie Chromatographie Referenzprobe für die Spitzen Ausrichtung. Laden Sie einen Rahmen Saatgut einschließlich bekannter Stoffwechselmetabolite für die gezielte Analyse mit Daten gesammelt und der entsprechenden Rahmen Samen.
- Führen Sie die Datenanalyse im positiven und negativen Modus getrennt. Verwenden Sie die Standardeinstellung für andere Parameter. Schalten Sie die Suchfunktion Datenbank und führen Sie den Workflow. Exportieren Sie die bearbeiteten Daten als Excel-Tabelle enthält Peakfläche von jedem Rahmen. Die ersten Sätze von Rahmen entsprechen den Metaboliten in der Zielliste. Anmerkung: Für einen gezielten Stoffwechselanalyse wird die Metaboliten Informationen basierend auf den früheren Studien 13,15 erhalten.
- Für eine ungezielte Metabolitenanalyse, wählen Sie die Methode der "Komponente Extraktion". Legen Leerproben für die Hintergrund Subtraktion. Stellen Sie Spitzenintensitätsschwelle ein10 t 5, m / z Breite von 10 ppm und das Signal-Rausch-Verhältnis von 3.
- Verwenden menschlichen Metabolom-Datenbank für unbekannte Verbindungen Identifikation. Verwenden Sie einen CV-Filter, um die Komponenten mit großen Lebensläufe im Wiederholungsproben zu entfernen. Manuell durch jede Komponente gehen und diejenigen mit gut definierten Peak oder relativ großen Unterschied in verschiedenen Proben-Typen für Datenbank-Suche. Exportieren von Daten mit Hits in der Datenbank. (Spitzen Ausrichtung könnte umgangen werden, wenn der Spitzen Alignment-Score ist zu niedrig.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Genauigkeit der Metabolomics-Daten hängt stark von der LC-MS-Gerät QE-Leistung. Zu beurteilen, ob das Gerät in einem guten Zustand betrieben wird, und ob die angewendete Methode ist die richtige, sind verschiedene bekannte Metaboliten LC-Peaks von der Gesamt Ionenchromatographie (TIC) extrahiert, wie in Fig. 1 gezeigt. Polaren Metaboliten, einschließlich Aminosäuren, Glykolyse Zwischen , TCA Zwischenprodukte, Nukleotide, Vitamine, ATP, NADP + und so weiter haben gute Retention auf die Spalten und gute Peakformen in der Amid-Spalte unter aktuellen Bedingungen LC. Währenddessen wird ein Massenfehler Test innerhalb von 24 Stunden nach der geringen Masse Kalibrierung durchgeführt, wie in Abbildung 2 dargestellt. 6 verschiedene Konzentrationen von Proben in dreifacher Ausfertigung nach der Kalibrierung werden zweimal laufen, und die ganze Zeit Palette umfasst fast 24 Stunden. Die Massenfehler durch Vergleichen der detektierten m / z an den theoretischen m / z gezielte Metaboliten untersucht. Hier werden die gezielte Metaboliten haben eine m / zvon 74 (Glycin) bis 744 (NADP +). Die Y-Achse stellt dabei die kumulative Anteil der Metaboliten in gewissen Masse Fehlerbereich. Die blaue Kurve zeigt das Ergebnis von 0-12 h, während die rote Kurve zeigt die 12 bis 24 Stunden gesammelten Daten. Abbildung 2 zeigt deutlich, dass mehr als 90% der Metaboliten sind innerhalb von 5 ppm Massenfehler, die die geringe Masse bedeutet Bereich Kalibrierverfahren hier entwickelt hat, ist ausreichend, um 5 ppm Massenfehler für niedrige Massenbereich Erkennung erhalten.
Ein weiteres Thema angesprochen werden soll die Empfindlichkeit des Instruments mit dem aktuellen Verfahren und Geräteeinstellungen. Eine serielle Verdünnung von Dreifachproben von 10 cm Petrischale wurde 5 mal mit einem Verdünnungsfaktor von 6 durchgeführt, am Ende mit 6 verschiedenen Konzentrationen der Proben. Diese Proben stellen die Menge des Metaboliten von 10 7 extrahiert, 1,67 × 10 6, 2,78 × 10 5, 4,63 × 10 4, 7,72 × 10 3 und 1,29x 10 3 Zellen. Da jede Konzentration der Probe wird in dreifacher Ausfertigung hergestellt werden insgesamt 18 Proben im LC-QE-MS analysiert. Eine gezielte Liste wird verwendet, um die Anzahl von Metaboliten im detektierten für unterschiedliche Konzentration der Probe zu beurteilen. Das Ergebnis ist in Abbildung 3 zeigt, dass die optimale Anzahl von detektierten Ziel Metaboliten liegt zwischen 2,78 x 10 5 bis 1,67 x 10 6 Zellen, wobei 1 x 10 7 Zellen geben eine geringere Anzahl von detektierten Metaboliten, die durch Ionenunterdrückungswirkungen. Dieses Ergebnis zeigt, daß die optimale Menge von Zellen für diese Analyse zu extrahieren ist ungefähr der einer Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen.
Für ungezielte Metabolitenanalyse, eine CV-Cutoff von 20% und einer durchschnittlichen Intensität von 10 7 werden verwendet, um die Komponenten-Tabelle zu filtern. Diese starren Lebenslauf und durchschnittliche Intensität Schwellenwerte für diese Demonstration Ziel verwendet. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, können CV Cutoff-Werteerhöht (beispielsweise 30%), während die durchschnittliche Intensitätswerte müssen verringert (z. B. 10 5), um mehrere Spitzen aufweisen. Nach der manuellen Überprüfung Spitzen werden Komponenten mit guten Formen ausgewählt und gesucht in der menschlichen Metabolom Datenbank. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2A listet die Ergebnisse aus den Daten in positiver Modus gesammelt, während Tabelle 2B zeigt die Ergebnisse von negativen Modus. Einige der hier identifizierten Metaboliten Überlappung mit dem Metaboliten in der Zielliste, wie Glutathion, Prolin und so weiter, aber inzwischen weitere Metabolite fehlen in der Zielliste sucht werden, wie methyglyoxal, die aus Glykolyse abgeleitet werden kann, und 1 -Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, das positiv, mit einer Retentionszeit von 3,2 min, was eine angemessene Retention für Phospholipide zu einem Amid Spalte erfaßt wird. Ein Protokoll auf ungezielte Metabolit Datenbanksuche wurde previously berichtet 20.
Fig. 1 ist. Beispiele für LC-MS-Chromatographie Spitzen. Hier wird das rekonstruierte Chromatographie mit einem Massenfenster von 10 ppm (m / z ± 5 ppm) erzeugt. Die X-Achse zeigt die Retentionszeit, während die Y-Achse zeigt die relative Intensität und die Spitzenintensität wird über jeden Metaboliten aufgelistet. A zeigt Spitzen aus positiven Modus erkannt, während B zeigt Spitzen aus negativen Modus. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. 60;. Auswertung der niedrigen Massenbereich Kalibrierung Die Y-Achse ist die kumulative Anteil der Metaboliten mit Massenerfassungsfehler innerhalb von 5 ppm. Die X-Achse ist die Masse Fehlerbereich in ppm. Blaue und rote Kurven stellen 0-12 h und 12-24 h zuge. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
. Abbildung 3 Auswertung der Probenmenge -. Zahl gegenüber der Anzahl von HCT 8 Zellen nachgewiesen gezielte Metaboliten Rote Quadrate stellen Metaboliten im positiven Modus erkannt, blaue Kreise bedeuten Metaboliten im negativen Modus gemessen, und die schwarzen Dreiecke sind die Gesamtzahlen von Metaboliten von beiden positiven und negativen Modus. Die X-Achse zeigt die Anzahl der Zellen, HCT-8.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
| Standards | M / Z, positiven Modus | M / Z, Negativmodus | Neutral Formel | Neutral Massen |
| n-Butylamin | 74.096425 | NA | C 4 H 11 N | 73.089149 |
| Koffein-Fragment | 138.066188 | NA | C 6 H 8 N 3 O | 137.058912 |
| Koffein | 195.087652 | NA | C 8 H 11 N 4 O 2 | 194.080376 |
| Diazinon | 305.108329 | NA | C 12 H 20 N 2 O 3 PS | 304.101053 |
| MRFA Peptid | 524.264966 | <td> NAC 23 H 37 N 7 O 5 S | 523,25769 | |
| Fluoracetat | N / A | 77.004432 | C 2 H 3 FO 2 | 78.011708 |
| Sulfat | N / A | 96.960106 | H 2 SO 4 | 97.967382 |
| Homovanillinsäure | N / A | 181.050634 | C 9 H 10 O 4 | 182,05791 |
| Dodecylsulfat | N / A | 265.147906 | C 12 H 26 SO 4 | 266.155182 |
| Taurocholat | N / A | 514.2844 | C 26 H 45 NO 7 S | 515.291676 |
Tabelle 1. Low Massenbereich Kalibrierungsstandards und ihre genaue m / z.
| CSID | Name | Formel | Monoisotopischen Massen | Suche Massen | Fehler (ppm) | RT (min) |
| 234 | Beta-Alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04805 | 0,62 | 8.08 |
| 1057 | Sarkosin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4,22 | 8.08 |
| 5735 | Alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4,22 | 8.08 |
| 568 | Kreatinin | C 4 H 7 N 3 O | 113,05900 | 113,05889 | 1,00 | 4,41 |
| 128566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06338 | 0,41 | 7,54 |
| 6050 | L-(+)-Valin | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0,18 | 7,42 |
| 7762 | Amylnitrit ich | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0,18 | 7,42 |
| 135 | 5-Amino-valeriansäure | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 242 | Trimethylglycin | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 911 | Niacinamid | C6H6N2O | 122,04800 | 122,04793 | 0,55 | 2,60 |
| 1091 | Taurin | C 2 H 7 NO 3 S | 125,01466 | 125,01469 | 0,20 | 7,61 |
| 1030 | Pyrrolin Hydroxycarbonsäure | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 7127 | PCA | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 90657 | N-Acryloylglycine | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 388752 | 5-Oxo-D-prolin | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 389257 | 3-Hydroxy-3 ,4-dihydro-2H-pyrrol-5-carbonsäure | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 8031176 | Pyrrolidoncarbonsäure | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,03 | 8,51 |
| 5605 | Hydroxyproline | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | <td> 131,059015,83 | 8.08 | |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 167744 | L-Glutaminsäure-gamma-semialdehyd | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 388519 | 5-Amino-2-oxopentansäure | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 134 | Aminolävulinsäure | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 </ Td> | 7,70 | 8.08 |
| 9312313 | 3-Hydroxy-L-Prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 | 7,70 | 8.08 |
| 566 | Creatine | C 4 H 9 N 3 O 2 | 131,06900 | 131,06905 | 0,36 | 8.08 |
| 5880 | L-(+)-Leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 6067 | L-(+)-Isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 19964 | L-Norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6.96 </ Td> |
| 388796 | beta-Leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 548 | Aminocapronsäure | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09455 | 3,48 | 6,96 |
| 6031 | L-(-)-Asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05348 | 0,10 | 8.31 |
| 109 | Ureidopropionic Säure | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05348 | 3,71 | 8.31 |
| 6026 | L-Ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0,02 | 10.37 |
| 64236 | D-Ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0,02 | 10.37 |
| 5746 | Glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 128633 | D-Glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 141172 | Ureidoisobutyric Säure | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 21436 | N-Methyl-D <scp> </ scp>-Asparaginsäure | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 21814 | D-(-)-Glutaminsäure | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 30572 | L-(+)-Glutaminsäure | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 58744 | N-Acetyl-L-Serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 5907 | L-(-)-Methionin | C 5 H 11 NO 2 S | 149,05106 | 149,05095 | 0,70 | 7,39 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06940 | 0,48 8,33 | |
| 5910 | L-(-)-Phenylalanin | C 9 H 11 NO 2 | 165,07898 | 165,07887 | 0,63 | 6,60 |
| 1025 | Pyridoxin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 4463 | Oxidopamine [USAN: INN] | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 102750 | 5 - (2-Aminoethyl)-Pyrogallol | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 388394 | Noradrenalin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 6082 | L-(+)-Arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1,39 | 10,77 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1,39 | 10,77 |
| 780 | Heteroauxin | C 10 H 9 NO 2 | 175,06300 | 175,06304 | 0,18 | 2,32 |
| 67261 | Indol-3-acetaldehyd, 5-Hydroxy- | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1,65 | 2,32 |
| 3574185 | Indol-2-essigsäure | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1,65 | 2,32 |
| 5833 | L-(-)-Tyrosin | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 389285 | 3-Amino-3-(4-hydroxyphenyl) propansäure | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 13628311 | L-threo-3-Phenylserin | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 425 | 4-Hydroxy-4-(3-pyridyl)-butansäure | C 9 H 11 NO 3 | 181,07401 | 181,07378 | 1,25 | 7,48 |
| 13899 | 3 - (1H-Indol-3-yl) acrylsäure | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0,15 | 6,44 |
| 10607876 | Indolacrylsäure | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0,15 | 6,44 |
| 389120 | N6, N6, N6-Trimethyl-L-Lysin | C 9 H 20 N 2 O 2 | 188,15248 | 188,15221 | 1,45 | 10,87 |
| 388321 | 5 "-S-Methyl-5"-thioadenosine | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,08957 | 297,08898 | 2,00 | 2,56 |
| 144 | 9 - (5-s-methyl-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-amin | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,09000 | 297,08898 | 3,43 | 2,56 |
| 111188 | Glutathion | C 10H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08345 | 1,14 | 8,02 |
Tabelle 2A.
| CSID | Name | Formel | Monoisotopischen Massen | Suche Massen | Fehler (ppm) | RT (min) |
| 857 | Methylglyoxal | C 3 H 4 O 2 | 72,02100 | 72,02108 | 1,03 | 7,70 |
| 1057 | Sarkosin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2,33 | 8.19 |
| 5735 | Alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2,33 | 8.19 |
| 234 | Beta-Alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04747 | 5,93 | 8.19 |
| 55423 | R-Milchsäure | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5.12 |
| 61460 | Hydroxypropionsäure | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5.12 |
| 96860 | L-(+)-Milchsäure | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5.12 |
| 592 | Milchsäure | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5.12 |
| 650 | Dihydroxyaceton | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5.12 |
| 731 | Glyceraldehyde | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5.12 |
| 1086 | Schwefelsäure | H 2 O 4 S | 97,96738 | 97,96683 | 5,63 | 8.13 |
| 128566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06302 | 2,67 | 7,78 |
| 1078 | Bernsteinsäure | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 466979 | Erythrono-1 ,4-lacton | C4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 4483398 | D-Erythronsäure g-lacton | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 473 | Methylmalonsäure | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5,96 | 7,72 |
| 8527138 | (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-on | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5,96 | 7,72 |
| 140384 | 2-ketocaproic Säure | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 164251 | Methyloxovaleric Säure | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 388419 | (3S)-3-Methyl-2-oxopentansäure | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 15642233 | Ketoleucin | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 46 | a-Oxo-b-Methylvaleriansäure | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2,35 |
| 69 | Alpha-Ketoisocapronsäure | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2,35 |
| 134 | Aminolävulinsäure | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8.19 | |
| 9312313 | 3-Hydroxy-L-Prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8.19 |
| 5605 | HYDROXYPROLINE | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 167744 | L-Glutaminsäure-gamma-semialdehyd | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 388519 | 5-Amino-2-oxopentansäure | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 5880 | L-(+)-Leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 6067 | L-(+)-Isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 19964 | L-Norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 388796 | beta-Leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 548 | Aminocapronsäure | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09419 | 6,18 | 7,09 |
| 109 | Ureidopropionic Säure | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05321 | 1,60 | 8,28 |
| 6031 | L-(-)-Asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05321 | 2.21 | 8,28 |
| 6026 | L-Ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10,36 |
| 64236 | D-Ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10,36 |
| 193317 | L-(-)-Apfelsäure | C 4 H 6 O 5 | 134,02153 | 134,02130 | 1,72 | 7.95 |
| 510 | (±)-Apfelsäure | C 4 H 6 O 5 | 134,02200 | 134,02130 | 5,25 | 7.95 |
| 133224 | threonsäure | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7,70 |
| 388628 | 2,3,4-Säure Trihydroxybutanoic | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7,70 |
| 2061231 | DL-Erythronsäure | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7,70 |
| 21436 | N-Methyl-D <scp> </ scp>-Asparaginsäure | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 21814 | D-(-)-Glutaminsäure | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 30572 | L-(+)-Glutaminsäure | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 58744 | N-Acetyl-L-Serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06930 | 1,09 | 8,36 |
| 199 | Allantoin | C 4 H 6 N 4 O 3 | 158,04401 | 158,04387 | 0,88 | 4,76 |
| 6082 | L-(+)-Arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0,80 | 10,76 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0,80 | 10,76 |
| 58576 | N-Acetyl-L-Asparaginsäure | C 6 H 9 NO 5 | 175,04807 175,04803 | 0,18 | 7,87 | |
| 996 | Pyrophosphorsäure | H 4 P 2 O 7 | 177,94299 | 177,94331 | 1,79 | 8.42 |
| 5589 | Glucose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17893 | Mannose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 58238 | . ß-D-Glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 71358 | . &agr;-D-Glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 134838 | 3-Desoxy-arabino-Hexonic Säure | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388332 | L-Sorbopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388476 | beta-D-Galactopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388480 | . Alpha-D-Galactopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388775 | beta-D-Fructofuranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 7,53 | |
| 10239179 | Inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 16736992 | Cis-Inosit | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216070 | Allose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216093 | L-Sorbose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 201 | Hexopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 868 | 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 2068 | Theophyllin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 4525 | 1,7-Dimethyl-xanthin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 5236 | Theobromin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 1161 | Isozitronensäure | C 6 H 8 O 7 | 192,02701 | 192,02704 | 0,15 | 8.18 |
| 305 | Citric Säure | C 6 H 8 O 7 | 192,02699 | 192,02704 | 0,23 | 8.18 |
| 963 | Pantothensäure | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6,72 |
| 6361 | D-Pantothensäure | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6,72 |
| 960 | Palmitinsäure | C 16 H 32 O 2 | 256,23999 | 256,24000 | 0,05 | 1,73 |
| 111188 | Glutathion | C 10 H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08339 | 1,35 | 8,03 |
| 388337 | N-Acetylneuraminsäure | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 | |
| 392681 | N-Acetyl-alpha-Neuraminsäure | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 |
| 392810 | Sialinsäure Neu5Ac | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 |
Tabelle 2B.
. Tabelle 2 Liste der ungezielte Metaboliten in HCT nachgewiesen 8 Zellen (2,78 x 10 5 Zellen Äquivalenz) Tabelle 2A und 2B sind Komponenten Extraktion Informationen:. Retentionszeit, m / z und Massenfehler, und in der Zwischenzeit, Datenbank-Suchergebnisse: Chemspider ID ( CSID), Name, Formel, und so weiter. Hier werden die analysierten Proben sind Gleichungenl Metaboliten von 2,78 x 10 5 Zellen extrahiert, und die Intensitätsschwelle 1 x 10 7 bis mühsame Ergebnis für Demonstrations Ziel zu vermeiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Metabolite Profiling in Zellen mit diesem Protokoll sind: 1) die Steuerung des Wachstumsmediums und sorgfältige Entnahme der Zellen; 2) Einstellen des LC-Verfahren auf Basis von MS-Methode Einrichtung, um sicherzustellen, gibt es genug (in der Regel mindestens 10) Datenpunkte über einen Peak für die Quantifizierung; 3) macht einen geringen Masse Kalibrierung, bevor Sie Proben; 4) Einspritzen nicht mehr als 5 ml Retentionszeit zu vermeiden und Schaltspitzenverbreiterung durch Wasser; und 5) Vorbereitung und Durchführung von Vergleichsproben in der gleichen Charge zu Charge Wirkungen zu minimieren.
Die Standards für niedrigen Massenbereich Kalibrierung hier gewählt (Tabelle 1) sind austauschbar. Jede bekannte Verbindung mit einem m / z, die in der Masse Scan-Bereich fällt, wird auch in einem H-ESI-Quelle benommen, und ist in Wasser, Methanol oder Acetonitril löslich sind vernünftig Kandidaten für Kalibrierungsstandards. Es wird dringend empfohlen, alle Kalibrierungslösungen ein speichernt 4 ° C zu stabilisieren Koffein und auch die Verdampfung von Methanol oder Acetonitril in der Kalibrierungslösung zu minimieren, so dass die Durchführung der Kalibrierungen kann mehr reproduzierbar. Im Vergleich zu einem regulären Massenbereich m / z von 150 bis 2000, muss niedrigen Massenbereich Kalibrierung, die mindestens einmal alle zwei Tage häufiger durchgeführt werden.
Dieser Workflow, von der Extraktionslösungsmittel, Lösungsmittel Rekonstitution, LC mobilen Phase zu niedrigen Massenbereich Kalibrierung und MS scannen Bereich wurde optimiert, um polaren Metaboliten zu messen. Dazu gehören Aminosäuren, Acetyl Aminosäuren Glykolyse Weg-Zwischenstufen, Nukleoside, Citratzyklus Zwischen einige Ein-Kohlenstoff-Stoffwechselweg Zwischenprodukte und so weiter. Allerdings Modifikationen dieses Protokoll für die anderen Klassen von Metaboliten, wie Coenzym A (CoA) Arten, Folate, sind Phospholipide möglich. Zum Beispiel sind CoAs in sauren Bedingungen stabiler, so dass die Zugabe einer Säure zu 80% Methanol / Wasser wird hilfreich sein, um improve CoA-Empfindlichkeit. Auch CoA und Lipiden neigen dazu, viel großen Molekulargewichten, damit die m / z-Scan-Bereich braucht, um 60 bis 900 auf den richtigen Bereich, die diese Stoffwechselprodukte abdecken wird eingestellt werden.
Auch wenn überlappen einige der ungezielte Komponentendatenbank Suchergebnisse mit der gezielten Liste, ist es noch wichtig, diese gezielte Liste auf der Basis der Forschungsschwerpunkt aufzubauen. Da die Stoffwechselprodukte in der Zielliste sind niedriger als die durchschnittliche Intensitätsschwelle, werden die Informationen auf dieser Metabolite während der Verarbeitung entfernt werden. Die gezielte Liste umfasst die Retentionszeit Informationen, die uns mehr Vertrauen für Metaboliten Identifizierung und Quantifizierung gibt. Ein weiterer Vorteil bei der QE-MS-Setup ist, dass Tandem-Massenspektrometrie für die weitere Identifizierung von Metaboliten zu ermöglichen.
Ein Problem mit diesem Workflow verknüpft ist, dass die H-ESI-Nadel insert empfindlich ist, den Salzgehalt der Proben, die Empfindlichkeit stark beeinträchtigt werden, wenn hohe Mengen an nichtflüchtigen Salzen. Daher wird minimiert Salzgehalt von Proben und regelmäßige Reinigung der Säule und der H-ESI-Nadel Einsatz hilfreich sein, um Daten von guter Qualität zu gewährleisten und die Spalten Lebensdauer zu erhöhen.
Zusammenfassend, LC-QE-MS verwendet dieses Protokoll, um erfolgreich zu analysieren polaren Metaboliten aus kultivierten Zellen mit minimaler Probenvorbereitung und schnelle Datenerfassung. Kleine Änderungen in der Probenvorbereitung durchgeführt werden, um Daten aus anderen biologischen Quellen wie Serum und Gewebe zu erhalten. Zum Beispiel, weil reines Methanol kann Flüssigkeit Serum hinzugefügt werden hinzugefügt, um eine endgültige Methanolkonzentration zu 80% für polare Metaboliten Extraktion zu machen. Für Gewebeproben wird kräftigem Rühren und Mischen erforderlich, um eine bessere Extraktion Effizienz zu erreichen. In der Regel 10 ml Serum oder1 mg Gewebe ist für Stoffwechselanalyse ausreichend. Die Rohdaten können sowohl in gezielter Modus analysiert werden, wenn es bekannt Metaboliten in der Probe, und in einer nicht gezielt gefolgt von HRMS Datenbanksuche. HRMS basierend Metabolomics ist noch in einem frühen Stadium. Für zukünftige Fortschritte, können die experimentellen Techniken weiter optimiert werden, zusätzliche Informationen und Metaboliten HRMS MS / MS-Fragmentierungsmuster sind hilfreich und relevante Algorithmen, wie z. B. Spitzenausrichtung, Peak-Integration, Isotopen Clustering und so weiter, kann die Effizienz und Genauigkeit zu verbessern sein Datenverarbeitung. Letztlich aber viele der Fragen, die unser Labor-Adressen im Stoffwechsel durch sorgfältige Interpretation der Daten nach der Verarbeitung sind begrenzt. Mit dieser groß angelegten Metabolomics-Techniken, sind wir oft von unserer Interpretation der Daten und Bewertung von Hypothesen generiert begrenzt. Daher braucht alle Metabolomics Experimente rund um spezifische Fragen formuliert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) und Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) für wertvolle Diskussionen über Massenkalibrierung und Datenverarbeitung bestätigen. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R00CA168997 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
