Abstract
Hepatitis C virus (HCV) treft 3% van de wereldbevolking en veroorzaakt ernstige leverkwalen waaronder chronische hepatitis, cirrose en leverkanker. HCV is een omhuld RNA-virus van de familie Flaviviridae. Voor deze behandeling niet volledig effectief en veroorzaakt bijwerkingen. Er is geen HCV-vaccin. Aldus is verdere inspanningen vereist voor een vaccin te ontwikkelen en betere therapie. Een HCV celcultuur systeem is essentieel voor het bestuderen van verschillende groeistadia HCV waaronder virale binnenkomst, genoom replicatie, verpakking en uitgang. In de huidige werkwijze voorgesteld, gebruikten we een wildtype intragenotype 2a chimeer virus, FNX-HCV, en een recombinant FNX-Rluc virus met een Renilla luciferase reportergen de virusreplicatie te bestuderen. Een menselijke hepatoomcellijn (Huh-7 gebaseerde) werd gebruikt voor transfectie in vitro getranscribeerde RNA HCV genoom. Celvrije kweeksupernatanten, eiwit lysaten en total RNA werden geoogst op verschillende tijdstippen na transfectie groei HCV beoordelen. HCV-genoom replicatie status werd geëvalueerd door kwantitatieve RT-PCR en visualiseren van de aanwezigheid van HCV dubbelstrengs RNA. De HCV-eiwitexpressie werd bevestigd door Western blot en immunofluorescentie assays met antilichamen specifiek voor HCV NS3 en NS5A eiwitten. HCV RNA getransfecteerde cellen vrijgegeven infectieuze deeltjes in de cultuur supernatant en de virale titer werd gemeten. Luciferasebepalingen werden gebruikt om de replicatie niveau en de besmettelijkheid van reporter HCV beoordelen. Samenvattend stellen wij diverse virologische assays voor het karakteriseren van verschillende stadia van de HCV replicatie cyclus.
Introduction
Hepatitis C virus (HCV) veroorzaakt cirrose en leverkanker. Het treft 170 miljoen mensen wereldwijd met 350.000 mensen sterven jaarlijks 1-3. HCV is een positieve streng RNA-virus met een genoom grootte van 9,6 kb. Het HCV-genoom wordt vertaald als een polyproteïne van ~ 3000 aminozuurresten die proteolytisch wordt gesplitst door verschillende cellulaire en virale proteasen in 10 polypeptiden. HCV is het prototype virus in het geslacht Hepacivirus en behoort tot de familie Flaviviridae 4. Bij blootstelling HCV vestigt een chronische infectie bij 80% van de individuen. De infectie is meestal asymptomatisch en tijdige diagnose kan therapeutische interventie aan de lever achteruitgang te voorkomen toe te staan. Huidige behandeling niet optimaal en er geen vaccin beschikbaar is 5,6.
De etiologie van hepatitis C werd eerst beschreven in 1989 7. Bestuderen HCV replicatie is belangrijk voor hepatitis C vaccin en behandelingsonderzoek, maar het waslang gehinderd door het ontbreken van een efficiënt viraal kweeksysteem. Een moleculaire kloon van HCV werd aangetoond besmettelijk bij chimpansees op intrahepatische inoculatie 8 zijn. Vervolgens werden sub-genomische HCV replicons beschreven, waardoor het virale genoom replicatie stadium ontleden in een celkweeksysteem 9,10. Ontdekking van een genotype 2a HCV isoleren JFH-1 (Japanse Fulminante hepatitis-1), kunnen infecteren celkweek nieuwe wegen geopend voor HCV replicatie onderzoek 11-13. Genotype 2a stam JFH-1 gebaseerde inter-en intra-genotypische chimere virussen en genotype 1 HCV gebaseerd besmettelijke cultuur systemen zijn ook beschikbaar 14-18.
We hebben met succes gebruik JFH-1 stam en HCV intragenotype 2a chimere virus aan de hoge-resolutie functionele profilering kaart van eiwit domeinen en cis-werkende RNA elementen 19,20 te verkrijgen. Volgens deze hier beschrijven we een effectieve systeem routinematig gebruikt waarmeebestuderen van verschillende stadia van de HCV replicatiecyclus en gastheer-pathogeen interactie. We presenteren virologische assays virale genoom replicatie en de novo infectiviteit van intragenotype 2a HCV en Renilla luciferase reportergen HCV beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een algemeen overzicht van het protocol is geïllustreerd in figuur 1.
1. Cellen
- Bereid compleet groeimedium dat 10-15% foetaal runderserum (FBS), 10 mM niet-essentiële aminozuren, 10 mM Hepes, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 mg / ml) en 2 mM L-glutamine bevat.
- Handhaaf Huh-7.5.1 cellen 13 volledig groeimedia die de hierboven supplementen voor in vitro analyse van hepatitis C virale replicatiecyclus.
- Cultuur virusstammen in Huh-7.5.1 cellen met de gespecificeerde aangevuld kweekmedium bij 37 ° C met 5% CO2.
2. Virus en plasmideconstructen
- Genereer de complementaire DNA (cDNA) vorm van HCV RNA en het kloneren in een plasmide vector voor het gemak van genetische manipulatie. Opmerking: De ontdekking van de Japanse fulminante hepatitis 1, JFH-1 (HCV genotype 2a), isoleer heeft kritisch voor onderzoek HCV geweest envoornamelijk voor het HCV replicatiecyclus 11-13 bestuderen. Inter-en intragenotypic chimère virussen gebaseerd op JFH-1 HCV worden vaak gebruikt in onderzoek 14-18. Bouw van synthetische intragenotype 2a chimere virus, FNX-HCV, en een monocistronische chimere reporter stam was eerder 19 en bouwdetails vallen buiten het bestek van dit protocol beschreven.
- Gebruik pFNX-HCV intragenotype 2a virus als het bevat een 5'NTR structurele gebieden en p7, en een deel van de NS2 niet-structurele gebieden (nucleotiden 1-2878) van de J6CF ouderstam (toegangsnummer NCBI Nr. AF177036), zoals alsook de niet-structurele componenten van de JFH-1 virale stam (NCBI toetreding geen. AB047639). Opmerking: FNX-HCV werd gesynthetiseerd gebaseerd op de sequentie van Jc1 intragenotype 2a chimere HCV eerder gerapporteerd 15.
- Genereer een monocistronisch chimere reporter viraal construct, de pFNX-Rluc basis van de pFNX-HCV-stam (aangehaald in stap 2.2) door er een Renilla luciferasegen tussen de 5 'NTR en core-gen (tussen nt 388 en 389). Vervolgens sluit u de luciferasegen en core-gen van deze constructie gebruik van een mond-en klauwzeer virus 2A (F2A) peptide sequentie, die zou werken als een decollete signaal.
- Ingenieur het RNA-polymerase-null (Pol-) virale construct met behulp van de pFNX-HCV of het pFNX-Rluc virale achtergrond. Vervang de NS5B polymerase katalytische residuen GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), een van deze virale backbones met AAG aminozuurresten.
3. In vitro HCV RNA transcriptie
- Gebruik een intragenotype 2a chimere virus FNX-HCV en FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV voor de evaluatie van virale replicatie (Figuur 2A).
- Lineariseren de virale plasmiden met restrictie-enzym XbaI en daarna behandelen met mung bean nuclease om stompe uiteinden te genereren. Zuiver het verteerd plasmiden door anionenwisselingschromatografie. Controleer de integriteit of het gelineariseerde plasmide-DNA door het onderwerpen gelelektroforese (figuur 2B) agarose.
- Transcriberen de gelineariseerde virale plasmiden met de T7-RNA polymerase.
- Zuiver het nieuw gesynthetiseerde DNase behandelde RNA met een RNA zuiveringskit.
- Controleer de RNA productie door agarose gelelektroforese (figuur 2C).
- Kwantificeren van de RNA door spectrofotometrie.
- Bewaar de gegenereerde RNA -80 ° C in 10 ug aliquots werken. Opmerking: variatie RNA kwaliteit minimaliseren binnen elke proefopzet transcriberen alle RNA voor elk monster en virale controle tegelijk.
4. HCV RNA Transfectie en Sample Collection
- Oogst de Huh-7.5.1 cellen met behulp van trypsine.
- Om cellen, centrifuge spoelen en resuspendeer de schorsing tweemaal met koude laag serum media. Resuspendeer de cellen in laag serum media 1 x 10 7 cellen per ml.
- Meng een totaal van 10 & #956, g getranscribeerd viraal RNA met 400 ul van geresuspendeerde cellen (4 x 10 6 cellen) in een 0,4 cm elektroporatie-cuvette. Transfecteren de cellen via elektroporatie bij 270 V, 100 Ω en 950 uF.
- Resuspendeer de geëlektroporeerde cellen in 10 ml compleet kweekmedium met 15% FBS. Opmerking: Verhoogde overlevingsvermogen van geëlektroporeerde cellen wordt gezien wanneer de Huh-7.5.1-cellen werden gekweekt in 15% foetaal runderserum.
- Plaat de cellen in zowel T-25 kolven (~ 1,2 x 10 6 cellen per kolf) en 48 putjes (1 x 10 4 cellen per putje) voor elk van de volgende tijdstippen: 4, 48 en 96 uur.
- Vervang het medium bij 4-8 uur na transfectie met verse AANGEVULD groeimedium met 10% FBS om dode celresten uit de gekweekte kolven en platen te verwijderen.
- Oogst celcultuur supernatanten op 48, 96 uur tijdstippen en cellulaire resten te verwijderen van verzamelde monsters door centrifugering van cellen bij 1500 rpm gedurende 10 min bij 4 º C.
- Bewaar de cel-vrije supernatanten bij -80 º C. Lyseren van de cellen op eiwit en RNA analyse door Western blot en omgekeerde transcriptie-kwantitatieve PCR op de aangegeven tijdstippen.
5. Reverse transcriptie-kwantitatieve PCR (RT-qPCR) voor het beoordelen van de HCV-exemplaren van het genoom
- Voer een twee-staps RT-qPCR aan de HCV RNA genoom aantal kopieën te bepalen.
- Reverse transcriptie 1 ug totaal cellulair RNA met behulp van reverse transcriptase en een primer specifiek voor HCV sense streng die bindt aan 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') of een primer specifiek voor huishoud-gen peptidylprolyl isomerase G (R PPIG : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Ook reverse transcriberen FNX-HCV-RNA (gegenereerd in stap 3) van bekende exemplaren van het genoom (10 januari-10 september-standaard) met sense HCV streng primer.
- Verricht qPCR met behulp van 50 ng van de resulterende getranscribeerd cDNA met behulp van specifieke primers HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') en DNA bindende groene kleurstof bevattende qPCR super mix. Voer qPCR voor huishoud-gen PPIG evenals (primers PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Opmerking: Voor de berekening van accurate intracellulair HCV-RNA-niveau in monsters, gebruiken cellulaire huishoud-gen, PPIG , expressie (Ct cyclus) voor normalisatie. Gebruik het aantal kopieën van de FNX-HCV-genoom als de standaard voor het aantal kopieën bepalen.
- Gebruik de volgende voorwaarden bij het uitvoeren van qPCR HCV RNA aantal kopieën te bepalen: 95 º C gedurende 15 seconden en 60 º C gedurende 30 sec (40 cycli) met behulp van real-time PCR-systeem.
- Zie Figuren 3A en 3B voor genoomreplicatie resultaten.
6. Western blot analyse voor het detecteren van HCV-eiwitexpressie (figuur 3C)
- Gebruik cellysaten frOM viraal RNA getransfecteerd bij 96 uur na transfectie voor eiwit western blotting analyse.
- Los het cellysaat met SDS-PAGE en transfer naar polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan.
- Blokkeer het membraan met behulp van een blokkerende oplossing die 5% magere melk, 0,2% Tween 20 in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Incubeer het membraan met primaire muis monoklonaal antilichaam NS3 (1 op 1000 verdunning) en beta-actine (1 op 5000 verdunning).
- Add geit anti-muis IgG geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (1 in 5000 verdunning) en gedetecteerd door chemiluminescentie.
7. Immunofluorescentietest (IFA)
- Bevestig de HCV-geïnfecteerde en getransfecteerde cellen met methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C voor immunofluorescentie assay.
- Was de cellen met PBS drie keer en blokkeren met IFA blokkerende buffer.
- Gebruik konijn polyklonaal anti-NS5A primair antilichaam (vriendelijk verschaft door Dr Dasgupta, UCLA) of muizen monoklonale anti-DSRNA antilichaam J2 bij een verdunning van 1:200 (1 ug / ml) en incubeer gedurende 5 uur 's nachts bij 4 º C.
- Was de cellen met PBS driemaal na het primaire antilichaam.
- Add geit anti-konijn IgG polyklonaal 488 secundair antilichaam of geit anti-muis IgG polyklonaal 594 secundair antilichaam bij een 1:1000 verdunning (1 ug / ml) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de cellen met PBS drie keer en vlek kernen met behulp van Hoechst kleurstof en bekijken met behulp van fluorescentie microscoop (Figuur 3D).
8. Meten virustiter
- Plate naïeve Huh-7.5.1 cellen bij ongeveer 3 x 10 3 cellen / putje met een 96-wells plaat. De volgende dag voeren 10-voudige seriële verdunningen van celvrij supernatant geoogst van HCV RNA getransfecteerde cellen met kweekmedium en beënt in drievoud op Huh-7.5.1 cellen.
- Fix cellen op 72 uur na infectie met behulp van methanol (30 minuten bij -20
- Gebruik de hoogste verdunning te tellen voor de NS5A positieve brandpunten en bereken het gemiddelde aantal van de focus vormende eenheid (FFU) per milliliter. Zie Figuur 4 voor HCV titer.
9. Renilla luciferasereporter test voor virale genoom replicatie en besmettelijkheid
- Voor evaluatie virale genoom replicatie, plaat HCV-RNA geëlektroporeerd Huh-7.5.1 cellen in drievoud in 48 putjes (1 x 10 4 cellen / putje).
- Lyseren van de cellen met 75 ul van passieve lysis buffer bij de 6 uur, 48 uur en 96 uur na transfectie.
- Schud de platen voorzichtig gedurende 15 min bij kamertemperatuur en bewaar bij -80 ° C.
- Om de Renilla luciferase enzymatische activiteit te meten, dooi lysaat eiwit en Renilla luciferase assay reagens op kamertemperatuur.
- Voeg 20 ul van eiwit lysaat per putje van een 96-wel l witte luminescentie plaat en plaats de plaat in een lichtmeter.
- Doseer 100 ul Renilla luciferasetest reagens (coelenterazine substraat + buffer) per goed en na 2 sec pre-lezen vertraging; integreren het uitgezonden licht gedurende 10 sec.
- Bereken het gemiddelde en standaardafwijking voor elk monster uit de luciferase waarden van biologische drievoud en onderwerpt de gegevens aan statistische analyse (figuur 5).
- Ter beoordeling van infectiviteit, enten 500 ui celvrij supernatant, verkregen uit HCV-RNA-getransfecteerde cellen voor de aangegeven tijdstippen (48 uur en 96 uur) in drievoud op naïeve Huh-7.5.1 cellen in 48-well platen.
- Vervang de virale inoculum met 500 ul vers medium per well na 6 uur na infectie.
- Lyse van de cellen op 48 uur na infectie en onderworpen aan Renilla luciferase assay zoals beschreven in stap 8,2-8,7 (figuur 5).
- De fout bars in de grafieken geven standaarddeviaties (SD). De P-waarden werden berekend door de ongepaarde t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatitis C virus is een RNA-virus. Aldus genetische manipulatie Daartoe heeft de HCV genome cDNA gekloneerd in een bacterieel plasmide vector. Een T7 RNA polymerase promotersequentie werd onmiddellijk voor het einde van het HCV genoom van de 5 'geïntroduceerd. Een algemeen overzicht van de analyse HCV werkstroom weergegeven in figuur 1. HCV RNA genoom genereren nauwkeurige 3 'uiteinde, is het HCV-genoom bevattende plasmide geknipt met XbaI restrictie-enzym en de gegenereerde enkelstrengs overhang werd stomp gemaakt met Mung bean nuclease digestie . De kwaliteit van het gelineariseerde plasmide HCV werd bepaald door agarose gelelektroforese (figuur 2B). De HCV-DNA werd onderworpen aan T7 RNA polymerase gemedieerde in vitro transcriptie en de resulterende RNA leverde een product op 9.6 kilobasen (figuur 2C).
We testten de groei kinetiek van een intragenotype 2a HCV (Figuur60, 3). De Huh-7.5.1-cellen werden geëlektroporeerd met in vitro getranscribeerde RNA van wild-type (WT) en polymerase null virussen. We evalueerden de virale sense genoom replicatie door RT-qPCR. Resultaten gaven aan dat de WT virus gerepliceerd het genoom efficiënt (Figuren 3A en 3B). De wildtype 02:59 log hoger genoom replicatie vertoonden vergeleken met die van Pol-virus. De WT virus produceert NS3-eiwit (Figuur 3C) dat betrokken is bij virale eiwit splitsing (protease-activiteit) en genoom replicatie (helicase activiteit). Ook de WT virus expressie NS5A eiwit zoals bepaald met immunofluorescentie assay (figuur 3D). NS5A eiwit behoort tot de HCV RNA replicase complex. Virale genoom replicatie visualiseren, onderzochten we de aanwezigheid van dubbelstrengs (ds) RNA HCV met een antilichaam dat specifiek herkent dsRNA. Tijdens HCV genoom amplificatie, de sense streng RNA copied anti-sense genoom, waardoor het dubbelstrengs RNA tussenproducten aanwezig zijn in de geïnfecteerde cel cytoplasma. De NS5A eiwit en dsRNA co-lokaliseert in de cellulaire cytoplasma (Figuur 3D) WT getransfecteerde cellen suggereert de actieve virale replicatie. Samen genomen, de WT-virus vastgesteld actieve replicatie in getransfecteerde Huh-7.5.1 cellen.
Vooruitgang in onderzoek HCV was beperkt door gebrek aan een besmettelijke celcultuur. De ontdekking van JFH-1 HCV-stam en de daaropvolgende karakterisering van chimere laboratoriumstammen konden we de volledige HCV replicatiecyclus onderzoeken celkweek zoals virale binnenkomst, RNA translatie, RNA-replicatie en vorming van infectieuze virale nageslacht. Om de HCV titer en de novo besmettelijkheid beoordelen, we geënt de cel-kweeksupernatanten geoogst van HCV RNA getransfecteerde cellen. De HCV-infectie werd gevisualiseerd door het detecteren van het HCV NS5A eiwit en berekendede virale titer door optelling van de infectieuze foci (figuur 4). We overwogen geïsoleerde cluster van cellen (meer dan 2 cellen) positief voor NS5A als een aandachtspunt. Resultaten gaven aan dat de WT virus is besmettelijk en produceert meer dan 10 4 brandpunten vormende eenheden / ml van besmettelijke deeltjes.
Daarnaast hebben we een HCV verslaggever virus herbergen Renilla luciferase (Rluc) reporter-gen (figuur 5A). Een reporter HCV kan worden gebruikt voor het testen talrijke mutante virussen en voor high content assays. Hier presenteren we de beoordeling van de groei fenotypen van WT en Pol-reporter virussen. Als het virale genoom repliceert, zou de luciferase activiteit overwerk na transfectie verhogen. De verhoogde genoom replicatie niveaus kan worden afgeleid uit verhoogd luciferaseactiviteit. Vandaar dat de luciferaseactiviteit bepaald indirect meten van het niveau van genoom replicatie. De geoogste WT of Pol-vi lysatenral RNA getransfecteerde cellen op aangegeven tijdstippen werden getest op luciferase-activiteiten. Op 6 uur na transfectie, zowel WT en Pol-virussen hadden vergelijkbare luciferase activiteiten aangeeft vergelijkbare ingangsniveau van getransfecteerde RNA dat vertaald was (Figuur 5B). Maar op 48 uur en 96 uur na transfectie, de WT virus vertoonden verhoogde genoom replicatie niveaus vergeleken met die van Pol-virus. Ook de WT virus geproduceerd viraal NS3 eiwit zoals geverifieerd door Western blotting analyse (figuur 5C). Vervolgens hebben we de infectiviteit van WT en Pol-reporter virus getest door inoculeren naïeve Huh-7.5.1 cellen met de celvrije supernatanten verzameld 48 uur en 96 uur post getransfecteerde celculturen. De Pol-virus hadden base-level luciferase-activiteit, terwijl de WT virus had 2-3 log hoger niveau van replicatie met dat van Pol-reporter virus (Figuur 5D). Resultaten tonen aan dat we een robuuste HCV besmettelijke cel cultu re systeem.
Figuur 1. Algemeen overzicht van HCV replicatie analyse workflow. Gelineariseerd HCV plasmideconstruct met T7 RNA polymerase promotor (T7p) onderworpen aan onderzoek in vitro transcriptie. De gezuiverde HCV-RNA-genoom wordt geëlektroporeerd in Huh-7.5.1 cellen en uitgeplaat in vaten en 48-well plaat. Bij 4 uur, 48 uur en 96 uur na transfectie, het cellulair RNA en kweeksupernatanten worden geoogst van kolven. De cellen van de 48-well plaat worden gebruikt voor het oogsten eiwit lysaat en worden vastgesteld voor immunofluorescentie assay. Genome aantal kopieën analyse door RT-qPCR, Western blotting en het meten van de virale titer worden gedaan om de HCV replicatie beoordelen.
1362fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figuur 2. Productie van HCV RNA genoom door in vitro transcriptie van plasmide-DNA's geconstrueerd. A) Genomic organisatie van de J6CF/JFH-1 intragenotype 2a chimere virussen, FNX-HCV en FNX-HCV Pol null. De J6CF stam regio (5'NTR om een deel van NS2) is afgebeeld in donkergrijs en de JFH-1 stam regio (een deel van NS2 te 3'NTR) wordt weergegeven in lichtgrijs. NS5B polymerase katalytische domein mutatie (GDD naar AAG) wordt aangegeven met een asterisk. B) Stappen die betrokken zijn bij het genereren van gelineariseerde HCV plasmide. Gel foto toont de gelineariseerde, stompe uiteinden plasmide-DNA's geproduceerd door Xbal en mungboonnuclease spijsvertering, klaar voor in vitro transcriptie. 0,8% agarosegel werd gebruikt voor het oplossen van het DNA. C) Gel foto toont de HCV genome RNA geproduceerd door in vitro transcriptie met behulp van de T7 RNA polymerase systeem. WT: wild-type; Pol-: Polymerase null; M:marker.
Figuur 3. Beoordelen van de groei fenotypes van HCV-constructen. A) Het evalueren van het genoom replicatie kinetiek van wild-type (WT) en polymerase null (Pol-) virussen. Het genoom kopie aantallen sense RNA-streng bepaald door RT-qPCR worden weergegeven in het staafdiagram. Het virale genoom kopieën van Pol-virus daalde over de periode van tijd aangeeft replicatie deficiënt fenotype. B) Relatieve genoomreplicatie niveau van wild-type HCV wordt vergeleken met die van Pol-virus. C) Western blot analyse van HCV-eiwit expressie. HCV NS3-eiwit wordt gedetecteerd en beta-actine gebruikt als een cellulair controle. D) immunofluorescentie assay voor het onderzoeken van virale replicatie. Op 96 uur na elektroporatie werden de cellen gefixeerd en onderworpen aan immunostaining voor HCV NS5A eiwit en dubbelstrengs RNA (ds-RNA), een marker voor HCV-RNA-replicatie tussenproducten. De kernen werden gevisualiseerd met Hoechst vlek (Schaal bar 50 micrometer). hpt:. uur na transfectie Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Onderzoeken van de infectiviteit van wildtype HCV en meten virustiter. A) Naïve Huh-7.5.1 cellen werden gebruikt voor infectie studies. De celvrije supernatant verzameld op 48 en 96 uur na transfectie (HPT) van HCV-RNA werden onderworpen aan 10-voudige seriële verdunning en toegevoegd aan de cellen in een 96-wells plaat in drievoud. 72 uur na infectie werden de cellen gefixeerd en immunogekleurd voor HCV NS5A eiwit. De cellen met NS5A positieve kleuring (rood) zijn geïnfecteerd met het virus. Voor de beoordeling van Focussen Forming Unit (FFU), de positieve brandpunten op het hoogste verdunning werden geteld. Representatieve panelen afbeeldingen getoond (schaalmaat 100 pm). B) Gemiddelde waarden en standaarddeviaties van virale titer in FFU per milliliter zijn weergegeven in de grafiek. De polymerase null mutant produceerde geen infectieuze deeltjes. WT: wild-type; Pol-:. Polymerase null Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Evaluatie van het genoom replicatie en besmettelijkheid van reporter HCV. A) Een cartoon van intragenotype 2a chimere reporter virus wordt gepresenteerd. De Renilla luciferasegen wordt ingevoegd Inframe tussen 5'NTR en core. B) Het genoom replicatie kinetiek van wildtype en Pol-reporter mutante virussen bij bepaalde tijdstippen na transfectie weergegeven in de grafiek. Eiwitlysaten werden geoogst op 6 uur, 48 uur en 96 uur tijdstippen voor het meten Renilla luciferase enzymatische activiteit. De gemiddelde en standaard afwijking van triplo Renilla luciferase-waarden (RLV) voor elk virus worden in de grafiek. C) Western blotting paneel toont het HCV-NS3-eiwit expressie. Een niet-specifiek antigen gedetecteerd door NS3 primaire antilichaam dient als beladingscontrole. Wild-type (WT) verslaggever virus produceert hoog niveau van NS3-eiwit. D) Analyse van virusinfectiviteit. Naïve Huh-7.5.1-cellen werden geïnoculeerd met de celvrije supernatant verkregen uit getransfecteerde kweken bij 48 uur en 96 uur tijdstippen. Renilla luciferase activiteiten van geïnfecteerde cellen werden gemeten op 48 uur na infectie.Gemiddelde waarden met standaarddeviatie worden weergegeven in de grafiek. De Pol-reporter virus geïnfecteerde cellen alleen achtergrondniveau van luciferase-activiteit hadden, terwijl WT reporter virus vertoonden hoge mate van besmettelijkheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze illustratie beschrijft een werkwijze voor het analyseren van het hepatitis C virus replicatie cyclus. HCV is een menselijk pathogeen en het voorgeschreven protocol inzake bioveiligheid moeten strikt worden opgevolgd. Besmettelijke HCV celkweek systemen zijn eerder 11-13,16,17 beschreven. Er zijn enkele cruciale punten die we bij het volgen van de geïllustreerde protocol te implementeren. Ten eerste is het van groot belang om een goede kwaliteit van intacte volledige lengte viraal genomisch RNA voor downstream studies. De ingang plasmide dat het virale cDNA eruit worden gelineariseerd en zorgvuldig afgerond. De mung-bean nuclease gebruikt om de XbaI overhangende stompe is een niet-nuclease en langdurige incubatie leidt tot schade of afbraak van 3-uiteinde van viraal genoom. De nuclease moet onmiddellijk na de gespecificeerde 30 min incubatie van fenol-chloroform extractie of anionenuitwisselende kolom zuivering verwijderd. Gel extractie van nuclease behandeld DNA kan niet worden aanbevolen als deenzym is actief tijdens gelelektroforese proces.
Voor de volgende in vitro RNA transcriptie stappen, over het algemeen, zal men ook een breed spectrum voorzorgsmaatregelen voor het minimaliseren van ribonuclease (RNase) verontreiniging te nemen. Alle reagentia en de gebruikte materialen moeten vrij worden RNase. Om kwalitatief hoogwaardige genomische RNA met minimale RNA breuken te genereren, moet het RNA tot minder fysieke belasting te worden onderworpen door het vermijden van harde vortexen en herhaald pipetteren tijdens de zuivering en downstream handling stappen. Na voltooiing van RNA transcriptie, de ingang plasmide-DNA templates van getranscribeerd RNA mengsel worden verwijderd door DNase (RNase-free) behandeling. Onvolledige verwijdering kan leiden tot overdracht van plasmide DNA in getransfecteerde cellen en de invloed op de kwantificering van absolute genoom kopie aantal gerepliceerde viraal RNA. Vandaar gebruiken DNase enzym bij een concentratie van 1 eenheid per microgram DNA en ook met extra 15 min DNase incubatie bij 37 º C kanhelpen. De getranscribeerde RNA kan worden gezuiverd door een fenol-chloroform extractie of anionuitwisselingskolom. Voorzichtigheid is geboden bij overdracht van fenol of andere reagentia te vermijden om het gezuiverde RNA-monster, die cytotoxische kan zijn en interfereren met de moleculaire assays.
Voor elektroporatie doeleinden, gezuiverde RNA moet worden opgelost in RNase-vrij steriel water. Als de RNA pellet is moeilijk oplosbaar, verwarmen van het monster op 65 ° C gedurende 5 min. helpen. Na transcriptie is voltooid, is het belangrijk om het RNA direct opslaan in 10 ug werkzaam monsters in RNase-free water bij -80 ° C. Het doel van de monsters is herhaalde vries / ontdooi gemedieerde RNA afbraak te voorkomen. Voor consistente experimentele resultaten, is het raadzaam om alle monsters en controles op hetzelfde moment transcriberen. Hoogwaardige RNA wordt aanbevolen voor een hogere virale titer opbrengst. Voor transfecteren HCV RNA genoom, polymeer en lipide-gebaseerde transfectieagentia kan ook be gebruikt 21,22.
Virale en gastheer factoren grote invloed op de groei kinetiek van HCV-stammen. Human hepatomacellijn (Huh-7) derivaten Huh-7.5, Huh-7.5.1 en Huh7-Lunet cellijnen worden vaak gebruikt voor het evalueren van virale groei 11-13,15. De piek van virale productie JFH-1-stam in Huh7-Lunet cellen 3-4 dagen na transfectie, terwijl in Huh-7.5.1 cellen is op 21 dagen na transfectie 13,15. De intragenotype 2a chimere virus FNX-HCV met niet-structurele genen van JFH-1 stam heeft piektiter op 4 dagen na transfectie in Huh-7.5.1 cellen 19,20. Voor virale productie van in vitro getranscribeerde RNA, wordt vroeg passage menselijke hepatomacellijn voorkeur. Virale productie is aanzienlijk verminderd tijdens het gebruik Huh-7.5.1 cellen over passage nummer 20. Tot verhoogde cel overlevingskansen te verzekeren na elektroporatie, ontdooid Huh-7.5.1 cellen zijn toegestaan een twee weken durende herstelperiode voor het uitvoeren van een experiment en maintained in 12% -15% FBS. Naast dit criterium resuspensie van de cellen in kweekmedium bevattende 15% FBS onmiddellijk na elektroporatie verhoogt de celoverleving is waarmee de virusproductie. Na de eerste 8 uur tijdstip worden de cellen vervolgens in media met 10% FBS. Om de overdracht via cellulair puin te minimaliseren, is de virale kweeksupernatans onderworpen aan centrifugeren en filtratie door 4 micron filter. De niet-geconcentreerd of geconcentreerde virale bovenstaande vloeistoffen worden in porties verdeeld en opgeslagen in -80 ° C voor verdere in vitro en in vivo experimenten. Deze voorzorgsmaatregelen en suggesties kan onderzoekers helpen voor het succesvol uitvoeren van de analyse van HCV replicatie cyclus.
Een andere variant van verslaggever HCV dat een marker gen herbergt zoals fluorescerende eiwit en een uitgescheiden vorm van Gaussia luciferase (Gluc) zijn beschreven voor onderzoek HCV 18,23,24. Voor onderzoekers gericht op het onderzoeken van HCVgenoomreplicatie, HCV sub-genomische replicon (ontbreekt de genen kern NS2) is een waardevol instrument 9,10. HCV replicons, zijn niet besmettelijk, dus minder bio-veiligheidsvoorschriften en gemakkelijker om mee te werken in vergelijking met de besmettelijke celkweek HCV-en klinische isolaten vereisen. HCV-deficiënt zijn in NS5B polymerase activiteit is een kritische controlepunten voor het bestuderen van HCV replicatie cyclus 11,12. HCV ontbreekt envelopglycoproteïnen (delta e1e2), of p7-NS2 activiteit kan nuttig zijn controles voor studies met HCV binnenkomst, virion morfogenese en uitgang 12,19,25-27.
Wat beperkingen momenteel infectieuze celcultuur is alleen beschikbaar voor HCV genotype 1 en 2. Authentieke virale stammen behoren tot genotypes 3 tot 6 die efficiënt kunnen groeien in celkweek nog niet geïdentificeerd zijn. Intergenotypic recombinante virussen zijn bruikbare alternatieven voor het bestuderen replicatiecyclus van verschillende genotypen. Replicatiecompetent chimere virus Harboring kern NS2 gebied van genotypen 1-7 en de rest van de sequentie van JFH-1 genotype 2a genoom werden beschreven 15,18. Een andere beperking is dat de virale opbrengst van JFH-1 en zijn afgeleide chimère stammen in het traject van 10 maart - 10 juni per ml, die relatief laag vergeleken met die van andere RNA virussen zoals influenza en polio. HCV-stam met een sterke groei moet worden ontwikkeld. Toekomstig onderzoek omvat het gebruik van de reporter HCV voor hoge-doorvoer screening bibliotheek potente antivirale identificeren en richten op het ontwikkelen vaccinkandidaten voor het voorkomen van HCV-infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
