Abstract
Hepatit C Virüsü (HCV) dünya nüfusunun% 3 etkiler ve kronik hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinom gibi ciddi karaciğer rahatsızlıkları olur. HCV, Flaviviridae ailesine ait zarflı bir RNA virüsüdür. Mevcut tedavi, tam etkili değildir ve istenmeyen yan etkilere neden olur. Hiçbir HCV aşısı yoktur. Bu nedenle, devam eden bir çaba bir aşı ve daha iyi bir tedavi geliştirmek için gereklidir. HCV bir hücre kültür sistemi viral girişi, genom replikasyonu, paketleme, ve çıkış da dahil olmak üzere HCV gelişmesinin çeşitli aşamalarında çalışmaları için önemlidir. Sunulan mevcut prosedüründe, bir vahşi tip intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV ve virüs çoğaltma incelemek için bir Renilla lusiferaz haberci genini taşıyan bir rekombinant virüs FNX-Rluc kullanılır. Bir insan hepatoma hücre hattı (Huh-7 göre) in vitro transfeksiyonu için kullanılmıştır HCV genomik RNA transkripsiyonu. Hücresiz kültür üst sıvıları, protein lizatlan ve tla m HCV RNA büyümeyi değerlendirmek için post-transfeksiyon işaret çeşitli zaman hasat edilmiştir. HCV genomu, çoğaltma durum nicel RT-PCR ve HCV varlığının görüntülenmesi iki-şeritli RNA tarafından değerlendirildi. HCV protein ekspresyonu HCV NS3 ve NS5A proteinleri için spesifik antikorların kullanıldığı Western blot ve imüno deneyleri ile doğrulanmıştır. Kültür yüzer ve viral titresi olarak bulaşıcı parçacıklar serbest HCV RNA transfekte edilmiş hücreler ölçülmüştür. Lusiferaz deneyleri, raportör HCV'nin replikasyon seviyesi ve enfeksiyon riskini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuç olarak, HCV replikasyon döngüsünün farklı aşamalarında karakterize etmek için çeşitli virolojik ölçümlerde mevcut.
Introduction
Hepatit C virüsü (HCV), siroz ve karaciğer kanserine neden olur. Bu 350,000 kişi yılda 1-3 ölüyor, dünya çapında 170 milyon kişiyi etkilemektedir. HCV 9.6 kb'lik bir genom boyutuna sahip bir pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. HCV genomu, proteolitik olarak 10 polipeptitlere çeşitli hücresel ve viral proteazlar tarafından yarılır ~ 3000 amino asit kalıntıları tek bir poliprotein olarak tercüme edilir. HCV cinsi Hepatit C virüs in prototip virüsüdür ve Flaviviridae familyası 4 aittir. Maruz kalması üzerine, HCV bireylerin% 80, kronik enfeksiyon oluşturur. Enfeksiyon tanısı karaciğer bozulmasını önlemek için terapötik müdahaleye izin verebilir çoğunlukla asemptomatik ve zamanında. Güncel Tedavinin yetersiz olduğunu ve hiç aşı 5,6 mevcuttur.
Hepatit C etyolojisi ilk 1989, 7 'de tarif edilmiştir. HCV replikasyonu incelenmesi hepatit C aşısı ve tedavi araştırmalar için önemlidir, ancak bu olmuştuuzun süre etkili bir viral kültür sisteminin olmaması nedeniyle engellenmektedir. HCV'nin moleküler klon intrahepatik, aşılamadan 8 üzerine şempanzelerde enfeksiyon olduğu gösterilmiştir. Daha sonra, HCV alt-genomik replikonlar, bir hücre kültür sistemi 9,10 viral genom çoğaltma aşamasını incelemek için izin verilmiş olan, tarif edilmiştir. Bir genotip 2a HCV Discovery JFH-1 (Japon fulminan hepatit-1) izole, hücre kültürü enfekte edebilen HCV çoğaltma araştırma 11-13 için yeni yollar açtı. Genotip 2a gerginlik JFH-1 arası ve içi genotipik kimerik virüs ve genotip 1 HCV bazlı bazlı bulaşıcı kültür sistemleri de 14-18 vardır.
Biz başarıyla protein alanları ve sis etkili RNA elemanlarının 19,20 yüksek çözünürlüklü fonksiyonel profil haritasını elde etmek JFH-1 suşu ve HCV intragenotype 2a kimerik virüs kullandık. Buna göre, burada biz olanak rutin kullanılan etkili bir kültür sistemi açıklanmaktadırHCV çoğaltma döngüsü ve konak-patojen etkileşimi çeşitli aşamaları okuyor. Bu viral genomun replikasyonu ve intragenotype 2a HCV ve bir Renilla lusiferaz raportör göre HCV de novo enfeksiyon değerlendirmek virolojik ölçümlerde mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokolün genel hatları Şekil 1 'de gösterilmiştir.
1.. Hücreler
- 10-15% fetal sığır serumu (FBS), 10 mM esansiyel olmayan amino asitler, 10 mM Hepes, penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 mg / ml) ve 2 mM L-glutamin içeren tam büyüme ortamı hazırlayın.
- Hepatit C viral replikasyon döngüsünün in vitro analizi için, yukarıdaki takviyeleri ihtiva eden tam bir büyüme ortamı içinde Huh-7.5.1 hücreleri 13 koruyun.
- % 5 CO2 ile 37 ° C 'de belirtilen desteklenmiş büyüme ortamı ile Huh-7.5.1 hücrelerinde kültür viral suşları.
2.. Virüs ve Plasmid yapılar
- HCV RNA'nın tamamlayıcı DNA (cDNA) formunu oluşturmak ve genetik manipülasyon kolaylığı için bir plazmid vektörü içine klonlamak. Not: Japon fulminant hepatit 1 keşfi, JFH-1 (genotip 2a HCV), HCV araştırma için kritik olan ve olduğunu sahiptir izolatöncelikle HCV çoğaltma döngüsü 11-13 incelemek için kullanılır. JFH-1 HCV göre arası ve intragenotypic kimerik virüsler genellikle 14-18 araştırma kullanılır. Sentetik intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV, ve bir monosistronik kimerik muhabir gerginlik İnşaat önceden 19 ve yapı detayları bu protokol kapsamı dışındadır tarif edilmiştir.
- O (nükleotidler 1-2878) J6CF ana suş (NCBI erişim no. AF177036), yanı bir 5'NTR, yapısal bölgeleri ve P7, NS2 ve yapısal olmayan bölgelerin bir parçası içerdiği pFNX-HCV intragenotype 2a virüsü kullanarak de JFH-1 virüs suşu (NCBI erişim no. AB047639) 'in yapısal olmayan bileşenler olarak. Not: FNX-HCV Jc1 intragenotype 2a kimerik HCV'nin sekansına göre sentezlendi önce 15 bildirdi.
- Bir R takarak (adım 2.2 yukarıda) pFNX-HCV gerginlik dayalı bir monosistronik kimerik muhabir viral yapıyı, pFNX-Rluc, üret5 've NTR (nt 388 ve 389 arasında) Çekirdek geni arasındaki enilla lusiferaz gen. Daha sonra, bölünme sinyali olarak çalışacak bir ayak ve ağız hastalığı virüsü 2A (F2A) peptid dizisi kullanılarak lusiferaz geni ve bu yapının çekirdek gen bağlayın.
- PFNX-HCV veya pFNX-Rluc viral bir arka plan kullanarak RNA polimeraz null (Pol-) viral yapı mühendisi. , AAG amino asit tortuları ile, bu viral omurgaların birinin, NS5B polimeraz katalitik kalıntıları, GDD (nt 8615-8623 aa 2759-2761) değiştirin.
3.. In Vitro HCV RNA transkripsiyon
- Bir intragenotype 2a kimerik virüs FNX-HCV ve HCV-FNX Pol, null viral replikasyon (Şekil 2A) değerlendirilmesi için (Pol-) HCV kullanın.
- Xbal kısıtlama enzimi ile linearize plazmid, viral ve sonra kör uçlar elde etmek için mung fasulye nükleaz ile muamele. Anyon değişim kromatografisi ile sindirilmiş plazmid arındırın. O bütünlüğünü doğrulayınf jel elektroforezi (Şekil 2B) agaroz DNA tabi tutulması ile doğrusallaştırılmış plasmid.
- T7-RNA polimerazı kullanılarak doğrusallaştırılmış viral plazmid uyarlamak.
- Bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak yeni sentezlenmiş DNase ile muamele edilmiş RNA arındırın.
- , Agaroz jel elektroforezi (Şekil 2C) ile RNA üretimini kontrol edin.
- Spektrofotometresi ile RNA niceliğini.
- 10 ug çalışma alikotlar içinde -80 ° C 'de üretilen RNA saklayın. Not: Aynı anda her viral numune ve kontrol için tüm RNA transkripsiyonu ile her bir deney tasarımı içinde RNA kalitesi varyasyonu en aza indirmek için.
4. HCV RNA Transfeksiyonu ve Örnek Toplama
- Tripsin kullanılarak Huh-7.5.1 hücreler hasat.
- Hücreler, santrifüj yıkayın ve soğuk düşük serum ortamı ile iki kez süspansiyon tekrar süspansiyon. Ml başına 1 x 10 7 hücre düşük serum medya hücreleri tekrar süspansiyon.
- 10 & # toplam Mix956, bir 0,4 cm'lik bir elektroporasyon küveti içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler (4 x 10 6 hücre) 400 ul ile transkribe viral RNA g. , 270 V de elektroporasyon ile 100 Ω ve 950 uF hücreleri transfekte.
- % 15 FBS, 10 ml tam büyüme ortamı içinde elektroporasyona hücrelerin yeniden süspanse edin. Not: Huh-7.5.1 hücreleri% 15 Fetal Bovine Serumu kültürlendiğinde Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin artan hayatta kalma görülmektedir.
- 4, 48 ve 96 saat: her ikisi de T-25 şişelerinde (kap basma 1.2 x 10 ~ 6 hücreleri) ve 48 kuyucuklu plaklar içinde, aşağıdaki zaman noktalarında her biri için (oyuk başına 1 x 10 4 hücreleri) hücrelerin Plate.
- Kültür şişelerinden ve levhalardan ölü hücre kalıntılarını uzaklaştırmak üzere,% 10 FBS katkılı taze büyüme ortamı ile 4-8 saat post-transfeksiyon ile Ortamı değiştirin.
- 48, 96 saat zaman noktalarında, ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj ile hücreler toplandı örnekleri hücre tortularını çıkarmak hücre kültürü süpernatanları hasat º C
- -80 ° C de hücresiz süpernatantlar Mağaza Lyse Western blot ile protein ve RNA analizi için ve belirtilen zaman noktalarında transkripsiyon-nicel PCR ters hücreleri.
5.. HCV genom kopyalarının değerlendirilmesi için Transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR) Ters
- HCV genomik RNA kopya sayısını belirlemek için iki adımlı bir RT-qPCR gerçekleştirin.
- Ters uyarlamak 1 ters transkriptaz ve 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') bağlanan HCV duyu şeridi için spesifik bir primer kullanılarak toplam hücresel RNA ug veya temizlik gen Peptidilprolil izomeraz G (PPIG R, için özel bir primer : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Ayrıca, HCV sense iplik primeri kullanılarak bilinen genom kopyalarının (10 1 9 standart 10) (Kademe 3 de üretilen) FNX-HCV RNA nın ters transkripsiyonunu.
- (JFH RT spesifik HCV primerler kullanılarak elde edilen transkripsiyonu cDNA 50 ng kullanılarak qPCR yürütmekQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') ve DNA qPCR süper karışımını içeren yeşil boya bağlayıcı. Hem de temizlik gen PPIG için qPCR yapın (primerler PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Not: örnekleri arasında, doğru hücre HCV RNA seviyesini hesaplamak için, cep temizlik geni PPIG kullanımı , normalleşme için ekspresyon seviyesi (Ct çevrimi). Kopya sayısının saptanması için standart olarak FNX-HCV genomunun kopya numarasını kullanın.
- 15 saniye için 95 ° C ve 60: qPCR çalışan HCV RNA kopya sayısını belirlemek için, aşağıdaki koşulları kullanarak Gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak 30 saniye (40 devir) için C numara yerine.
- Genom replikasyonu için sonuçları Şekiller 3A ve 3B bakınız.
6.. Western Blot Analizi HCV Protein İfadesi (Şekil 3C) algılama için
- Hücre lizatları, fr kullanınom viral RNA protein, western blot analizi için 96 saat sonrası transfeksiyon transfekte.
- SDS-PAGE ve poliviniliden difluorür (PVDF) membran transfer kullanılarak hücre lizatı giderin.
- % 5 kaymağı alınmış süt, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde% 0.2 Tween 20 ihtiva eden bir blokaj çözeltisi kullanılarak membran bloke eder.
- Primer fare monoklonal antikoru NS3 ile membran (1 1000 sulandırma) ve beta-aktin (1 5000 sulandırma) inkübe edin.
- Turp peroksidaz (1 5000 sulandırma) konjuge keçi anti-fare IgG'si ilave edin ve kimyasal-ışıma ile tespit.
7. İmmünofloresan Deneyi (IFA)
- Imüno-flüoresan deneyi için -20 ° C'de 30 dakika boyunca metanol kullanılarak HCV-enfekte edilmiş ve transfekte hücreler düzeltildi.
- PBS ile üç kez yıkanır ve hücre IFA bloklama tamponu ile bloklayın.
- Tavşan poliklonal veya fare monoklonal anti-DSR (lütfen Dr Dasgupta'yı, UCLA tarafından sağlanan), anti-NS5A öncelikle antikor kullanınNA antikoru 1:200 (1 ug / ml) içinde bir seyreltmede J2 ve 5 saat için bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin º C
- Üç kez birincil antikor ardından hücrelerin PBS ile yıkayın.
- • Keçi anti-tavşan IgG-488, poliklonal antikor veya ikincil bir 1:1000 seyreltmesi (1 ug / ml) keçi anti-fare IgG-594 poliklonal ikincil antikor ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
- PBS floresan mikroskop (Şekil 3D) kullanarak Hoechst boyası ve görünümü kullanarak üç kez ve leke çekirdekler hücreleri yıkayın.
8. Ölçüm Virüs titresi
- Levha naif Huh-7.5.1 hücreler yaklaşık 3 x 10 3 hücre / oyuk, 96 oyuklu bir plaka kullanılmıştır. Ertesi gün, büyüme ortamı kullanılarak HCV RNA transfekte edilmiş hücrelerin hasat hücresiz kültür yüzer 10-kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve Huh-7.5.1 hücreler üzerine, üç kopya halinde inoküle.
- -20 ° C'de 30 dakika boyunca metanol (kullanarak 72 saat sonrası enfeksiyon hücreleri saptamak
- NS5A pozitif odak saymak ve mililitre başına odak noktası oluşturan birimin ortalama sayısı (FFU) hesaplamak için yüksek seyreltme kullanın. HCV titresi için Şekil 4'e bakınız.
Viral genom replikasyonu ve enjeksiyon için 9. Renilla Lusıferaz Muhabir Deney
- Viral genomun replikasyonu, 48 oyuklu plakalarda üç kere levha HCV RNA-elektroporate Huh-7.5.1 hücreleri (1 x 10 4 hücre / çukur) değerlendirilmesi için.
- Lyse 6 saat sonra pasif lizis tamponu 75 ul, 48 saat ve 96 saat post-transfeksiyon ile hücreler.
- -80 ° C, oda sıcaklığı ve mağazada, 15 dakika boyunca yavaşça plakaları sallayın
- , Renilla lusiferaz enzim aktivitesinin ölçülmesi, oda sıcaklığına kadar protein lisat ve Renilla lusiferaz deney reaktif çözülme için.
- , 96 wel oyuk başına protein lizat 20 ul ekle l beyaz ışıldama plakası ve bir luminometre içerisinde plaka yerleştirilir.
- Renilla lusiferaz analiz ayıraçı (coelenterazine + alt-tabaka tamponu) ile kaplanır ve 2 saniye ön okunan bir süre sonra, 100 ul koyun; 10 saniye boyunca yayılan ışık entegre.
- Biyolojik üçlü lusiferaz değerleri her bir numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın ve istatistik analiz için verileri (Şekil 5) tabi tutulması.
- Enfeksiyon değerlendirmek için, 48-çukurlu plakalarda naif Huh-7.5.1 hücreler üzerine üç kopya olarak belirtilen zaman noktalarında (48 saat ve 96 saat) için HCV RNA-transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen hücre içermeyen yüzer 500 ul inokülasyon.
- De sonra 6 saat sonrası enfeksiyon başına taze orta 500 ul ile viral aşının değiştirin.
- Lyse 8,2-8,7 (Şekil 5) adımda tarif edildiği gibi Renilla lusiferaz deneyi için 48 saat post-enfeksiyon ve konuya hücreler.
- Grafiklerde hata çubukları standart sapmalar (SD) gösterir. P değerleri, eşleştirilmemiş t testi ile hesaplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatit C virüs, bir RNA virüsüdür. Bu nedenle, genetik manipülasyon amaçla, HCV genomik cDNA bakteriyel bir plasmid vektörüne klonlanmıştır. A T7 RNA polimeraz promotörü sekans, HCV genomunun 5 'ucuna hemen önce başlandı. HCV analiz akışı bir genel hatları Şekil 1 'de sunulmuştur. Tam 3' ucuna sahip HCV genomik RNA oluşturmak için, plazmit ihtiva eden HCV genomu, Xba I kısıtlama enzimi ile oluşturulan tek sarmallı çıkıntı mung fasulye nükleaz sindirim ile köreltildi edildi ile kesilir . Doğrusallaştırılmış plazmidin HCV kalitesi, agaroz jel elektroforezi (Şekil 2B) ile değerlendirildi. HCV DNA in vitro transkripsiyonu sonucunda aracılı T7 RNA polimerazına tabi tutulmuş ve elde edilen RNA 9.6 kilobaz (Şekil 2C) tek bir ürün elde edildi.
Biz intragenotype 2a HCV (Şekil, büyüme kinetikleri test60, 3). Huh-7.5.1 hücreleri vahşi tip (WT) ve polimeraz boş virüs in vitro transkribe RNA ile elektropore edildi. Biz RT-qPCR viral anlamda genom replikasyonu değerlendirildi. Sonuçlar, verimli bir WT virüs genomunu (Şekiller 3A ve 3B) çoğaltılmış olduğunu göstermiştir. Vahşi tip Pol-virüs ile karşılaştırıldığında genom replikasyonu 1-3 log daha yüksek bir seviyeye sergiledi. WT virüs viral protein parçalanması (proteaz) katılır NS3 proteini (Şekil 3C) ve genom replikasyonu (sarmal faaliyeti) üretir. Imüno-flüoresan deneyi (Şekil 3D) ile değerlendirildi Ayrıca WT virüs NS5A proteini ifade etmiştir. NS5A proteini, HCV RNA replikaz kompleksinin bir parçasıdır. Viral genomun replikasyonu görselleştirmek için, özellikle dsRNA tanıyan bir antikor kullanarak, çift-şeritli (ds) HCV RNA'nın varlığı incelenmiştir. HCV genom amplifikasyonu sırasında, sens RNA iplik cAnti-sens genomuna opied, böylece, iki iplikçikli bir RNA ara-enfekte hücre sitoplazması içinde mevcut bulunmaktadır. NS5A proteini ve dsRNA aktif viral replikasyonu gösteren WT transfekte edilmiş hücrelerin hücre sitoplazması (Şekil 3D) ko-lokalize eder. Birlikte ele alındığında, WT virüsü transfekte edilmiş Huh-7.5.1 hücrelerinde aktif çoğaltma kurulmuştur.
HCV İlerleme araştırma nedeniyle bir bulaşıcı hücre kültürü sisteminin yetersizliği nedeniyle sınırlı olmuştu. JFH-1 HCV gerginlik ve bize viral girişi, çeviri RNA, RNA replikasyonu ve bulaşıcı bir virüs soyu oluşumu da dahil olmak üzere hücre kültüründe HCV tüm replikasyon çevrimi incelemesine izin kimerik laboratuar suşları ve müteakip özellik tayini keşfi. HCV titresi ve de novo enfeksiyon değerlendirmek için, HCV RNA transfekte edilmiş hücrelerin hasat hücre kültür üst sıvıları, aşılanmıştır. HCV enfeksiyonu, HCV NS5A proteini tespit ile görselleştirilmiştir ve hesaplanmıştırbulaşıcı odakları (Şekil 4) sayarak viral titresi. Biz tek bir odak olarak NS5A'nın için hücrelerin izole küme (2 yılı hücreleri) pozitif olarak kabul. Sonuçlar WT virüs bulaşıcıdır ve bulaşıcı parçacığın birim / ml oluşturan 4 ila 10 den fazla eksen etrafinda ürettiğini göstermiştir.
Ayrıca Renilla lusiferaz (Rluc) raportör geni (Şekil 5A) barındıran bir raportör HCV virüs kurulmuştur. Bir muhabir HCV yüksek içerik tarama deneyleri için hem de mutant virüslerin çok sayıda test etmek için de kullanılabilir. Burada WT ve Pol-muhabiri virüslerin büyüme fenotipleri değerlendirmesini sunuyoruz. Viral genom çoğaltır, lusiferazetkinliği mesai sonrası transfeksiyonunu artacaktır. Artan genom replikasyonu düzeyleri yüksek lusiferaz aktivitesi çıkarsanabilecektir. Bu nedenle, lusiferaz aktivitesi dolaylı genom replikasyonu düzeyinin ölçülmesini içerir. WT veya Pol-vi hasat LizatlarBelirtilen zaman noktalarında ral RNA ile transfekte edilmiş hücrelerin lusiferaz aktiviteleri için test edildi. 6 saat post-transfeksiyondan, WT ve Pol-virüsler hem de (Şekil 5B) tercüme olmuştu transfekte RNA benzer giriş seviyesi gösteren, benzer lusiferaz faaliyetleri vardı. Ancak, 48 saat ve 96 saat post-transfeksiyon ile, WT virüs Pol-virüs ile karşılaştırıldığında genom replikasyonu düzeylerinde artış sergiledi. Western blot analizi (Şekil 5C) ile doğrulandı olarak da, WT virüs viral NS3 proteini üretilmektedir. Daha sonra, biz, 48 saat ve 96 saat sonrası transfekte edilmiş hücre kültürlerinden toplanan hücre içermeyen yüzer naif Huh-7.5.1 hücreleri ile inoküle WT ve Pol-haberci virüslerinin enfeksiyon test edilmiştir. WT virüs Pol-raportör virüsü (Şekil 5D) bu çoğaltmanın 2-3 log daha yüksek düzeyde elde ederken, Pol-virüsü, taban düzeyinde lusiferaz aktivitesi vardı. Sonuçlar daha sağlam bir HCV enfeksiyon hücre Cultu sahip olduğunu göstermek sistemi yeniden.
Şekil 1. HCV replikasyonu analiz akışı genel ana hatları. In vitro transkripsiyon tabi T7 RNA polimeraz promotörünü (T7p) ihtiva eden HCV plasmid yapı lineerleştirilmiş. Arıtılmış, HCV RNA genomu, Huh-7.5.1 hücrelerine elektroporasyon ve şişeler ve 48 oyuklu bir plaka içerisinde kaplanır. , 4 saat, 48 saat ve 96 saat post-transfeksiyon olarak, hücresel RNA ve kültür süpernatanları şişelerinde hasat edilir. 48-çukurlu plaka hücreler hasat protein lisatı için kullanılmaktadır ve imüno-flüoresan deneyi için sabittir. RT-qPCR Genom kopya sayısı analizi, Western blot ve ölçüm viral titer HCV çoğalmasını değerlendirmek için yapılır.
1362fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Inşa edilen plazmit DNA in vitro transkripsiyonu ile HCV genomik RNA'lar Şekil 2.. Üretimi. J6CF/JFH-1 intragenotype 2a simerik virüslerin, FNX-HCV ve HCV-FNX Pol null A) genomik organizasyonu. J6CF gergin bölge (NS2 parçası için 5'NTR) koyu gri ve JFH-1 suşu bölgeye (3'NTR için NS2 parçası) tasvir açık gri görüntülenir. NS5B polimeraz katalitik etki mutasyon (GDD AAG) bir yıldız. B) Lineerleştirilmiş HCV plazmid üreten yer Adımlar ile gösterilir. Jel resim in vitro transkripsiyon için hazır Xba I ve mung fasulye nükleaz sindirimi ile üretilen doğrusallaştırılmış, küt uçlu bir plasmid DNA'lar, göstermektedir. % 0.8 agaroz jeli DNA çözülmesi için kullanılmıştır. C) Jel resim T7 RNA polimeraz sistemi kullanılarak in vitro transkripsiyonu ile üretilen HCV genomik RNA'lar tasvir etmektedir. WT: vahşi tür; Pol-: Polimeraz null; M:işaretleyici.
Şekil 3.. HCV yapılarının büyüme fenotipleri değerlendirilmesi. A), vahşi tip (WT) ve polimeraz boş (Pol-) virüsü genomu çoğaltma kinetik değerlendirme. RT-qPCR ile değerlendirilen sens RNA sarmalının genomu kopya sayıları çubuk grafik olarak sunulmuştur. Pol-virüsünün viral genom kopyaları) replikasyon eksikli fenotipi. Oda gösteren bir zaman dönemi boyunca azalmıştır, vahşi tip HCV göreceli genom replikasyonu seviyesi Pol-HCV virüs protein ekspresyonu. C) Western blot analizi ile karşılaştırılır. HCV NS3 proteini tespit edilir ve beta-aktin hücresel kontrol. D) viral replikasyon araştırmak için imüno-flüoresan deneyi olarak kullanılır. 96 saat sonrası elektroporasyonla de hücreler tespit edildi ve İBB tabiHCV NS5A proteini ve çift-şeritli RNA (ds RNA), HCV RNA replikasyon ara maddeleri için bir marker için unostaining. Çekirdekleri Hoechst boyası (Ölçek çubuğu 50 mikron) ile görüntülendi. hpt:. saat sonrası transfeksiyon bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4,. Vahşi tür HCV'nin enfeksiyon incelenmesi ve virüs titresi ölçülmesi. A) naif Huh-7.5.1 hücreler enfeksiyon araştırmalar için kullanıldı. HCV RNA 48 ve 96 saat post-transfeksiyon (HPT) toplanan hücre içermeyen yüzer kısım, 10 misli seri seyreltme tabi tutulur ve üç kopya halinde 96 oyuklu bir plaka içerisinde, hücrelere ilave edildi. 72 saat post-enfeksiyon, hücreler sabit ve HCV NS5A proteini için boyama yapıldı. N hücrelerS5A pozitif boyanma (kırmızı) virüsü ile enfekte olmaktadır. Odakları oluşturan birim (FFU) değerlendirmek için, en yüksek seyreltide pozitif odak sayılmıştır. Görüntülerin Örnek paneller (Ölçek çubuğu 100 um). B) mililitrede FFU olarak ortalama değerleri ve viral titresi, standart sapmaları grafikte gösterilmiştir gösterilmiştir. Polimeraz boş mutant bulaşıcı parçacıklar üretmemiştir. WT: vahşi tür; Pol-:. Polimeraz boş , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5,. Genom replikasyonu ve raportör HCV enfeksiyon değerlendirilmesi. A) intragenotype 2a kimerik raportör virüsünün bir çizgi sunulmuştur. Renilla lusiferaz gen eklenir infram olduğu5'NTR ve çekirdek. B), vahşi tip ve belirtilen zaman Pol-mutant haberci virüslerinin genomunun replikasyonu kinetik post-transfeksiyon ile işaret e grafikte gösterilmiştir. Protein lizatlar 6 saat, 48 saat ve Renilla lusiferaz enzimatik aktivitesinin ölçülmesi için 96 saat zaman noktalarında toplandı. Ve ortalama her bir virüs için üç kopya halindeki değerlerin Renilla lusiferaz (RLV) için hesaplanan standart sapma grafik. C) Western lekeleme paneli HCV NS3 proteini ekspresyonunu gösterir sunulmuştur. NS3 primer antikoru ile tespit edilen bir non-spesifik antijen, bir yükleme kontrolü olarak görev yapar. Yabani-tip (WT) raportör virüsü NS3 proteininin yüksek düzeyde üretir. D) virüs enfeksiyon Analizi. Naif Huh-7.5.1 hücreleri, 48 saat ve 96 saat zaman noktalarında, transfekte kültüründen elde edilen hücre içermeyen yüzer ile aşılanmıştır. Enfekte olmuş hücrelerin Renilla lusiferaz aktiviteleri 48 saat post-enfeksiyon ile ölçüldü.Standart sapma ile ortalama değerleri grafikte gösterilmiştir. WT raportör virüs enfeksiyon yüksek düzeyini göstermiştir, oysa Pol-raportör virüsü, hücrelerin lusiferaz aktivitesi, sadece arka plan düzeyi etkilemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu şekilde, hepatit C virüs çoğaltma döngüsü analiz etmek için bir yöntem tarif eder. HCV insan patojen ve öngörülen biyogüvenlik protokolü kesinlikle takip edilmesi gerekir. Bulaşıcı HCV hücre kültür sistemleri, daha önce 11-13,16,17 tarif edilmiştir. Resimli protokolü takip ederken biz uygulamak birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, alt çalışmalar için olduğu gibi tam uzunlukta viral genomik RNA'nın iyi kalitede olması için büyük önem taşımaktadır. Viral cDNA'yı taşıyan plazmid girişi lineerize edildi ve dikkatli bir şekilde köreltilmiş edilmelidir. Xba I çıkıntı künt kullanılan mung-tane nükleaz spesifik olmayan bir nükleaz ve uzun inkübasyon viral genomun 3 'ucunun hasar ya da bozulması neden olur. Nükleaz fenol-kloroform ekstraksiyonu ya da anyon değişim sütunu saflaştırma ile belirtilen 30 dakika inkübe edildikten sonra hemen kaldırılmalıdır. DNA tedavi nükleazı Jel çıkarma olarak tavsiye edilemezenzim jel elektroforez işlemi sırasında aktiftir.
Vitro RNA transkripsiyon adımlarla için sonradan, genellikle, bir de (Rnase) kirlenme Ribonuclease en aza indirmek için geniş spektrumlu önlemleri alacaktır. Kullanılan tüm reajanlar ve malzemeler, serbest RNaz olmalıdır. Minimum RNA strand sonları ile yüksek kalitede genomik RNA oluşturmak için, RNA saflaştırma ve bir aşağı doğru işleme adımları sırasında sert vorteks ve tekrar pipetleme kaçınarak daha az fiziksel strese maruz bırakılması gerekir. RNA transkripsiyonu tamamlandıktan sonra, giriş plasmid DNA şablonları DNase (RNaz serbest) işlenerek transkribe RNA karışımı kaldırılması gerekir. Eksik kaldırma transfekte edilmiş hücrelere plasmid DNA taşınmasını neden olabilir ve çoğaltılmış viral RNA genomu, mutlak kopya sayısı ölçümü etkileyebilir. Bu nedenle 1 DNA mikrogram başına birimi ve aynı zamanda 37 ° C'de kuluçkadan DNase ilave 15 dakika olan bir konsantrasyonda DNase enzim kullanımı º C canyardımcı olur. Transkribe RNA fenol-kloroform ekstraksiyonu ya da anyon değiştirme sütunu biri ile saflaştırılabilir. Care sitotoksik ve moleküler deneyleri engelleyebilir saflaştırılmış RNA numunesi için fenol veya başka reaktifler taşınmasını önlemek için dikkat edilmelidir.
Elektroporasyon amacıyla, saflaştırılmış RNA RNase-içermeyen steril su içinde çözündürülmelidir. RNA pelet 5 dakika boyunca 65 º C örnek ısıtma, eritmek zordur eğer yardımcı olacaktır. Transkripsiyon tamamlandıktan sonra, -80 ° C'de, RNase içermeyen su içinde yapılan çalışma alikotları 10 ug hemen RNA depolamak için önemlidir Alikotları amacı, tekrarlanan donma / çözülme aracılığıyla gerçekleşen RNA bozulmasını önlemektir. Tutarlı deney sonuçları elde etmek için, aynı zamanda, tüm örnekler ve kontroller uyarlamak için tavsiye edilir. Yüksek kaliteli RNA daha yüksek bir viral titre verim için tavsiye edilir. Transfeksiyon ajanları da b göre HCV genomik RNA, polimer ve lipid olabilir transfekte etmek içine 21,22 kullanılır.
Viral ve ana faktörler büyük HCV soylarının büyüme kinetiklerini etkileyebilir. İnsan hepatoma hücre hattı (Huh-7) türevleri, Huh-7.5, Huh-ve 7.5.1-lunet Huh7 hücre hatları genel olarak viral büyüme 11-13,15 değerlendirmek için kullanılır. Huh-7.5.1 hücrelerinde bu 21 gün post-transfeksiyon 13,15 az ise Huh7-lunet hücrelerinde JFH-1 soyunun zirve viral üretimi 3-4 gün post-transfeksiyon yer almaktadır. Intragenotype 2a simerik virüs FNX-HCV JFH-1 suşu, yapısal olmayan genlere sahip olan Huh-7.5.1 hücrelerinde 19,20 4 gün sonrası transfeksiyon zirve titreye sahiptir. In vitro transkribe RNA viral üretimi için, erken geçiş insan hepatoma hücre hattı tercih edilir. Pasaj sayısının 20 Huh-7.5.1 hücreleri kullanırken Viral üretimi önemli ölçüde azalır. Elektroporasyon sonra artan hücre beka sağlamak için, Huh-7.5.1 hücreleri bir deney ve mai yapmadan önce bir iki haftalık bir iyileşme süreci tanınmıştır çözülmüş% 12% 15 FBS içinde ntained. Bu kriter ile birlikte, hemen sonra, elektroporasyon% 15 FBS ihtiva eden büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon hücrelerinin daha iyi viral üretimi sağlayan hücre hayatta kalmasını arttırır. Ilk 8 saat zaman noktasından sonra, hücreler daha sonra,% 10 FBS ihtiva eden ortama anahtarlanır. Hücre kalıntıları üzerinden taşımak en aza indirmek için, viral kültür süpernatanı 4 mikronluk bir filtreden yapılan süzme ve santrifüj işlemine tabi tutulur. Yoğunlaştırılmamış veya konsantre bir viral süpernatanlar tam olarak bölünmüş ve -80 saklanır ° C in vitro ve in vivo deneyler için de. Bu önlemler ve öneriler başarıyla HCV çoğaltma döngüsü analizini gerçekleştirmek için araştırmacılara yardımcı olabilir.
Gibi floresan protein ve Gaussia lusiferaz (Gluc) bir salgılanmış biçimi olarak bir marker geni barındıran raportör HCV'nin bir başka varyasyonu HCV araştırma 18,23,24 için tarif edilmiştir. Araştırmacılar HCV soruşturma odaklanarakgenom çoğaltma, (NS2 için genler çekirdek eksik) HCV alt-genomik replikondur değerli bir araçtır 9,10 olduğunu. HCV replikonlara böylece daha az biyo-güvenlik düzenlemeleri ve bulaşıcı hücre kültürü HCV ve klinik izolatlar karşılaştırıldığında ile çalışmak daha kolay gerektiren, bulaşıcı olmayan vardır. NS5B polimeraz aktivitesi yetersizliği HCV HCV çoğaltma döngüsü 11,12 eğitim için bir kritik kontrol olduğunu. HCV zarf glikoproteinleri (delta E1E2) eksik veya p7-NS2 aktivitesi HCV girişi, viryon morfolojilerinden ve çıkış 12,19,25-27 içeren çalışmalar için yararlı kontrol olabilir.
Sınırlamalar ile ilgili olarak, şu anda enfeksiyonlu hücre kültürü sistemi sadece HCV genotip 1 ve 2 için kullanılabilir. Otantik viral suşları tespit edilmesi henüz hücre kültürü içinde etkili bir şekilde büyüme yeteneğine sahip 3-6 genotipleri aittir. Intergenotypic rekombinant virüsler farklı genotiplerinin replikasyon döngüsü üzerinde çalışmak için yararlı alternatiflerdir. Çoğaltma yetkili kimerik virüs harborigenotipleri 1-7 ve JFH-1 genotip 2a genomundan dizisinin geri kalan 15,18 tanımlanmıştır NS2 ikinci bölgeye ng çekirdek. Diğer bir sınırlama JFH-1 ve türev kimerik soylarının verimi, bu tür viral felci ve grip gibi RNA virüsleri ile karşılaştırıldığında nispeten düşük olduğu 10 Mart-10 Haziran başına ml aralığında olmasıdır. Güçlü büyüme ile HCV gerginlik geliştirilmesi gerekmektedir. Gelecek soruşturma güçlü antiviral belirlemek ve HCV enfeksiyonunun önlenmesi için aşı adayları geliştirmeye odaklanmak yüksek verimli bir arşiv taraması için raportör HCV kullanımını içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
