Abstract
Virus dell'epatite C (HCV) colpisce il 3% della popolazione mondiale e provoca gravi disturbi epatici, tra cui epatite cronica, cirrosi e carcinoma epatocellulare. HCV è un virus a RNA enveloped appartenente alla famiglia Flaviviridae. Terapia attuale non è pienamente efficace e provoca effetti collaterali negativi. Non esiste un vaccino HCV disponibili. Pertanto, è necessaria continuato sforzo per sviluppare un vaccino e migliore terapia. Un sistema di coltura cellulare HCV è fondamentale per studiare varie fasi di crescita HCV tra cui l'ingresso del virus, la replicazione del genoma, imballaggio e uscita. Nella procedura attuale presentata, abbiamo utilizzato un virus wild-type intragenotype 2a chimerico, FNX-HCV, e un virus ricombinante FNX-Rluc portando un Renilla luciferasi gene reporter per studiare la replicazione del virus. Una linea di cellule di epatoma umano (Huh-7 riferiscono) è stato utilizzato per la trasfezione in vitro di trascritti HCV RNA genomici. Surnatanti di coltura privi di cellule, lisati proteici e tRNA otale sono state raccolte in vari momenti punti post-trasfezione per valutare la crescita HCV. HCV stato replicazione del genoma è stata valutata mediante RT-PCR e visualizzando la presenza di HCV RNA a doppio filamento. L'espressione della proteina di HCV è stata verificata da blot e immunofluorescenza saggi occidentali utilizzando anticorpi specifici per le proteine HCV NS3 e NS5A. Cellule trasfettate HCV RNA rilasciate particelle infettive nella cultura surnatante e il titolo virale è stato misurato. Saggi di luciferasi sono stati utilizzati per valutare il livello di replicazione e infettività di HCV giornalista. In conclusione, vi presentiamo vari saggi virologici per la caratterizzazione delle diverse fasi del ciclo di replicazione di HCV.
Introduction
Virus dell'epatite C (HCV) causa cirrosi e cancro del fegato. Essa colpisce 170 milioni di persone in tutto il mondo con 350.000 persone muoiono ogni anno 1-3. HCV è un virus a RNA filamento positivo con un genoma di 9,6 kb. Il genoma di HCV è tradotto come singola poliproteina di ~ 3000 residui amminoacidici che viene scissione proteolitica da varie proteasi cellulari e virali in 10 polipeptidi. HCV è il virus prototipo in genere Hepacivirus e appartiene alla famiglia Flaviviridae 4. Dopo l'esposizione, HCV stabilisce infezione cronica nel 80% degli individui. L'infezione è prevalentemente asintomatica e tempestiva diagnosi può consentire l'intervento terapeutico per prevenire il deterioramento del fegato. Il trattamento attuale è ottimale e nessun vaccino è disponibile 5,6.
L'eziologia di epatite C è stata descritta per la prima nel 1989 7. Studiare la replica di HCV è importante per il vaccino contro l'epatite C e la ricerca del trattamento, ma era statolungo ostacolata dalla mancanza di un efficiente sistema di coltura virale. Un clone molecolare di HCV ha dimostrato di essere contagiosa negli scimpanzé su inoculazione intraepatica 8. Successivamente, sono stati descritti repliconi HCV sub-genomici, che ha permesso di sezionare la fase di replicazione del genoma virale in un sistema di coltura cellulare 9,10. Scoperta di un HCV genotipo 2a isolare JFH-1 (Giapponese epatite fulminante-1), in grado di infettare colture cellulari ha aperto nuove strade per la ricerca replicazione di HCV 11-13. Ceppo genotipo 2a JFH-1 sistemi di coltura infettive basati basati virus chimerici inter-e intra-genotipiche e genotipo 1 HCV sono disponibili pure 14-18.
Abbiamo utilizzato con successo JFH-1 ceppo e HCV intragenotype 2a virus chimerico avere la ad alta risoluzione profili funzionali mappa di domini di proteine e cis-acting elementi RNA 19,20. In base a questo, qui si descrive un sistema efficace cultura utilizzato di routine che permettestudiando varie fasi del ciclo di replicazione di HCV e l'interazione ospite-patogeno. Vi presentiamo saggi virologici per valutare la replicazione del genoma virale e infettività de novo di intragenotype 2a HCV e un giornalista HCV basata Renilla luciferasi.
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Protocol
Uno schema generale del protocollo è illustrato in Figura 1.
1. Cellule
- Preparare mezzi di crescita completo che contiene il 10-15% di siero bovino fetale (FBS), 10 mM aminoacidi non essenziali, Hepes 10 mM, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml), e 2 mM L-glutammina.
- Mantenere Huh-7.5.1 celle 13 in mezzi di crescita completi contenenti i supplementi di cui sopra per l'analisi in vitro di epatite C ciclo di replicazione virale.
- Cultura ceppi virali in Huh-7.5.1 celle con i mezzi di crescita integrata specificato a 37 ° C con 5% di CO 2.
2. Virus e plasmidi costrutti
- Generare la forma complementare DNA (cDNA) di HCV RNA e clonare in un vettore plasmidico per facilità di manipolazione genetica. Nota: La scoperta del giapponese epatite fulminante 1, JFH-1 (genotipo HCV 2 bis), isolare è stato fondamentale per la ricerca HCV ed èutilizzato principalmente per studiare il ciclo 11-13 replicazione di HCV. Virus chimerici-Inter e intragenotypic basato su JFH-1 HCV sono comunemente utilizzati nella ricerca 14-18. Costruzione di intragenotype sintetico 2a virus chimerico, FNX-HCV, e un monocistronic ceppo giornalista chimerico è stato descritto in precedenza i 19 ei dettagli costruttivi sono oltre la portata di questo protocollo.
- Utilizzare il pFNX-HCV virus intragenotype 2a in quanto contiene un 5'NTR, regioni strutturali e p7, e parte delle regioni non strutturali NS2 (nucleotidi 1-2878) del ceppo parentale J6CF (NCBI adesione n. AF177036), come nonché i componenti non strutturali del JFH-1 ceppo virale (NCBI adesione n. AB047639). Nota: FNX-HCV è stato sintetizzato basandosi sulla sequenza di Jc1 intragenotype 2a HCV chimerico riferito in precedenza 15.
- Generare un costrutto chimerico monocistronic giornalista virale, la pFNX-Rluc, basato sul ceppo pFNX-HCV (sopra al punto 2.2) inserendo un Renilla gene luciferasi tra il 5 'NTR e gene nucleo (nt tra 388 e 389). Successivamente, collegare il gene della luciferasi e nucleo gene di questo costrutto utilizzando un 2A virus dell'afta epizootica (F2A) sequenza peptidica, che funzioni come un segnale di scissione.
- Ingegnere il costrutto virale RNA polimerasi-null (Pol-) utilizzando il pFNX-HCV o lo sfondo virale pFNX-Rluc. Sostituire i residui catalitici NS5B polimerasi, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), di una di queste dorsali virali con residui di acido AAG amino.
3. In Vitro HCV RNA Trascrizione
- Utilizzare un intragenotype 2a virus chimerico FNX-HCV e FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV per la valutazione della replicazione virale (Figura 2A).
- Linearizzare i plasmidi virali con XbaI enzima di restrizione e poi trattare con mung bean nucleasi per generare estremità smussata. Purificare i plasmidi digeriti mediante cromatografia a scambio anionico. Verificare l'integrità of plasmide linearizzato sottoponendo DNA per elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2B).
- Trascrivere i plasmidi virali linearizzate utilizzando la polimerasi T7-RNA.
- Purificare il RNA DNasi trattati nuova sintesi utilizzando un kit di purificazione dell'RNA.
- Verificare la produzione di RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2C).
- Quantificare l'RNA per spettrofotometria.
- Conservare il RNA generati in -80 ° C in aliquote di 10 mcg lavorativi. Nota: Per ridurre al minimo la variazione di qualità RNA in ciascun disegno sperimentale trascrivendo tutto RNA per ogni campione e controllo virale allo stesso tempo.
4. HCV RNA Transfezione e raccolta dei campioni
- Raccogliere le cellule Huh-7.5.1 utilizzando tripsina.
- Per lavare le celle, centrifugare e risospendere la sospensione per due volte con il freddo i media siero basso. Risospendere le cellule in mezzi siero partire a 1 x 10 7 cellule per ml.
- Mescolare un totale di 10 & #956; g di RNA virale trascritto con 400 microlitri di cellule risospese (4 x 10 6 cellule) in 0,4-cm elettroporazione cuvetta. Transfettare le cellule tramite elettroporazione a 270 V, 100 Ω e 950 uF.
- Risospendere le cellule elettroporate in 10 ml di media crescita completa con il 15% FBS. Nota: Aumento di sopravvivenza delle cellule elettroporate si vede quando le cellule Huh-7.5.1 sono state coltivate in 15% di siero fetale bovino.
- Piastra le cellule in entrambe T-25 palloni (~ 1,2 x 10 6 cellule per pallone) e piastre a 48 pozzetti (1 x 10 4 cellule per pozzetto) per ciascuno dei seguenti punti temporali: 4, 48 e 96 ore.
- Sostituire i media a 4-8 ore post-trasfezione con fresca mezzi di crescita supplementato con 10% FBS per rimuovere i detriti cellulari morti palloni in coltura e piatti.
- Surnatanti di coltura cellulare Harvest ai 48, 96 punti di tempo hr e rimuovere detriti cellulari da campioni raccolti mediante centrifugazione di cellule a 1.500 rpm per 10 minuti a 4 º C.
- Conservare il surnatante cell-free a -80 ° C. Lisare le cellule per l'analisi delle proteine e RNA da Western blot e trascrizione inversa-PCR quantitativa nei punti all'ora indicata.
5. Trascrizione inversa-PCR quantitativa (RT-qPCR) per la valutazione delle copie HCV Genome
- Eseguire un due fasi RT-qPCR per determinare il numero di copie di RNA genomico di HCV.
- Trascrivere Reverse 1 mg di RNA cellulare totale utilizzando la trascrittasi inversa e un primer specifico per HCV senso filo che lega 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') o un primer specifico per il gene housekeeping peptidylprolyl isomerasi G (ppig R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Anche invertire trascrivere FNX-HCV RNA (generato nel passaggio 3) di copie del genoma noti (10 gennaio - 10 settembre di serie) utilizzando senso HCV filamento primer.
- Effettuare qPCR utilizzando 50 ng del risultante cDNA trascritto utilizzando specifici primer HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') e il legame al DNA colorante verde contenente qPCR eccellente mix. Eseguire qPCR per le pulizie gene ppig così (primer ppig F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Nota: Per il calcolo esatto livello intracellulare di RNA di HCV di tutti i campioni, usare cellulari gene housekeeping, ppig , livello di espressione (ciclo Ct) per la normalizzazione. Utilizzare il numero di copie del genoma FNX-HCV come standard per la determinazione del numero di copie.
- Utilizzare le seguenti condizioni durante l'esecuzione qPCR per la determinazione del numero di copie di HCV RNA: 95 º C per 15 sec e 60 ° C per 30 sec (40 cicli) utilizzando il sistema di PCR in tempo reale.
- Vedere le Figure 3A e 3B per i risultati replicazione del genoma.
6. Western Blotting analisi per il rilevamento di HCV Protein Expression (Figura 3C)
- Utilizzare lisati cellulari frRNA virale om transfettata a 96 ore dopo la trasfezione di proteine western blotting.
- Risolvere il lisato cellulare mediante SDS-PAGE e trasferimento a polivinilidene (PVDF) membrana.
- Bloccare la membrana con una soluzione bloccante contenente latte scremato 5%, 0,2% Tween 20 in tampone fosfato salino (PBS).
- Incubare la membrana con l'anticorpo monoclonale di topo primario NS3 (1 in 1.000 diluizione) e beta-actina (1 in 5.000 diluizione).
- Aggiungi IgG di capra anti-topo coniugata con perossidasi di rafano (1 in 5.000 diluizione) e rilevare da chemiluminescenza.
7. Immunofluorescenza Assay (IFA)
- Fissare le cellule con infezione da HCV e trasfettate con metanolo per 30 minuti a -20 ° C per l'analisi di immunofluorescenza.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte e bloccare con IFA tampone di bloccaggio.
- Utilizzare policlonale di coniglio anti-NS5A principalmente anticorpo (gentilmente fornito dal Dr. Dasgupta, UCLA) o il mouse monoclonale anti-DSRNA anticorpo J2 alla diluizione 1:200 (1 mg / ml) e incubare per 5 ore a tutta la notte a 4 º C.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte dopo l'anticorpo primario.
- Aggiungere goat anti-rabbit IgG-488 policlonale anticorpo secondario o di capra anti-topo IgG-594 anticorpo secondario policlonale ad una diluizione 1:1000 (1 mg / ml) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte e nuclei macchia con Hoechst colorante e vista utilizzando microscopio a fluorescenza (Figura 3D).
8. Virus misura Titer
- Piatto ingenui Huh-7.5.1 cellule a circa 3 x 10 3 cellule / pozzetto utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Il giorno successivo, eseguire diluizioni seriali di 10 volte del cell-free cultura surnatante raccolto da RNA transfettate cellule HCV utilizzo dei supporti di crescita e di inoculare in triplice copia su Huh-7.5.1 cellule.
- Fissare le cellule a 72 ore dopo l'infezione con metanolo (per 30 minuti a -20
- Usare la massima diluizione di contare per i fuochi positivo NS5A e calcolare il numero medio di messa a fuoco unità di formazione (FFU) per millilitro. Vedere Figura 4 per HCV titolo.
9. Renilla Luciferase Reporter Assay per Viral Genome Replica e Infettività
- Per valutare la replicazione del genoma virale, piastra HCV RNA-elettroporato Huh-7.5.1 cellule in triplice copia in piastre 48 pozzetti (1 x 10 4 cellule / pozzetto).
- Lisare le cellule con 75 ml di tampone di lisi passiva al 6 ore, 48 ore e 96 ore dopo la trasfezione.
- Oscillare delicatamente le piastre per 15 minuti a temperatura ambiente e conservare a -80 ° C.
- Per misurare l'attività enzimatica Renilla luciferasi, scongelare il lisato proteico e Renilla luciferasi i reagenti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 20 ml di lisato proteico per pozzetto di una 96-wel l piatto luminescenza bianca e mettere il piatto in un luminometro.
- Dispensare 100 ml di Renilla luciferasi di reagenti del dosaggio (coelenterazina substrato + tampone) per bene e dopo un ritardo di 2 secondi di pre-lettura; integrare la luce emessa per 10 sec.
- Calcolare la media e la deviazione standard per ciascun campione dai valori di luciferasi triplicato biologici e sottoporre i dati per l'analisi statistica (Figura 5).
- Per valutare l'infettività, inoculare 500 ml di surnatante cell-free ottenuti da cellule RNA-HCV transfettate per i punti temporali indicati (48 ore e 96 ore) in triplice copia su naïve Huh-7.5.1 cellule in piastre 48 pozzetti.
- Sostituire l'inoculo virale con 500 ml di mezzo fresco per bene dopo 6 ore dopo l'infezione.
- Lisare le cellule a 48 ore dopo l'infezione e sono soggetti a Renilla saggio luciferasi come descritto nei passaggi 8,2-8,7 (Figura 5).
- Le barre di errore nei grafici indicano deviazioni standard (SD). I valori di P sono stati calcolati con il test t spaiato.
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Representative Results
Il virus dell'epatite C è un virus a RNA. Così per scopo di manipolazione genetica, l'HCV cDNA genomico è stato clonato in un plasmide vettore batterico. Una sequenza del promotore T7 RNA polimerasi è stata introdotta immediatamente prima estremità 5 'del genoma di HCV. Uno schema generale di workflow analisi HCV è presentato nella figura 1. Per generare HCV RNA genomico con precisione 3 ', il genoma di HCV contenente plasmide è tagliato con l'enzima di restrizione XbaI e lo sbalzo singolo filamento generato è stato smussato con fagiolo mungo nucleasi digestione . La qualità del plasmide linearizzato HCV è stata valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2B). Il DNA di HCV è stato sottoposto a T7 RNA polimerasi mediata trascrizione in vitro e l'RNA risultante ha prodotto un unico prodotto a 9,6 chilobasi (Figura 2C).
Abbiamo testato la cinetica di crescita di un intragenotype 2a HCV (Figura60, 3). Le cellule Huh-7.5.1 sono stati elettroporate con l'RNA trascritto in vitro di wild-type (WT) e polimerasi virus nulli. Abbiamo valutato il genoma virale senso di replica mediante RT-qPCR. I risultati indicano che il virus WT replicato il genoma efficiente (Figure 3A e 3B). Wild-type esposto 1-3 log elevato livello di replicazione del genoma rispetto a quello di Pol-virus. Il virus WT produce la proteina NS3 (Figura 3C) che è coinvolto nella scissione di proteine virali (attività di proteasi), e la replicazione del genoma (attività elicasi). Anche il virus WT espresso proteina NS5A come valutato dal saggio di immunofluorescenza (Figura 3D). Proteina NS5A è parte del complesso replicasi RNA di HCV. Per visualizzare la replicazione del genoma virale, abbiamo esaminato la presenza del doppio filamento (ds) HCV RNA utilizzando un anticorpo che riconosce specificamente dsRNA. Durante HCV amplificazione del genoma, l'RNA senso filamento è copied di anti-senso genoma, così il duplice intermedi stranded RNA sono presenti nel citoplasma della cellula infettata. La proteina NS5A e dsRNA co-localizzato nel citoplasma cellulare (Figura 3D) di cellule trasfettate WT suggerendo la replicazione virale attiva. Nel loro insieme, il virus WT stabilito la replicazione attiva nel trasfettate Huh-7.5.1 cellule.
I progressi della ricerca HCV era stato limitato a causa della mancanza di un sistema di coltura cellulare infettiva. La scoperta di JFH-1 ceppo di HCV e la successiva caratterizzazione di ceppi di laboratorio chimerici ci hanno permesso di indagare l'intero ciclo di replicazione di HCV nelle cellule in coltura tra cui l'ingresso del virus, la traduzione dell'RNA, la replicazione del RNA e la formazione della progenie virale contagiosa. Per valutare il titolo HCV e infettività de novo, abbiamo inoculato il surnatante coltura cellulare raccolti dal RNA transfettate cellule HCV. L'infezione da HCV è stata visualizzata rilevando la proteina NS5A HCV e calcolatoil titolo virale contando il foci infettivi (Figura 4). Abbiamo preso in considerazione gruppo isolato di celle (oltre 2 celle) positivo per NS5A come un unico fuoco. I risultati indicano che il virus WT è contagioso e produce oltre 10 4 fuochi formano unità / ml di particella infettiva.
Abbiamo anche stabilito un virus HCV giornalista ospitare Renilla luciferasi (Rluc) gene reporter (Figura 5A). Un HCV giornalista può essere utilizzato per testare molti virus mutanti così come per alta Opere saggi di screening. Ecco a voi la valutazione dei fenotipi di crescita del WT e virus Pol-giornalista. Se il genoma virale replica, l'attività della luciferasi aumenterebbe straordinario di post trasfezione. L'aumento dei livelli di replicazione del genoma possono essere dedotte da una maggiore attività di luciferasi. Quindi, l'attività di luciferasi fornisce indirettamente la misurazione del livello di replicazione del genoma. I lisati raccolti da WT o Pol-viRNA ral cellule trasfettate a tempi indicati sono stati testati per le attività di luciferasi. Al 6 ore dopo la trasfezione, sia WT e Pol-virus avevano attività luciferasi simili, indicando simile livello di ingresso di RNA trasfettate che era stato tradotto (Figura 5B). Tuttavia a 48 ore e 96 ore dopo la trasfezione, il virus WT presentano un aumento di livelli di replicazione del genoma rispetto a quello di Pol-virus. Inoltre, il virus WT prodotta proteina NS3 virale come verificato mediante analisi Western blot (Figura 5C). Successivamente, abbiamo testato l'infettività del virus WT e Pol-giornalista inoculando ingenui Huh-7.5.1 celle con i surnatanti cell-free raccolti da 48 ore e 96 ore colture cellulari postali transfettate. Il Pol-virus ha avuto l'attività luciferasi-livello di base, mentre il virus WT aveva 2-3 registro più alto livello di replica a quello del virus Pol-reporter (Figura 5D). I risultati dimostrano che abbiamo una robusta HCV cul cellule infettive re sistema.
Figura 1. Schema generale del flusso di lavoro di analisi replicazione di HCV. Linearizzazione HCV costrutto di plasmide contenente T7 RNA polimerasi promotore (T7P) sottoposti a trascrizione in vitro. Il genoma dell'HCV RNA purificato viene elettroporata in Huh-7.5.1 cellule e placcato in fiaschi e piastra a 48 pozzetti. A 4 ore, 48 ore e 96 ore dopo la trasfezione, l'RNA cellulare e surnatanti di coltura vengono raccolte da fiaschi. Le cellule da piastra a 48 pozzetti sono utilizzati per la raccolta lisato proteico e sono fissati per il saggio di immunofluorescenza. Numero di copie del genoma analisi mediante RT-qPCR, titolo virale blotting e misurare occidentale sono fatto per valutare la replicazione di HCV.
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Figura 2. Produzione di HCV RNA genomico mediante trascrizione in vitro dei DNA plasmidici costruiti. A) l'organizzazione genomica dei virus chimerici J6CF/JFH-1 intragenotype 2a, FNX-HCV e FNX-HCV Pol null. La regione ceppo J6CF (5'NTR a parte NS2) è raffigurato in grigio scuro e la regione ceppo JFH-1 (parte del NS2 a 3'NTR) viene visualizzato in grigio chiaro. NS5B polimerasi mutazione dominio catalitico (GDD a AAG) è indicato da un asterisco. B) I passaggi coinvolti nella generazione linearizzata HCV plasmide. Picture Gel mostra le linearizzate, smussati DNA plasmidici indeterminato prodotte da Xba I e fagioli mung nucleasi digestione, pronti per la trascrizione in vitro. 0,8% gel di agarosio è stato utilizzato per risolvere il DNA. C) immagine Gel raffigura le HCV RNA genomici prodotte mediante trascrizione in vitro usando il sistema RNA polimerasi T7. WT: wild-type; Pol-: null Polymerase; M:marcatore.
Figura 3. Valutare i fenotipi di crescita dei costrutti HCV. A) valutare la cinetica di replicazione del genoma di wild-type (WT) e polimerasi nullo (Pol)-virus. Il numero di copie del genoma di RNA senso filamento valutata mediante RT-qPCR sono presentati nel grafico a barre. Le copie del genoma virale di Pol-virus diminuiti nel periodo di tempo che indica replica fenotipo carente. B) genoma Relativa livello replica di tipo selvaggio HCV è confrontata con quella di Pol-virus. C) Analisi Western blot dell'espressione della proteina di HCV. Proteina NS3 di HCV viene rilevato e beta-actina è usato come controllo cellulare. D) saggio di immunofluorescenza per studiare la replicazione virale. A 96 ore post-elettroporazione le cellule sono state fissate e sottoposti a immunostaining per le proteine HCV NS5A e RNA a doppia elica (ds RNA), un marker per HCV RNA intermedi di replicazione. I nuclei sono state visualizzate con colorazione Hoechst (barra Scala 50 micron). HPT:. ore dopo la trasfezione Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Esaminare l'infettività di HCV wild-type e la misurazione titolo virale. A) le cellule Naïve Huh-7.5.1 sono stati utilizzati per gli studi di infezione. Il supernatante privo di cellule raccolte a 48 e 96 ore dopo la trasfezione (HPT) di HCV RNA sono stati sottoposti a 10 volte diluizione seriale e aggiunto alle cellule in una piastra da 96 pozzetti in triplicato. 72 ore dopo l'infezione, le cellule sono state fissate e immunoistochimica per la proteina HCV NS5A. Le cellule con NS5A colorazione positiva (rosso) sono infettati con il virus. Per valutare Foci gruppo di formatura (FFU), i fuochi positivo alla massima diluizione sono stati contati. Pannelli rappresentativi di immagini vengono visualizzate (barra Scala 100 um). B) valori medi e deviazioni standard di titolo virale in FFU per millilitro sono mostrati nel grafico. La polimerasi mutante nullo non produce particelle infettive. WT: wild-type; Pol-:. Nullo Polymerase cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Valutare la replicazione del genoma e l'infettività di HCV giornalista. A) Un cartone animato di intragenotype 2a virus chimerico giornalista è presentato. Il gene luciferasi Renilla è infram inseritoe tra 5'NTR e il nucleo. B) La cinetica di replicazione del genoma di wild-type e virus reporter di Pol-mutante al momento indicata punti post-trasfezione è mostrato nel grafico. Lisati proteici sono state raccolte in 6 ore, 48 ore e 96 punti di tempo ora per la misurazione Renilla luciferasi attività enzimatica. La media e la deviazione standard calcolata dai valori in triplicato Renilla luciferasi (RLV) per ciascun virus sono presentati nel grafico. C) pannello Western blotting mostra l'espressione della proteina NS3 di HCV. Un antigene non specifico rilevato da anticorpo primario NS3 agisce come controllo di caricamento. Wild-type (WT) virus giornalista produce elevato livello di proteina NS3. D) Analisi di infettività del virus. Naïve Huh-7.5.1 cellule sono state inoculate con il surnatante privo di cellule ottenute da coltura transfettate a 48 ore e 96 hr punti di tempo. Renilla attività luciferasi di cellule infette sono stati misurati a 48 ore dopo l'infezione.Valori medi con deviazione standard sono mostrati nel grafico. Il virus Pol-reporter infettato le cellule avevano solo livello di attività luciferasi sfondo, mentre WT virus giornalista espone elevato livello di infettività.
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Discussion
Questa illustrazione descrive un metodo per analizzare il ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. HCV è un agente patogeno umano e il protocollo sulla biosicurezza prescritta dovrà essere seguite scrupolosamente. Sistemi di coltura di cellule HCV infettive sono state descritte in precedenza 11-13,16,17. Ci sono alcuni punti cruciali attuiamo quando seguendo il protocollo illustrato. In primo luogo, è di grande importanza per avere una buona qualità di intatta tutta la lunghezza RNA genomico virale per gli studi a valle. Il plasmide ingresso trasporta il cDNA virale deve essere linearizzata e smussati con cura. La nucleasi mung-bean impiegato per smussare lo sbalzo Xba I è una nucleasi non specifici e l'incubazione prolungato si tradurrà in un danno o degradazione di 3 'di genoma virale. La nucleasi deve essere rimosso immediatamente dopo l'specificato 30 min di incubazione mediante estrazione con fenolo-cloroformio o scambio anionico purificazione colonna. Estrazione Gel di nucleasi trattati DNA non può essere raccomandato comeenzima è attivo durante il processo di elettroforesi su gel.
Per la successiva in vitro passi RNA di trascrizione, in generale, uno sarà anche prendere ad ampio spettro precauzioni per ridurre al minimo ribonucleasi (RNasi) contaminazione. Tutti i reagenti ei materiali utilizzati devono essere RNasi libero. Per generare RNA genomico di alta qualità con interruzioni di RNA minimo filo, la necessità del RNA per essere sottoposto a meno stress fisico, evitando dura vortex e pipettaggio ripetute durante la purificazione e fasi di manipolazione a valle. Dopo il completamento della trascrizione di RNA, i modelli di DNA plasmidici ingresso devono essere rimossi dalla miscela RNA trascritto da DNasi (RNasi libero) trattamento. Rimozione incompleta può provocare riporto di DNA plasmidico in cellule trasfettate e influenzare la quantificazione del genoma assoluto numero di copie di RNA virale replicato. Quindi utilizzare DNasi enzima ad una concentrazione di 1 unità per microgrammo di DNA e avendo anche supplementare 15 min di incubazione a 37 DNasi º C puòaiutare. L'RNA trascritto può essere purificato mediante l'estrazione con fenolo-cloroformio o colonna a scambio anionico. Si dovrebbe fare attenzione per evitare di riporto di fenolo o altri reagenti al campione di RNA purificato, che può essere citotossici e interferire con le analisi molecolari.
Per scopi di elettroporazione, l'RNA purificato deve essere disciolto in acqua sterile priva di RNasi. Se il pellet di RNA è difficile da sciogliere, riscaldare il campione a 65 ° C per 5 min aiuterà. Una volta completata la trascrizione, è importante conservare immediatamente l'RNA in 10 pg di aliquote lavorativi Fatto in acqua RNasi libero a -80 ° C. Lo scopo delle aliquote è impedire ripetuti di congelamento / scongelamento mediata degradazione dell'RNA. Per i risultati sperimentali coerenti, si consiglia di trascrivere tutti i campioni ed i controlli allo stesso tempo. RNA di alta qualità è raccomandato per una resa titolo virale più elevata. Per trasfettando HCV RNA genomico, polimeri e lipidi a base di agenti di trasfezione possono be usato 21,22.
Fattori virali e di accoglienza influenzano notevolmente la cinetica di crescita di ceppi di HCV. Linea cellulare di epatoma umano (Huh-7) Derivati Huh-7.5, Huh-7.5.1 e linee cellulari Huh7-Lunet sono comunemente utilizzati per valutare virale 11-13,15 crescita. La produzione virale picco di JFH-1 ceppo nelle cellule Huh7-Lunet è a 3-4 giorni dopo la trasfezione, mentre in Huh-7.5.1 cellule è a 21 giorni dopo la trasfezione 13,15. Il virus chimerico intragenotype 2a FNX-HCV con i geni non strutturali da JFH-1 ceppo ha titolo a picco quattro giorni dopo la trasfezione in Huh-7.5.1 cellule 19,20. Per la produzione virale in vitro trascritto RNA, linea di passaggio precoce di cellule di epatoma umano è preferito. Produzione virale è notevolmente ridotto durante l'utilizzo di Huh-7.5.1 cellule over numero passaggio 20. Per garantire una maggiore sopravvivenza cellulare dopo l'elettroporazione, scongelati Huh-7.5.1 cellule sono concesso un periodo di due settimane di recupero prima di condurre un esperimento e maintained in 12% -15% FBS. Insieme a questo criterio, risospensione delle cellule in terreno di crescita contenente 15% FBS subito dopo l'elettroporazione aumenta la sopravvivenza cellulare permettendo una migliore produzione virale. Dopo il primo punto temporale 8 ore, le cellule sono poi passati a supporto contenente 10% FBS. Per minimizzare il riporto detriti cellulari, il supernatante di coltura virale viene sottoposta a centrifugazione e filtrazione attraverso filtro 4 micron. I surnatanti virali non concentrati o concentrati sono aliquotati e conservati a -80 ° C per ulteriori in vitro e in vivo. Le precauzioni e suggerimenti possono aiutare i ricercatori per eseguire con successo l'analisi del ciclo di replicazione di HCV.
Un'altra variante di giornalista HCV che ospita un gene marcatore come proteina fluorescente e una forma secreta di Gaussia luciferasi (Gluc) sono descritti per la ricerca HCV 18,23,24. Per i ricercatori concentrandosi sullo studio HCVreplicazione del genoma, HCV subgenomico Replicon (manca il nucleo geni per NS2) è uno strumento prezioso 9,10. Repliconi HCV sono non infettiva, quindi richiedono meno norme di bio-sicurezza e più facile da lavorare rispetto al infettiva HCV coltura cellulare e isolati clinici. HCV carente in attività della polimerasi NS5B è un controllo fondamentale per studiare la replicazione di HCV ciclo 11,12. HCV manca glicoproteine (delta E1E2), o attività p7-NS2 può essere controlli utili per gli studi che coinvolgono ingresso HCV, virione morfogenesi e l'uscita 12,19,25-27.
Per quanto riguarda le limitazioni, attualmente il sistema di coltura cellulare infettiva è disponibile solo per genotipi di HCV 1 e 2. Ceppi virali autentici appartengono ai genotipi 3 a 6, che sono in grado di crescere in modo efficiente in coltura cellulare ancora da identificare. Virus ricombinanti Intergenotypic sono alternative utili per studiare ciclo di replicazione dei diversi genotipi. Replica competente harbori virus chimericong core per regione NS2 da genotipi 1 a 7 ed il resto della sequenza da JFH-1 genotipo 2a genoma sono stati descritti 15,18. Un'altra limitazione è che la resa virale di JFH-1 e gli ceppi derivati chimerici è nell'intervallo 10 Marzo - 10 Giugno per ml, che è relativamente basso rispetto a quello di altri virus RNA come la poliomielite e influenza. Ceppo HCV con una crescita robusta deve essere sviluppata. Indagine futuro include l'uso del HCV reporter per lo screening di librerie di alto-capacità di identificare antivirali potenti e concentrarsi sullo sviluppo di vaccini candidati per prevenire l'infezione da HCV.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
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