Abstract
L'hépatite C (VHC) affecte 3% de la population du monde et provoque des maladies graves du foie comme l'hépatite chronique, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Le VHC est un virus à ARN enveloppé de la famille des Flaviviridae. Le traitement actuel n'est pas pleinement efficace et provoque des effets secondaires indésirables. Il n'ya pas de vaccin disponible VHC. Ainsi, la poursuite des efforts est nécessaire pour développer un vaccin et une meilleure thérapie. Un système de culture cellulaire du VHC est essentielle pour l'étude des diverses étapes de la croissance de VHC, y compris l'entrée virale, la réplication du génome, à l'emballage, et la sortie. Dans la procédure actuelle présentée, nous avons utilisé un virus de type sauvage intragenotype 2a chimérique, FNX-VHC, et un virus recombinant FNX-Rluc portant un gène rapporteur de la luciférase Renilla pour étudier la réplication du virus. Une lignée cellulaire d'hépatome humain (Huh-7 repose) a été utilisé pour la transfection in vitro de transcrits ARN génomiques du VHC. Surnageants de culture sans cellules, des lysats de protéines et total ARN ont été récoltés à divers moments post-transfection pour évaluer la croissance du VHC. Génome HCV état de réplication a été évaluée par RT-PCR quantitative et la visualisation de la présence de HCV ARN double brin. L'expression de la protéine du VHC a été vérifiée par blot et immunofluorescence dosages Western en utilisant des anticorps spécifiques des protéines du VHC NS3 et NS5A. les cellules transfectées de l'ARN du VHC libérés des particules infectieuses dans le surnageant de culture et le titre viral a été mesuré. dosages de la luciférase ont été utilisées pour évaluer le niveau de réplication et l'infectiosité de reporter le VHC. En conclusion, nous présentons diverses analyses virologiques pour caractériser les différentes étapes du cycle de réplication du VHC.
Introduction
L'hépatite C (VHC) provoque une cirrhose et un cancer du foie. Elle touche 170 millions de personnes dans le monde avec 350 000 personnes meurent chaque année 1-3. Le VHC est un virus à ARN à brin positif ayant une taille de génome de 9,6 kb. Le génome du VHC est traduit en une seule polyprotéine de ~ 3000 résidus d'acides aminés qui est clivée de manière protéolytique par diverses proteases cellulaires et virales en 10 polypeptides. Le VHC est le virus prototype du genre Hepacivirus et appartient à la famille des Flaviviridae 4. Lors de l'exposition, le VHC établit une infection chronique chez 80% des individus. L'infection est souvent asymptomatique et en temps opportun diagnostic peut permettre une intervention thérapeutique pour prévenir la détérioration du foie. Le traitement actuel est sous-optimale et aucun vaccin n'est disponible 5,6.
L'étiologie de l'hépatite C a été décrite pour la première en 1989 7. Etudier la réplication du VHC est important pour l'hépatite C vaccin et la recherche de traitement, mais il avait étélongue entravée par l'absence d'un système de culture virale efficace. Un clone moléculaire du VHC a été montré pour être infectieux chez les chimpanzés sur inoculation intrahépatique 8. Par la suite, des réplicons du VHC sub-génomiques ont été décrites, qui ont permis de disséquer l'étape de réplication du génome viral dans un système de 9,10 de la culture cellulaire. Découverte d'un VHC de génotype 2a isoler JFH-1 (hépatite fulminante-1 japonais), capable d'infecter la culture cellulaire a ouvert de nouvelles voies pour la recherche de la réplication du VHC 11-13. Souche de génotype 2a JFH-1 des systèmes de culture à base infectieuses basé virus chimériques inter-et intra-génotypiques et VHC de génotype 1 sont disponibles ainsi 14-18.
Nous avons utilisé avec succès JFH-1 et le VHC souche intragenotype 2a virus chimère pour obtenir la haute résolution profilage fonctionnelle carte de domaines protéiques et éléments agissant en cis d'ARN 19,20. Selon cette étude, nous décrivons ici un système de culture efficace couramment utilisé qui permetl'étude de différentes étapes du cycle de replication du VHC et de l'interaction hôte-pathogène. Nous présentons des tests virologiques pour évaluer la réplication du génome viral et de l'infectiosité de novo intragenotype 2a du VHC et un VHC de journaliste en Renilla.
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Protocol
Un schéma général du protocole est illustré sur la figure 1.
Une. Cells
- Préparer un milieu de croissance complet qui contient 10 à 15% de sérum bovin fœtal (FBS), 10 mM acides aminés non essentiels, Hepes 10 mM, de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 mg / ml), et 2 mM de L-glutamine.
- Maintenir les cellules Huh-7.5.1 13 dans du milieu complet de croissance contenant les suppléments ci-dessus pour l'analyse in vitro de l'hépatite C du cycle de réplication virale.
- Culture souches virales en Huh-7.5.1 cellules avec le milieu de croissance complété spécifiée à 37 ° C avec 5% de CO 2.
2. Virus et constructions plasmidiques
- Générer l'ADN complémentaire (ADNc) de l'ARN du VHC forme et le cloner dans un vecteur plasmidique pour la facilité de la manipulation génétique. Remarque: La découverte de l'hépatite fulminante japonais 1, JFH-1 (génotype 2a du VHC), isolat a été critique pour la recherche sur le VHC et estprincipalement utilisé pour étudier le cycle de 11 à 13 de la replication du VHC. Virus chimériques inter et intragénotypiques sur la base de JFH-1 du VHC sont couramment utilisés dans la recherche de 14 à 18. Construction de synthèse intragenotype 2a virus chimérique, FNX-VHC, et une souche rapporteur chimérique monocistronique a été décrit précédemment 19 et détails de construction sont au-delà du champ d'application de ce protocole.
- Utilisez le virus pFNX-VHC intragenotype 2a, car il contient un 5'NTR, les régions et p7 structurelles, et une partie des régions non structurales NS2 (nucléotides 1 à 2878) de la souche parentale J6CF (NCBI accession no. AF177036), comme ainsi que les éléments non structuraux du JFH-1 souche virale (NCBI de no. AB047639). Remarque: FNX-HCV a été synthétisé sur la base de la séquence de HCV 2a Jc1 intragenotype chimérique signalé précédemment 15.
- Générer un reporter chimérique construction virale monocistronique, la pFNX-Rluc, sur la base de la souche HCV-pFNX (ci-dessus à l'étape 2.2) par insertion d'un Rgène de la luciférase enilla entre l'extrémité 5 'NTR et le gène de la partie centrale (entre les nt 388 et 389). Ensuite, branchez le gène de la luciférase et le gène de base de cette construction en utilisant un virus de la maladie 2A de la fièvre aphteuse (F2A) de la séquence peptidique, qui fonctionnerait comme un signal de clivage.
- Ingénieur de l'ARN polymérase nul (Pol-) construction virale en utilisant soit le pFNX-VHC ou le pFNX-Rluc fond virale. Remplacer les polymérase NS5B résidus catalytiques, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), de l'un de ces squelettes virales avec des résidus d'acides aminés AAG.
3. L'ARN du VHC in vitro de transcription
- Utiliser un virus chimérique intragenotype 2a FNX-VHC et FNX-VHC Pol null (Pol-) pour le VHC évaluation de la replication virale (Figure 2A).
- Linéariser les plasmides viraux avec l'enzyme de restriction XbaI, puis traiter avec la nucléase de haricot mungo à générer des extrémités franches. Purifier les plasmides digérés par chromatographie échangeuse d'anions. Vérifier l'intégrité of le plasmide linéarisé en soumettant l'ADN à une électrophorèse sur gel d'agarose (figure 2B).
- Transcrire les plasmides viraux linéarisées en utilisant la polymérase ARN-T7.
- Purifier l'ARN traité à la DNase nouvellement synthétisé en utilisant un kit de purification d'ARN.
- Vérifiez la production d'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 2C).
- Quantifier l'ARN par spectrophotométrie.
- Stocker l'ARN généré en -80 ° C à 10 pg aliquotes de travail. Remarque: Pour réduire au minimum la variation de la qualité de l'ARN à l'intérieur de chaque plan d'expérience en transcrivant tout l'ARN de chaque échantillon et témoin viral dans le même temps.
4. L'ARN du VHC transfection et prélèvement d'échantillons
- Récolter les cellules Huh-7.5.1 en utilisant la trypsine.
- Pour rincer les cellules, centrifugeuse et remettre la suspension à deux reprises avec les médias froid sérique bas. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de sérum faible à 1 x 10 7 cellules par ml.
- Mélanger un total de 10 & #956; g d'ARN viral transcrit avec 400 ul de cellules remises en suspension (4 x 10 6 cellules) dans une cuvette d'électroporation de 0,4 cm de large. Transfecter les cellules par électroporation à 270 V, 100 Ω, et 950 pF.
- Remettre en suspension les cellules par électroporation dans 10 ml de milieux de culture avec 15% de FBS. Remarque: Augmentation de la capacité de survie des cellules par électroporation est observée lorsque les cellules Huh-7.5.1 ont été cultivées dans 15% de sérum bovin fœtal.
- Plaquer les cellules dans les deux flacons T-25 (1,2 x 10 ~ 6 cellules par flacon) et des plaques de 48 puits (1 x 10 4 cellules par puits) pour chacun des points de temps suivants: 4, 48 et 96 h.
- Remplacez le support à 4-8 heures après la transfection avec les médias frais de croissance supplémenté avec 10% de FBS pour enlever les débris de cellules mortes des flacons et des plaques de culture.
- Les surnageants de culture de cellules de récolte à la 48, 96 points de temps d'heure et éliminer les débris cellulaires à partir d'échantillons recueillis par centrifugation des cellules à 1500 rpm pendant 10 min à 4 º C.
- Conserver les surnageants acellulaires à -80 º C. Lyser les cellules pour la protéine et l'analyse d'ARN par transfert de Western et inverse-PCR quantitative transcription au niveau des points de temps indiqués.
5. Transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) pour l'évaluation des copies VHC génomique
- Effectuer un deux-étape de RT-qPCR pour déterminer la génomique nombre de copies d'ARN du VHC.
- Transcrire inverse 1 pg d'ARN cellulaire total en utilisant la transcriptase inverse et une amorce spécifique du VHC brin sens qui se lie à 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') ou une amorce spécifique de gène de ménage peptidylprolyl isomérase G (R ppig : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Inverser aussi transcrire FNX-ARN du VHC (généré à l'étape 3) de copies du génome connus (10 janvier-10 septembre étalon) de VHC brin sens primaire.
- Effectuer qPCR en utilisant 50 ng de l'ADNc transcrit résultant en utilisant des amorces spécifiques du VHC (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') et liaison à l'ADN colorant vert contenant qPCR superbe mélange. Effectuer qPCR pour le ménage gène ppig ainsi (amorces ppig F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Remarque: Pour le calcul du niveau de l'ARN du VHC intracellulaire précise à travers des échantillons, utiliser gène de ménage cellulaire, ppig , le niveau d'expression (le cycle Ct) pour la normalisation. Utilisez le nombre de copies du génome FNX-VHC comme la norme pour la détermination du nombre de copies.
- Utiliser les conditions suivantes lors de l'exécution qPCR pour déterminer le nombre de copies d'ARN du VHC: 95 º C pendant 15 secondes et 60 º C pendant 30 secondes (40 cycles) en utilisant le système de PCR en temps réel.
- Voir les figures 3A et 3B pour des résultats de réplication du génome.
6. Western Blot L'analyse pour la détection du VHC Protein Expression (figure 3C)
- Utilisez lysats cellulaires frARN viral om transfectées à 96 heures après transfection de protéines analyse western blot.
- Résoudre le lysat cellulaire en utilisant une SDS-PAGE et transfert de polyfluorure de vinylidène (PVDF).
- Bloquer la membrane en utilisant une solution de blocage contenant 5% de lait écrémé, 0,2% de Tween 20 dans du tampon phosphate salin (PBS).
- Incuber la membrane avec l'anticorps monoclonal de souris primaire NS3 (une dilution à 1 000) et de la bêta-actine (une dilution à 5000).
- Ajouter IgG de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (1 en 5000 dilution) et de détecter par chimiluminescence.
7. Immunofluorescence (IFA)
- Fixer les cellules infectées par le VHC et transfectées avec du méthanol pendant 30 min à -20 ° C pour immunofluorescence.
- Laver la cellule avec du PBS à trois reprises et bloquer avec IFA tampon de blocage.
- Utilisez polyclonaux de lapin anti-NS5A principalement anticorps (aimablement fourni par le Dr Dasgupta, UCLA) ou monoclonal de souris anti-DSRNA J2 anticorps à une dilution de 1:200 (1 pg / ml) et incuber pendant 5 heures à une nuit à 4 º C.
- Laver les cellules avec du PBS à trois reprises après l'anticorps primaire.
- Ajouter de chèvre anti-IgG de lapin-488 ou l'anticorps de chèvre anti-IgG de souris-594 anticorps polyclonal secondaire à une dilution de 1:1000 (1 pg / ml) polyclonal secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les cellules avec du PBS trois fois et les noyaux des taches à l'aide de colorant Hoechst et vue en utilisant un microscope fluorescent (figure 3D).
8. Mesure Virus Titer
- Plate naïfs cellules Huh-7.5.1 à environ 3 x 10 3 cellules / puits en utilisant une plaque de 96 puits. Le lendemain, effectuer des dilutions en série de 10 fois de surnageant de culture sans cellules récoltées à partir de cellules transfectées avec de l'ARN du VHC en utilisant des milieux de croissance et inoculer en triple sur les cellules Huh-7.5.1.
- Fixer les cellules à 72 heures après l'infection en utilisant du méthanol (pendant 30 min à -20
- Utilisez la plus forte dilution de compter pour les foyers positif NS5A et calculer le nombre moyen de se concentrer unité de formation (FFU) par millilitre. Voir Figure 4 pour le VHC titre.
9. Renilla Reporter Essai de génome viral de réplication et de l'infectiosité
- Pour l'évaluation de la réplication du génome viral, l'ARN du VHC-plaque électroporation des cellules Huh-7.5.1, en triple exemplaire dans des plaques de 48 puits (1 x 10 4 cellules / puits).
- Lyse des cellules avec 75 ul de tampon de lyse passive au 6 h, 48 h et 96 h post-transfection.
- Basculez les plaques doucement pendant 15 min à température ambiante et conserver à -80 ° C.
- Pour mesurer l'activité enzymatique de la luciférase de Renilla, décongeler le lysat de protéine luciférase de Renilla et les réactifs de dosage à la température ambiante.
- Ajouter 20 ul de lysat de protéine par puits d'une 96-wel l plaque de luminescence blanche et placer la plaque dans un luminomètre.
- Distribuer 100 ul de Renilla réactif de dosage (coelentérazine substrat + tampon) par puits et après un délai pré-lire 2 sec; intégrer la lumière émise pendant 10 secondes.
- Calculer la moyenne et l'écart type pour chaque échantillon à partir des valeurs de luciférase de triplicats biologiques et soumettre les données à l'analyse statistique (figure 5).
- Pour évaluer l'infectiosité, inoculer 500 pi de surnageant acellulaire obtenus à partir de cellules transfectées ARN VHC pour les points de temps indiqués (48 h et 96 h), en trois exemplaires sur naïfs cellules Huh-7.5.1 dans des plaques à 48 puits.
- Remplacer l'inoculum viral avec 500 pi de milieu frais par puits après 6 heures après l'infection.
- Lyse des cellules à 48 heures après l'infection et sous réserve de Renilla dosage de la luciférase comme décrit dans les étapes 08.02 à 08.07 (figure 5).
- Les barres d'erreur dans les graphiques indiquent les écarts-types (SD). Les valeurs de p ont été calculées par le test t non apparié.
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Representative Results
Virus de l'hépatite C est un virus à ARN. Ainsi, à des fins de manipulation génétique, l'ADNc génomique du VHC a été cloné dans un vecteur plasmidique bactérien. Une séquence de promoteur de l'ARN polymerase T7 a été introduit juste avant l'extrémité 5 'du génome de HCV. Un schéma général de l'analyse du HCV flux de travail est présentée en figure 1. Pour générer l'ARN génomique du VHC avec précision l'extrémité 3 ', le génome du VHC contenant le plasmide est coupé avec Xba I enzyme de restriction et le surplomb simple brin généré a été émoussée par la nucléase de haricot mungo digestion . La qualité du plasmide linéarisé par le VHC a été évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 2B). L'ADN du VHC a été soumis à la T7 RNA polymérase médiation dans la transcription in vitro et l'ARN résultant a donné un seul produit à 9,6 kilobases (figure 2C).
Nous avons testé la cinétique d'une intragenotype VHC 2a (figure de croissance60, 3). Les cellules Huh-7.5.1 électroporation avec l'ARN transcrit in vitro de type sauvage (WT) et les virus null polymérase. Nous avons évalué la réplication du génome viral de sens par RT-qPCR. Les résultats ont indiqué que le virus WT répliqué efficacement le génome (figures 3A et 3B). Le type sauvage présentait niveau de une à trois log plus élevé de la réplication du génome par rapport à celle de la Pol-virus. Le virus WT produit la protéine NS3 (figure 3C) qui est impliquée dans le clivage de la protéine virale (activité de la protéase), et la réplication du génome (de l'activité d'hélicase). De plus, le virus WT exprimé protéine NS5A évaluée par immunofluorescence (figure 3D). protéine NS5A est une partie du complexe de réplicase d'ARN du VHC. Pour visualiser la réplication du génome viral, nous avons examiné la présence de l'ARN double brin (ds) du VHC en utilisant un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'ARN double brin. Pendant VHC amplification du génome, l'ARN du brin sens est copied au génome anti-sens, ainsi les intermédiaires de l'ARN à double brin sont présents dans le cytoplasme de la cellule infectée. La protéine NS5A et ARNdb co-localise dans le cytoplasme cellulaire (Figure 3D) de cellules transfectées WT suggérant la replication virale active. Dans l'ensemble, le virus WT établi réplication active dans transfectées Huh-7.5.1 cellules.
Progrès dans la recherche sur le VHC a été limitée en raison de l'absence d'un système infectieuse de culture cellulaire. La découverte de JFH-1 souche de VHC et la caractérisation ultérieure des souches de laboratoire chimériques nous a permis d'étudier les cycles de réplication du VHC entière dans la culture de cellules, y compris l'entrée virale, la traduction de l'ARN, la réplication de l'ARN et la formation de la descendance virale infectieuse. Pour évaluer le titre d'infectivité VHC et de novo, on a inoculé les surnageants de cultures cellulaires récoltés à partir de cellules transfectées avec de l'ARN du VHC. L'infection par le VHC a été visualisée par la détection de la protéine NS5A du VHC et calculéle titre viral par comptage des foyers infectieux (figure 4). Nous avons considéré grappe isolée de cellules (plus de 2 cellules) positif pour NS5A comme un seul foyer. Les résultats indiquent que le virus WT est contagieux et produit plus de 10 foyers formant 4 unités / ml de particules infectieuses.
Nous avons également créé un virus rapporteur du VHC hébergement Renilla (Rluc) gène rapporteur (figure 5A). Un VHC rapporteur peut être utilisé pour tester grand nombre de virus mutants ainsi que pour la haute teneur des essais de criblage. Ici, nous présentons l'évaluation des phénotypes de WT et virus Pol-rapporteurs croissance. Si le génome viral se réplique, l'activité de la luciférase augmenterait heures supplémentaires après la transfection. Les niveaux de replication du génome accrus peuvent être déduites à partir de l'activité accrue de la luciférase. Par conséquent, l'activité de la luciférase fournit indirectement la mesure du niveau de la réplication du génome. Les lysats récoltés de WT ou Pol-viral ARN des cellules transfectées à des points de temps indiqués ont été testées pour les activités de luciférase. A six heures après la transfection, à la fois WT et Pol-virus avaient des activités de luciférase similaires, ce qui indique le niveau d'entrée de l'ARN transfecté similaire qui avait été traduite (Figure 5B). Cependant, à 48 h et 96 h post-transfection, le virus WT montré des niveaux de réplication du génome a augmenté par rapport à celui de Pol-virus. En outre, le virus WT produit la protéine NS3 du virus tel que vérifié par analyse Western blot (figure 5C). Par la suite, nous avons testé l'infectivité des virus WT et Pol-rapporteurs en inoculant des cellules naïves Huh-7.5.1 avec les surnageants sans cellules recueillies à partir de 48 h et 96 cultures de cellules post-transfectées h. Le Pol-virus ont une activité de la luciférase niveau de base, alors que le virus avait WT niveau 2-3 journal plus élevé de réplication de celle du virus Pol-reporter (figure 5D). Résultats démontrent que nous avons un solide VHC infectieux cultu cellulaire re système.
Figure 1. Contour général de la replication du VHC analyse flux VHC construction de plasmide contenant le promoteur T7 ARN polymerase (T7P) soumis à une transcription in vitro. Linéarisé. Le génome du VHC ARN purifié est introduit par électroporation dans des cellules Huh-7.5.1 et plaqué dans des flacons et plaque de 48 puits. À 4 h, 48 h et 96 h post-transfection, l'ARN cellulaire et surnageants de culture sont prélevés des flacons. Les cellules de la plaque de 48 puits sont utilisés pour la récolte lysat de protéine et sont fixés pour immunofluorescence. l'analyse du nombre de copies de génome par RT-PCR quantitative, Western blot titre viral et de mesure sont effectuées pour évaluer la replication du VHC.
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Figure 2. Production d'ARN génomiques du VHC par transcription in vitro de l'ADN de plasmides construits. A) Organisation génomique des J6CF/JFH-1 intragenotype 2a virus chimériques, FNX-VHC et FNX-VHC Pol nulle. La région de souche J6CF (5'NTR à une partie de NS2) est représentée en gris foncé et la région de souche JFH-1 (partie de NS2 à 3'NTR) est affichée en gris clair. Polymérase NS5B domaine catalytique mutation (GDD à l'AAG) est indiqué par un astérisque. B) Les étapes de génération linéarisé VHC plasmide. image de gel montre les linéarisées, émoussé ADN plasmidiques indéterminée produites par Xbal et mungo digestion à la nucléase de haricots, prêt pour la transcription in vitro. Gel d'agarose à 0,8% a été utilisée pour la résolution de l'ADN. C) Gel d'image représente les ARN génomiques du VHC produites par transcription in vitro en utilisant le système d'ARN polymerase T7. WT: de type sauvage; Pol-: null polymérase; M:marqueur.
Figure 3. Évaluer les phénotypes de constructions VHC de croissance. A) L'évaluation de la cinétique de réplication du génome de type sauvage (WT) et la polymérase nulle virus (Pol-). Les nombres de copies de génome d'ARN brin sens évaluée par RT-PCR quantitative sont présentés dans le graphique à barres. Les virales copies du génome de Pol-virus diminué au cours de la période de temps indiquant la réplication phénotype déficient. B) Relative niveau de la réplication du génome de type sauvage du VHC est comparée à celle de la Pol-virus. C) Western d'analyse de blot de l'expression des protéines du VHC. protéine NS3 du HCV est détecté et la bêta-actine est utilisé comme contrôle cellulaire. D) de dosage par immunofluorescence pour étudier la replication virale. À 96 h après l'électroporation, les cellules sont fixées et soumises à une immunostaining pour la protéine NS5A du VHC et l'ARN double brin (ds RNA), un marqueur pour l'ARN du VHC intermédiaires de replication. Les noyaux ont été visualisés avec Hoechst tache (barre d'échelle 50 pm). hpt:. heures post-transfection S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Examen de l'infectiosité du VHC de type sauvage et de mesurer titre du virus. A) Des cellules Huh-Naïve 7.5.1 ont été utilisées pour des études d'infection. Le surnageant exempt de cellules recueillies en 48 et 96 h post-transfection (HPT) de l'ARN du VHC ont été soumis à 10 fois la dilution en série et ajoutés aux cellules dans une plaque à 96 puits en triple. 72 heures après l'infection, les cellules ont été fixées et immunocoloré pour la protéine NS5A du VHC. Les cellules avec NS5A coloration positive (rouge) sont infectées par le virus. Pour évaluer foyers unité de formation (FFU), les foyers positif à la dilution la plus élevée a été prise en compte. Panels représentatifs d'images sont affichés (barre d'échelle 100 um). B) Les valeurs moyennes et les écarts types de titre viral par millilitre dans FFU sont présentés dans le graphique. La polymerase mutant nul n'a pas de produire des particules infectieuses. WT: de type sauvage; Pol-:. Null Polymerase S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. L'évaluation de la réplication du génome et l'infectiosité de reporter le VHC. A) Une bande dessinée de virus rapporteur chimérique intragenotype 2a est présenté. Le gène de la luciférase de Renilla est inséré Inframe entre 5'NTR et le noyau. B) La cinétique de réplication du génome de type sauvage et les virus rapporteurs Pol-mutants à l'heure indiquée souligne post-transfection est représentée dans le graphique. lysats de protéines ont été récoltées à 6 h, 48 h et 96 points de temps h pour mesurer Renilla activité enzymatique de la luciférase. La moyenne et l'écart-type calculé à partir des valeurs en triple de la luciférase de Renilla (RLV) pour chaque virus sont présentés dans le graphique. C) panneau Western blot montre la protéine NS3 du HCV expression. Un antigène non spécifique détecté par l'anticorps primaire NS3 agit en tant que témoin de chargement. De type sauvage (WT) virus rapporteur produit un niveau élevé de protéine NS3. D) Analyse de l'infectiosité du virus. Naïve Huh-7.5.1 cellules ont été inoculés avec le surnageant acellulaire obtenu à partir de la culture transfectées à 48 h et de 96 points de temps de h. Renilla activités de la luciférase de cellules infectées ont été mesurées à 48 heures après l'infection.Les valeurs moyennes avec écart-type sont présentés dans le graphique. Le virus Pol-reporter cellules infectées n'avaient que le niveau d'activité de la luciférase de fond, alors que le virus WT rapporteur expose de haut niveau de l'infectiosité.
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Discussion
Cette illustration décrit un procédé d'analyse du cycle de réplication du virus de l'hépatite C. VHC est un agent pathogène humain et le protocole sur la biosécurité prescrit devra être strictement suivies. Les systèmes de culture de cellules de VHC infectieuses ont été décrites précédemment 11-13,16,17. Il ya quelques points essentiels nous mettons en œuvre en suivant le protocole illustré. Premièrement, il est d'une grande importance d'avoir une bonne qualité de l'ARN intact pleine longueur génomique viral pour les études en aval. Le plasmide d'entrée portant l'ADNc viral doit être linéarisé et émoussé avec soin. La nucléase de haricots mungo utilisé pour atténuer le surplomb Xba I est une nucléase non spécifique et l'incubation prolongée risque d'endommager ou de la dégradation de l'extrémité 3 'du génome viral. La nucléase doit être enlevé immédiatement après le 30 minutes d'incubation spécifiée par extraction au phénol-chloroforme ou la purification sur colonne d'échange d'anions. extraction de gel de la nucléase ADN traité ne peut pas être recommandée commeenzyme est active pendant le processus d'électrophorèse sur gel.
Pour la suite des étapes de transcription d'ARN in vitro, généralement, on aura aussi prendre des précautions à large spectre pour minimiser ribonucléase (RNase) contamination. Tous les réactifs et les matériaux utilisés doivent être RNase. Pour générer l'ARN génomique de haute qualité avec des pauses ARN minimum brin, l'ARN doivent être soumis à un stress physique moins en évitant vortex dure et pipetage répété pendant étapes de purification et de traitement en aval. Après l'achèvement de la transcription d'ARN, les matrices d'ADN de plasmide entrée doivent être retirés de mélange transcrit d'ARN par la DNase (RNase) de traitement. Une élimination incomplète peut se traduire par le report de l'ADN plasmidique dans des cellules transfectées et affecter la quantification du génome absolue du nombre de copies d'ARN viral répliqué. Par conséquent, en utilisant la DNase enzyme à une concentration de 1 unité par microgramme d'ADN et ayant également supplémentaire de 15 min d'incubation à 37 DNase º C peutaider. L'ARN transcrit est purifié par une extraction au phénol-chloroforme ou d'une colonne d'échange d'anions. Des précautions doivent être prises pour éviter les reports de phénol ou d'autres réactifs à l'échantillon d'ARN purifié, qui peut être cytotoxique et interférer avec les méthodes moléculaires.
Aux fins de l'électroporation, l'ARN purifié doit être dissous dans de l'eau stérile exempte de RNases. Si le culot d'ARN est difficile à dissoudre, en chauffant l'échantillon à 65 ° C pendant 5 min aidera. Une fois que la transcription est terminée, il est important de stocker immédiatement l'ARN dans des fractions aliquotes de 10 ug de travail effectuées dans l'eau sans RNase à -80 º C. Le but des parties aliquotes est d'empêcher répétés de congélation / décongélation à médiation par la dégradation de l'ARN. Pour des résultats expérimentaux cohérentes, il est recommandé de transcrire tous les échantillons et les contrôles en même temps. L'ARN de haute qualité est recommandé pour un rendement plus élevé de titre viral. Pour les agents de transfection transfection d'ARN génomique du VHC, polymère et à base de lipides peuvent aussi be utilisé 21,22.
Facteurs viraux et de l'hôte influent grandement sur la cinétique de souches de VHC de croissance. Lignée cellulaire d'hépatome humain (Huh-7) dérivés Huh-7.5, Huh-7.5.1 et lignées cellulaires Huh7-LUNET sont couramment utilisés pour évaluer 11-13,15 de croissance virale. La production virale pic de JFH-1 dans les cellules souche Huh7-LUNET est à 3-4 jours post-transfection, alors que dans Huh-7.5.1 cellules, il est à 21 jours post-transfection 13,15. Le virus chimérique intragenotype 2a FNX-VHC ayant des gènes non structuraux de JFH-1 souche a titre pic à 4 jours post-transfection dans des cellules Huh-7.5.1 19,20. Pour la production virale à partir de l'ARN transcrit in vitro, à la ligne de passage précoce cellulaire d'hépatome humain est préféré. Production virale est considérablement réduite en utilisant Huh-7.5.1 cellules sur le nombre de passages 20. Afin d'assurer une augmentation de survie des cellules après l'électroporation, décongelé Huh-7.5.1 cellules disposent d'un délai de deux de récupération de semaine avant de procéder à une expérience et maintained dans 12% à 15% de FBS. Avec ce critère, la remise en suspension des cellules dans un milieu de croissance contenant 15% de FBS, immédiatement après l'électroporation augmente la survie des cellules permettant une meilleure production virale. Après le 8 premier point de temps h, les cellules sont ensuite passés à des milieux contenant 10% de FBS. Pour réduire au minimum le report des débris cellulaires, du surnageant de culture virale est soumise à une centrifugation et filtration à travers le filtre 4 microns. Les surnageants viraux concentrées ou non sont aliquotés et conservés en -80 º C pour de plus amples in vitro et in vivo. Ces précautions et suggestions peuvent aider les chercheurs pour réaliser avec succès l'analyse de cycle de réplication du VHC.
Une autre variante de reporter le VHC qui héberge un gène marqueur tel que la protéine fluorescente et une forme sécrétée de la luciférase de Gaussia (Gluc) sont décrites pour la recherche sur le VHC 18,23,24. Pour les chercheurs en mettant l'accent sur l'étude VHCla réplication du génome, sous-génomique réplicon du VHC (manque le noyau de gènes NS2) est un outil précieux de 9,10. Réplicons du VHC ne sont pas infectieux, nécessite donc moins de réglementations de biosécurité et plus facile à travailler par rapport au VHC infectieuses de culture cellulaire et des isolats cliniques. VHC déficiente en activité de la polymérase NS5B est un contrôle critique pour l'étude de la réplication du VHC 11,12 cycle. VHC manque glycoprotéines d'enveloppe (delta E1E2), ou une activité de p7-NS2 peut être contrôles utiles pour les études impliquant entrée du VHC, morphogenèse du virion et la sortie 12,19,25-27.
En ce qui concerne les limitations, le système a infectieuse de culture cellulaire est disponible seulement pour les génotypes du VHC 1 et 2. Souches virales authentiques appartiennent à des génotypes 3 à 6, qui sont capables de se développer efficacement dans une culture de cellules pas encore été identifiés. Virus recombinants intergénotypiques sont des alternatives utiles pour l'étude du cycle de réplication de différents génotypes. Compétent pour la réplication de virus chimère harboring noyau de région NS2 de génotypes 1 à 7 et reste de la séquence de JFH-1 génotype 2a génome ont été décrits 15,18. Une autre limitation est que le rendement viral de JFH-1 et ses souches chimériques dérivés est dans la plage de 10 3 à 10 6 par ml, ce qui est relativement faible par rapport à celle d'autres virus à ARN tels que la poliomyélite et la grippe. souche de VHC avec une croissance robuste a besoin d'être développé. Future enquête comprend l'utilisation du VHC rapporteur pour le dépistage de la bibliothèque à haut débit pour identifier des antiviraux puissants et de se concentrer sur le développement de candidats vaccins pour prévenir l'infection par le VHC.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
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