Abstract
C 형 간염 바이러스 (HCV)는 세계 인구의 3 %에 영향을 미치는 만성 간염, 간경변 및 간암 등의 심각한 간 질환의 원인이됩니다. HCV는 가족 플라 비 바이러스과에 속하는 포락선 RNA 바이러스이다. 현재의 치료는 완전히 효과가없고, 부작용이 발생합니다. 가능한 HCV 백신이 없습니다. 따라서, 지속적인 노력은 백신과 더 나은 치료를 개발하기 위해 필요합니다. HCV 세포 배양 시스템은 바이러스 진입, 게놈 복제, 포장, 및 송신을 포함하여 HCV 성장의 각종 단계 연구에 중요하다. 제시된 현재 프로 시저에서, 우리는 야생형 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 바이러스 복제를 연구하는 레 닐라 루시퍼 라제 리포터 유전자를 운반하는 재조합 FNX-Rluc 바이러스를 사용했습니다. 인간 간암 세포주 (허-7을 기준으로)의 시험 관내 형질 도입에 사용 된은 HCV 게놈 RNA를 전사를. 무 세포 배양 상층 액, 단백질 해물과 t전 체 RNA는 HCV의 성장을 평가하는 사후 형질 포인트는 다양한 시간에 수확. HCV 게놈의 복제 상태 정량적 RT-PCR 및 HCV의 존재를 시각화하는 이중 가닥 RNA에 의해 평가 하였다. HCV 단백질 발현은 HCV NS3 및 NS5A 단백질에 대한 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 및 면역 형광 분석에 의해 확인되었다. 배양 상청 및 바이러스 역가에 감염성 입자를 방출 HCV의 RNA 형질 감염 세포를 측정 하였다. 루시페라아제 리포터 분석법은 HCV의 복제 수준 및 감염성을 평가하기 위해 사용되었다. 결론적으로, 우리는 HCV의 복제주기의 다른 단계를 특성화하기위한 다양한 바이러스 적 분석을 제시한다.
Introduction
C 형 간염 바이러스 (HCV)는 간경변과 간암의 원인이됩니다. 그것은 350,000의 사람들이 매년 1-3 죽어과 170 만명이 전 세계적으로 영향을 미칩니다. HCV는 9.6 KB의 게놈의 크기와 양의 가닥 RNA 바이러스이다. HCV 게놈은 단백질 가수 분해 10 폴리펩티드에 다양한 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 절단된다 ~ 3000 개의 아미노산의 단일 폴리 단백질로 번역된다. HCV는 속 Hepacivirus에 프로토 타입 바이러스와 가족 플라 비 바이러스과 4에 속한다. 노출되면, HCV는 개인의 80 %에 만성 감염을 설정합니다. 감염이 진단은 간 저하를 방지하기 위해 치료 적 개입을 허용 할 수 있습니다 대부분 증상이 적시에 있습니다. 현재 치료는 차선이고 백신은 5,6 사용할 수 없습니다.
C 형 간염의 원인은 1989 7 설명했다. HCV 복제를 공부하는 것은 C 형 간염 백신과 치료 연구를위한 중요하지만이 있었다긴 효율적인 바이러스 배양 시스템의 부족에 의해 방해. HCV의 분자 클론은 간내 접종 8시 침팬지에 감염 될 것으로 나타났다. 이어서, HCV 서브 게놈 플리은 세포 배양 시스템 9,10에서 바이러스 게놈 복제 단계를 절개 할 수있는 기술되었다. 유전자형 2A의 HCV의 발견은 JFH-1 (일본어 전격 성 간염 1) 분리, 세포 배양을 감염시킬 수는 HCV의 복제 연구를 11 ~ 13를위한 새로운 길을 열었습니다. 유전자형 2A 변형 JFH-1 간 및 내 유전자형 키메라 바이러스와 유전자형 1 HCV 기반 기반 감염성 문화 시스템뿐만 아니라 14 ~ 18 사용할 수 있습니다.
우리는 성공적으로 단백질 도메인 및 시스 - 작용하는 RNA 요소 (19, 20)의 고해상도 기능 프로파일의지도를 구하는 것이 JFH-1 균주 및 HCV의 intragenotype의 2A 키메라 바이러스를 사용했습니다. 이 기사에 따르면, 우리가 할 수 일상적으로 사용하는 효과적인 문화 시스템을 설명HCV의 복제주기 및 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 단계를 공부. 우리는 바이러스 게놈 복제 및 intragenotype 2a 개의 HCV와 레 닐라 루시퍼 기반 기자 HCV의 새로이 감염을 평가 한 바이러스 분석을 제시한다.
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Protocol
프로토콜의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다.
1. 셀
- 15 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 비 필수 아미노산, 10mM의 헤 페스, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖), 및 2 mM의 L-글루타민을 포함 완전 성장 배지를 준비한다.
- C 형 간염 바이러스의 복제주기의 체외 분석을 위해 위의 보충제를 포함하는 완전한 성장 매체 허-7.5.1 셀 (13)을 유지한다.
- 5 % CO 2와 37 ° C에서 지정한 보충 성장 매체 허-7.5.1 세포 배양 바이러스의 변종.
2. 바이러스와 플라스미드 구문
- HCV RNA의 상보 적 DNA (cDNA를) 형태로 생성 및 유전자 조작의 용이성을 위해 플라스미드 벡터로 복제. 참고 : 일본의 전격 성 간염 1의 발견은, JFH-1 (유전자형 2A의 HCV), HCV 연구에 대한 비판적이고있다 격리주로 HCV의 복제 사이클 11-13를 연구하는 데 사용. JFH-1 HCV에 따라 간 및 intragenotypic 키메라 바이러스는 일반적으로 연구 14-18에서 사용된다. 합성 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 monocistronic 키메라 기자 균주의 건설은 이미 19 건설 자세한 내용은이 프로토콜의 범위를 벗어 설명했다.
- 그것은 (뉴클레오티드 1-2878) J6CF 부모의 변형 (NCBI의 기탁 아니오. AF177036)의, 같은 5'NTR, 구조 지역과 P7 및 NS2 비 구조 영역의 일부를 포함로 pFNX-HCV intragenotype의 2A 바이러스를 사용 잘 JFH-1 바이러스 균주 (NCBI의 기탁 없습니다. AB047639)의 비 구조적인 구성 요소로. 참고 : FNX-HCV가 JC1의 intragenotype의 2A 키메라 HCV의 순서에 따라 합성 하였다 이전에 (15) 보도했다.
- R을 삽입하여 (단계 2.2 이상) pFNX-HCV의 변형을 기반으로 monocistronic 키메라 기자 바이러스 구조, pFNX-Rluc를 생성5 'NTR과 (NT 388과 389 사이의) 핵심 유전자 사이 enilla 루시퍼 라제 유전자. 이어서, 절단 신호로서 작동 할 구제역 바이러스 2A (F2A) 펩티드 서열을 사용하여 루시 페라 제 유전자 및이 구조의 핵심 유전자를 연결한다.
- pFNX-HCV 또는 pFNX-Rluc 바이러스 배경을 사용하여 RNA 중합 효소 널 (폴) 바이러스 구조 엔지니어. , AAG의 아미노산 잔기 이러한 바이러스 백본 중 하나의, NS5B 효소 촉매 잔류 물, GDD (8615-8623을 NT AA 2,759에서 2,761 사이)를 교체합니다.
3. 체외 HCV의 RNA의 전사
- intragenotype의 2A 키메라 바이러스 FNX-HCV와 FNX-HCV의 유류 널 (null) 바이러스 복제 (그림 2A)의 평가를위한 (폴) HCV를 사용합니다.
- 를 XbaI 제한 효소로 바이러스 플라스미드를 선형화 한 다음 평활 말단을 생성하는 녹두 클레아로 취급한다. 음이온 교환 크로마토 그래피에 의해 소화 플라스미드를 정화. O를 무결성을 확인F 겔 전기 영동 (그림 2B)를 아가 로스의 DNA를 쓰는하여 플라스미드를 선형화.
- -T7 RNA 중합 효소를 이용하여 선형화 된 바이러스 플라스미드를 표기.
- RNA 정제 키트를 사용하여 새로 합성 된 DNA 분해 효소 처리 RNA를 정화.
- 아가로 오스 겔 전기 영동 (그림 2C)에 의해 RNA의 생산을 확인합니다.
- 분광 광도법에 의한 RNA의 양을.
- 10 μg 작업 분량 씩 -80 ° C에서 생성 된 RNA를 저장합니다. 참고 : 같은 시간에 각각의 바이러스 샘플 및 제어를위한 모든 RNA를 해독하여 각 실험 설계 내에서 RNA의 품질의 변화를 최소화하기 위해.
4. HCV RNA 형질 및 시료 채취
- 트립신을 사용하는 허-7.5.1 세포를 수확.
- 세포 원심 분리기를 씻어 차가운 낮은 혈청 미디어로 두 번 정학을 재현 탁합니다. ML 당 1 × 10 7 세포에서 낮은 혈청 배지에서 세포를 Resuspend.
- 10 & # 총 혼합956, 0.4-CM의 일렉트로 큐벳에 재현 탁 세포 (4 × 10 6 세포)의 400 μL와 전사 바이러스 성 RNA의 g. 270 V에서 전기 충격을 통해 100 Ω, 950 μF을 세포를 형질.
- 15 % FBS와 10 ㎖ 완전한 성장 미디어 일렉트로 세포를 Resuspend. 참고 : 허-7.5.1 세포는 15 % 소 태아 혈청에서 배양 할 때 일렉트로 세포의 증가 생존을 볼 수 있습니다.
- 4, 48 및 96 시간 : 두 T-25 플라스크 (플라스크 당 ~ 1.2 × 10 6 세포) 및 48 - 웰 플레이트 다음과 같은 시점마다 (물론 당 1 × 10 4 세포)에서 세포를 접시.
- 배양 플라스크와 접시에서 죽은 세포 파편을 제거하기 위해 10 % FBS와 신선한 보충 성장 매체와 4-8 시간 후 - 형질 전환에 용지를 교체하십시오.
- 48, 96 시간의 시점에서, 4에서 10 분 동안 1,500 rpm에서 원심 분리하여 세포를 수집 한 시료에서 세포 파편을 제거 수확 세포 배양 상청액 º C.
- -80 º C에서 세포가없는 상층 액을 저장 를 Lyse 웨스턴 블롯에 의해 단백질과 RNA 분석 및 지정된 시점에서 전사 정량적 PCR 역 세포.
5. HCV 게놈 복사를 평가하기위한 전사 정량 PCR (RT-qPCR에)를 역방향
- HCV 게놈 RNA 카피 수를 결정하는 두 단계 RT-qPCR에를 수행합니다.
- 역 쓰다 1 역전사 효소 및 5'NTR (JFH RTQ R : 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ')에 결합 HCV의 가닥 특정 프라이머 사용하여 총 세포 RNA ㎍의 또는 하우스 키핑 유전자 peptidylprolyl 이성화 효소 G (삑 R 특정 프라이머를 : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). 또한 HCV의 가닥 프라이머를 사용하여 알려진 게놈 사본 (10 1 9 표준 10)의 (3 단계에서 생성 된) FNX-HCV RNA를 표기 역.
- (JFH RT HCV 특정 프라이머를 이용하여 생성 된 cDNA의 전사 50 NG를 사용하여 qPCR에를 수행QF : 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R : 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ')와 DNA는 qPCR에 슈퍼 믹스를 포함하는 녹색 염료를 결합. 또한 하우스 키핑 유전자 삑위한 qPCR에 수행 (프라이머 삑 F : 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 ', 삑 R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') 참고 : 예제를 통해 정확한 세포 내 HCV의 RNA 수준을 계산하는 경우, 휴대 하우스 키핑 유전자 삑를 사용 정규화에 대한 발현 수준 (CT주기). 카피 수 결정을위한 표준으로 FNX-HCV 게놈의 카피 수를 사용합니다.
- 15 초 동안 95 º C ~ 60 : qPCR에를 실행하는 HCV의 RNA 사본의 수를 결정하는 경우 다음과 같은 조건을 사용하여 실시간 PCR 시스템을 사용하여 30 초 (40 회)에 대해 C를 º.
- 게놈의 복제 결과를도 3a 및도 3b를 참조하십시오.
6. 웨스턴 블로 팅 분석 HCV 단백질 발현 (그림 3C)를 검출
- 세포 용 해물의 FR을 사용하여톰 바이러스 성 RNA는 단백질 웨스턴 블롯 분석을위한 96 시간 포스트 형질에 형질 전환.
- SDS-PAGE 및 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인으로 이동을 사용하여 세포 용 해물을 해결.
- 5 % 탈지 분유, 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 0.2 % 트윈 20을 함유하는 차단 용액을 사용하여 멤브레인을 차단.
- 기본 마우스 단일 클론 항체 NS3와 막 (1 천에 희석) 및 베타 - 액틴 (1 5,000 희석)을 품어.
- 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (1 5,000 희석)에 접합 된 염소 항 - 마우스 IgG의 추가 및 화학 발광에 의해 감지.
7. 면역 형광 분석 (IFA)
- 면역 형광 분석 -20 º C에서 30 분 동안 메탄올을 사용하여 HCV 감염과 형질 전환 세포를 고정합니다.
- PBS로 3 회 세포를 세척하고 IFA 버퍼를 차단으로 차단합니다.
- 토끼 폴리 클로 날 또는 마우스 단일 클론 항-DSR (친절 박사 다스 굽타, UCLA에서 제공) 항 NS5A 주로 항체를 사용하여NA 항체 1:200 (1 ㎍ / ㎖)의 희석 J2와 5 시간에 4 박에서 알을 품다 º C.
- 세 번 차 항체 후 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 염소 항 - 토끼 IgG의-488 클론 차 항체 또는 1:1,000 희석 (1 ㎍ / ㎖)에 염소 항 - 마우스 IgG-594 클론 차 항체를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- PBS 형광 현미경 (그림 3D)를 사용하여 훽스트 염료 및 뷰를 사용하여 3 회 얼룩 핵으로 세포를 씻으십시오.
8. 측정 바이러스 역가
- 판 순진 허-7.5.1 세포 약 3 × 10 3 세포 / 잘 96 - 웰 플레이트를 사용하여. 다음 날, 성장 미디어를 사용하여 HCV의 RNA 형질 세포에서 수확 한 무 세포 배양 상층 액의 10 배 시리얼 희석을 수행하고 허-7.5.1 세포에 배수로 접종.
- -20에서 30 분 동안 메탄올 (사용하여 72 시간 게시물 감염에서 세포를 수정
- NS5A 긍정적 인 초점을위한 카운트 밀리리터 당 포커스 형성 단위의 평균 수 (FFU)를 계산하는 가장 높은 희석을 사용합니다. HCV 역가 그림 4를 참조하십시오.
바이러스 게놈 복제 및 감염성 9. 닐라 루시퍼 라제 리포터 분석
- 바이러스 게놈 복제, 48 - 웰 플레이트에 세중 판 HCV의 RNA-일렉트로 허-7.5.1 세포 (1 × 104 세포 / 웰) 평가하십시오.
- 를 Lyse 6 시간에서 수동 용해 완충액 75 μL, 48 시간, 96 시간 후 - 형질을 가진 세포.
- -80 º C에서 실내 온도와 매장에서 15 분 동안 부드럽게 플레이트 록
- , 레 닐라 루시퍼 라 아제의 효소 활성을 측정하고, 실온으로 단백질 및 파쇄물 레 닐라 루시퍼 라제 분석 시약을 해동.
- 96 - 아, 잘 당 단백질의 용해 액의 20 μl를 추가합니다 L 화이트 발광 판과 루미에 접시를 놓습니다.
- 레 닐라 루시퍼 라제 분석 시약 (엘렌 테라 기판 + 버퍼) 잘 당 2 초 미리 읽기 지연 시간 후 100 μl를 분배; 10 초 동안 방출되는 빛을 통합 할 수 있습니다.
- 생물학적 삼중의 루시퍼 라제 값으로부터 각 샘플에 대한 평균 및 표준 편차를 계산 및 통계 분석 데이터 (도 5) 주체.
- 감염을 평가하기위한 48 - 웰 플레이트에 순진 허-7.5.1 세포에 세중 표시된 시점 (48 시간 및 96 시간)에 대한 HCV의 RNA 형질 세포에서 얻은 세포가없는 상층 액 500 μl를 접종.
- 물론 후 6 시간 게시물 감염 당 신선한 매체의 500 μL와 바이러스 접종을 교체합니다.
- 를 Lyse 8.2-8.7 (그림 5) 단계에 설명 된대로 레 닐라 루시퍼 라제 분석에 48 시간의 후 감염과 피사체에 세포.
- 그래프에 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. P 값은 짝 t 테스트에 의해 산출 하였다.
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Representative Results
C 형 간염 바이러스는 RNA 바이러스이다. 따라서, 유전자 조작 목적, HCV 게놈 cDNA를 박테리아 플라스미드 벡터에 클로닝되었다. T7 RNA 폴리머 라제 프로모터 서열은 HCV 게놈의 5 '말단 바로 전에 도입되었다. HCV 분석 워크 플로우에 대한 일반적인 개요를 그림 1에 제시되어있다. 정확한 3 '끝 HCV 게놈 RNA를 생성하려면, 플라스미드를 포함하는 HCV 게놈은 XBA I 제한 효소 생성 된 단일 가닥 오버행이 녹두 클레아 소화를 둔화 된 절단된다 . HCV 선형화 된 플라스미드의 품질을 아가 로스 겔 전기 영동 (도 2B)에 의해 평가 하였다. HCV DNA는 시험 관내 전사에 매개 T7 RNA 중합 효소를 실시하고 그 결과 RNA는 9.6 킬로베이스 (도 2c)에서 하나의 제품을 얻었다.
우리는 intragenotype 2a 개의 HCV (그림의 성장 속도론을 테스트60, 3). 허-7.5.1 세포는 야생형 (WT)과 중합 효소 널 (null) 바이러스의 시험 관내 전사 RNA와 일렉트로했다. 우리는 RT-qPCR에 의해 바이러스 감지 게놈 복제를 평가했다. 결과는 WT 바이러스 효율적 게놈 (도 3a 및도 3b)를 복제하는 것이 나타났다. 야생형은 폴 바이러스에 비해 게놈 복제의 1-3 로그 높은 수준을 나타내었다. WT 바이러스는 바이러스 단백질 절단 (프로테아제 활성)에 관여 NS3 단백질 (도 3c), 및 게놈 복제 (헬리 케이즈 활성)을 생성한다. 면역 형광 분석 (그림 3D)에 의해 평가 또한 WT 바이러스 NS5A 단백질을 표현했다. NS5A 단백질은 HCV의 RNA 복제 효소 복합체의 일부입니다. 바이러스 게놈 복제를 시각화하기 위해, 우리는 구체적으로 dsRNA를 인식하는 항체를 사용하여 이중 나선 (DS) HCV의 RNA의 존재를 조사했다. HCV 게놈 증폭하는 동안, 센스 가닥의 RNA는 C안티 - 센스 게놈으로 opied, 따라서 이중 가닥 RNA 중간체는 감염된 세포의 세포질 내에 존재한다. NS5A 단백질과 dsRNA에 활성 바이러스 복제를 시사 WT 형질 감염된 세포의 세포 세포질 (도 3d)에 공동 편재. 이와 함께, WT 바이러스 형질 허-7.5.1 세포에서 활성 복제를 설립했다.
HCV 연구의 발전으로 인해 감염 세포 배양 시스템의 부족으로 제한했다. JFH-1 HCV의 긴장과 우리가 바이러스 성 항목, RNA의 번역, RNA 복제 및 감염성 바이러스 자손의 형성 등의 세포 배양에 전체 HCV의 복제주기를 조사 할 수 키메라 연구소 긴장의 연속 특성의 발견. HCV 역가 새로이 감염을 평가하기 위해, 우리는 HCV의 RNA 형질 세포에서 수확 한 세포 배양 상층 액을 접종. HCV 감염은 HCV NS5A 단백질의 검출에 의해 시각 및 산출되었다전염성 초점 (그림 4) 계산에 의한 바이러스 역가. 우리는 하나의 초점으로 NS5A에 대한 세포의 격리 된 클러스터 (2 이상 세포가) 긍정적 인 생각. 결과는 WT 바이러스는 전염성이며 감염성 입자의 단위 / ㎖를 형성하는 4 ~ 10에 초점을 생산하는 것으로 나타났다.
우리는 또한 레 닐라 루시퍼 라 아제 (Rluc) 리포터 유전자 (그림 5A)을 품고 HCV 기자 바이러스를 설립했다. 리포터 HCV가 높은 컨텐츠 스크리닝 분석법뿐만 아니라 돌연변이 바이러스의 다수를 테스트하기 위해 사용될 수있다. 여기에서 우리는 WT와 폴 기자 바이러스의 성장 표현형 평가를 제시한다. 바이러스 게놈이 복제하면, 루시 페라 제 활동은 초과 근무 포스트 형질을 증가시킬 것입니다. 증가 된 게놈 복제 수준은 증가 된 루시퍼 라제 활성로부터 추론 될 수있다. 따라서, 루시퍼 라제 활성을 간접적으로 게놈 복제의 수준의 측정을 제공한다. WT 또는 폴 VI부터 수확 해물지정된 시간 지점에서 RAL RNA 형질 세포는 루시 페라 제 활동에 대한 검사를했다. 6 시간 후 - 형질에서 WT와 폴 바이러스 모두 (그림 5B) 번역했다 형질 전환 RNA의 유사한 입력 레벨을 나타내는 유사한 루시 페라 제 활동을했다. 그러나 48 시간과 96 시간 후 - 형질에서, WT 바이러스는 폴 바이러스에 비해 게놈 복제 수준을 증가 보였다. 웨스턴 블롯 분석 (그림 5C)에 의해 확인 된대로 또한, WT 바이러스는 바이러스 NS3 단백질을 생산. 그 후, 우리는 48 시간과 96 시간의 후 형질 세포 배양에서 수집 한 세포가없는 상층 액과 순진 허-7.5.1 세포를 접종하여 WT와 폴 기자 바이러스의 감염을 테스트했습니다. WT 바이러스 폴 기자 바이러스 (그림 5D)의 그것과 복제의 2-3 로그 높은 수준을했다 반면 폴 바이러스는 기본 수준의 루시 페라 제 활동을했다. 결과는 우리가 강력한 HCV 감염 세포 cultu을 가지고 있음을 입증 시스템 재.
그림 1. HCV 복제 분석 워크 플로우의 일반 개요. 시험 관내 전사를 실시 T7의 RNA 중합 효소 프로모터 (T7p)를 포함하는 HCV의 플라스미드를 선형화. 정제 HCV의 RNA 게놈은 허-7.5.1 세포에 일렉트로 및 플라스 크 및 48 웰 플레이트에 도금. 4 시간, 48 시간, 96 시간 후 형질에서, 세포의 RNA와 배양 상층 액은 플라스크에서 수확된다. 48 - 웰 플레이트에서 세포를 수확 단백질의 용해 액에 활용하고 면역 형광 분석이 고정되어 있습니다. RT-qPCR에 의한 게놈 복사 번호 분석, 웨스턴 블로 팅 및 측정 바이러스 역가가 HCV 복제를 평가하기 위해 수행됩니다.
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건설 플라스미드 DNA의 시험 관내 전사에 의한 HCV RNA를 게놈의 그림 2. 생산. J6CF/JFH-1의 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV와 FNX-HCV의 유류의 null) 게놈 조직. J6CF 변형 영역 (NS2의 일부에 5'NTR이) 어두운 회색과 JFH-1 균주 지역 (3'NTR에 NS2의 일부)에 도시되어있다가 밝은 회색으로 표시됩니다. NS5B 중합 촉매 도메인 돌연변이 (GDD는 AAG하는) 별표. B) 선형화 된 HCV 플라스미드를 생성에 관여 단계로 표시됩니다. 젤 그림은 시험 관내 전사에 대한 준비 XBA I 녹두 콩 핵산 분해 효소 분해에 의해 생성 된 선형, 무딘 엔드 플라스미드 DNA를 보여줍니다. 0.8 % 아가 로즈 겔 DNA를 확인하는 데 사용 하였다. C) 젤 픽쳐의 T7 RNA 폴리머 라제 시스템을 이용하여 시험 관내 전사에 의해 제조 HCV 게놈 RNA를을 도시한다. WT : 야생형; 폴 : 중합 효소 널 (null); M :마커.
그림 3. HCV 구조의 성장 표현형을 평가. A) 야생형 (WT)과 중합 효소 널 (null) (폴) 바이러스의 게놈 복제 속도론을 평가. RT-qPCR에 의해 평가 센스 RNA 가닥의 게놈 복사 번호는 막대 그래프로 표시됩니다. 폴 바이러스의 바이러스 게놈 사본) 복제 결핍 표현형. B를 나타내는 시간의 기간에 걸쳐 감소 야생형 HCV 상대 게놈 복제 수준은 폴 바이러스 HCV 단백질의 발현. C) 웨스턴 블롯 분석의 것과 비교된다. HCV NS3 단백질이 검출 및 β-액틴은 셀룰러 제어. D) 바이러스 복제를 조사하는 면역 형광 분석으로서 사용된다. 96 시간 후 전기 충격으로 세포를 고정하고, IMM 실시HCV의 NS5A 단백질과 이중 가닥 RNA (DS RNA), HCV의 RNA 복제 중간체 마커 unostaining. 핵은 훽스트 얼룩 (스케일 바 50 ㎛)로 시각화 하였다. HPT :. 시간 후 형질 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4. 야생형 HCV의 감염을 검사하고 바이러스 역가를 측정. A) 나이브 허-7.5.1 세포는 감염 연구에 사용되었다. HCV RNA의 48 및 96 시간 후 - 형질 감염 (HPT)에서 수집 된 무 세포 상층 액을 10 배 일련 희석을 실시하고 세중 96 - 웰 플레이트에서 세포에 첨가 하였다. 72 시간 후 감염, 세포를 고정하고 HCV NS5A 단백질에 대한 면역 염색 하였다. N과 세포S5A 긍정적 인 염색 (빨강)가 바이러스에 감염됩니다. 병소 성형 유닛 (FFU)를 평가하기위한, 가장 높은 희석 포지티브 초점을 계수 하였다. 이미지의 대표 패널은 (스케일 바 100 μm의). B) 밀리리터 당 FFU의 평균 값과 바이러스 역가의 표준 편차를 그래프에 표시됩니다 표시됩니다. 중합 효소 NULL 돌연변이는 전염성 입자를 생성하지 않았다. WT : 야생형; 폴 :. 중합 효소 널 (null) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 게놈 복제 및 기자 HCV의 감염을 평가. A) intragenotype의 2A 키메라 기자 바이러스의 만화는 표시됩니다. 레 닐라 루시퍼 라제 유전자가 삽입 infram이며5'NTR 핵심. B) 야생형 및 지정된 시간에 폴 돌연변이 기자 바이러스의 게놈 복제 속도론 포스트 형질 포인트 사이에 전자가 그래프에 표시됩니다. 단백질 용 해물은 6 시간, 48 시간 및 레 닐라 루시퍼 라제의 효소 활성을 측정하기위한 96 시간의 시점에서 수거 하였다. 평균과 각 바이러스 세중 레 닐라 루시퍼 값 (RLV)에서 계산 된 표준 편차 그래프. C) 웨스턴 블로 팅 패널은 HCV NS3 단백질 식을 보여줍니다에 제시되어있다. NS3 차 항체에 의해 검출 비특이적 항원 로딩 대조군으로 작용한다. 야생형 (WT) 기자 바이러스 NS3 단백질의 높은 수준을 생산하고 있습니다. D) 바이러스 감염의 분석. 순진 허-7.5.1 세포는 48 시간과 96 시간의 시점에서 형질 문화에서 얻은 세포 상등액을 접종했다. 감염된 세포의 레 닐라 루시퍼 라제의 활동은 48 시간의 감염 후 측정 하였다.표준 편차와 평균 값이 그래프에 표시됩니다. WT 기자 바이러스 감염의 높은 수준을 보였다 반면 폴 기자 바이러스는 세포가 루시 페라 제 활동의 배경 만 레벨을 가지고 감염.
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Discussion
이 그림은 C 형 간염 바이러스의 복제 사이클을 분석하는 방법을 설명한다. HCV는 인간의 병원체이며, 소정의 바이오 안전성 의정서는 엄격하게 준수해야하는 것입니다. HCV 감염 세포 배양 시스템은 이전 11-13,16,17 설명되었다. 예시 된 프로토콜을 다음과 같은 때 우리가 구현하는 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 다운 스트림 연구에 그대로 전체 길이 바이러스 게놈 RNA의 좋은 품질을 가지고 높은 중요하다. 바이러스의 cDNA를 들고 입력 플라스미드를 선형화하고 신중하게 무디게 할 수있다. XBA I 오버행을 무디게하기 위해 사용 된 녹두 콩 클레아가 아닌 특정 클레아 제와 장시간 배양은 바이러스 게놈의 3 '말단의 손상이나 성능 저하가 발생합니다. 클레아는 페놀 - 클로로포름 추출 또는 음이온 교환 칼럼 정제에 의해 지정된 30 분 인큐베이션 후에 즉시 제거되어야한다. DNA 치료 핵산 분해 효소의 젤 추출로 추천 할 수 없습니다효소는 전기 영동 과정 중에 활성화된다.
시험 관내 RNA 전사 단계에서 다음의 경우, 일반적으로, 하나는 (RNA 분해 효소) 오염 리보 뉴 클레아 제를 최소화하기위한 광범위한 스펙트럼의 예방 조치를 취할 것입니다. 사용 된 모든 시약 및 재료는 무료의 RNase해야합니다. 최소 RNA 가닥 나누기 고품질의 게놈 RNA를 생성하려면, RNA 정제 및 다운 스트림 처리 단계에서 거친 소용돌이로 교반 및 반복 피펫을 피함으로써 더 적은 물리적 인 스트레스를 실시 할 필요가있다. RNA 전사 종료 후, 입력 된 플라스미드 DNA 템플릿 DNA 분해 효소 (RNA 분해 효소 무료) 처리에 의해 전사 된 RNA 믹스로부터 제거되어야한다. 불완전한 제거는 형질 세포에 플라스미드 DNA의 이월 결과 복제 된 바이러스 성 RNA의 절대 유전체 복제 수의 정량에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 하나의 DNA 마이크로 그램 당 단위 및도 37에 DNase의 인큐베이션의 여분 15 분을 갖는 DNase의 농도에서 효소를 사용 º C 수도움이됩니다. 전사 된 RNA를 페놀 - 클로로포름 추출 또는 음이온 교환 컬럼 중 하나에 의해 정제 할 수있다. 케어는 세포 독성 및 분자 분석을 방해 할 수있는 정제 된 RNA 샘플, 페놀 또는 다른 시약의 이월을 방지하기 위해 운동을해야한다.
전기 천공을 위해, 정제 된 RNA는 RNA 분해 효소가없는 멸균 수에 용해되어야한다. RNA 펠렛 5 분 동안 65 º C에 샘플을 가열, 용해하기 어려운 경우 도움이 될 것입니다. 전사가 완료되면, -80 º C.에서의 RNase없는 물 제 작업 분취 량의 10 μg 즉시 RNA를 보관하는 것이 중요 분취 량의 목적 반복 냉동 / 해동 매개되는 RNA의 분해를 방지하는 것이다. 일관성있는 실험 결과를 위해, 그것은 동시에 모든 샘플 및 컨트롤을 표기하는 것이 좋습니다. 고품질의 RNA가 높은 바이러스 역가 수익률을 권장합니다. 형질 에이전트가 B도 기반 HCV 게놈 RNA 폴리머 및 지질을 할 수 형질에 대한전자는 21, 22을 사용했다.
바이러스와 숙주 요인은 크게 HCV 균주의 성장 동역학에 영향을 미친다. 인간 간암 세포주 (허-7) 유도체는 허-7.5, 허-7.5.1 및 Huh7-Lunet 세포주는 일반적으로 바이러스 성 성장 11-13,15을 평가하는 데 사용됩니다. 허-7.5.1 세포에서 21 일째 형질 (13, 15)에 반면 Huh7-Lunet 세포에서 JFH-1 균주의 피크 바이러스 생산은 3-4 일 후 형질에 있습니다. intragenotype의 2A 키메라 바이러스 FNX-HCV가 JFH-1 균주에서 비 구조 유전자를 갖는 허-7.5.1 세포 (19, 20)의 4 일째 형질에 피크 역가가 있습니다. 시험 관내 전사 RNA의에서 바이러스 생산을 위해, 초기 통과 사람의 간암 세포주가 바람직하다. 통로 번호 (20)를 통해 허-7.5.1 세포를 사용하는 동안 바이러스 생산이 크게 줄어 듭니다. 일렉트로 후 증가 된 세포의 생존을 보장하기 위해, 허-7.5.1 세포 실험과 마이를 수행하기 전에 2 주 회복 기간을 허용 해동12 % -15 %의 FBS에 ntained. 이 기준에 따라, 즉시 전기 충격 후 15 % FBS를 포함하는 성장 매체에있는 세포의 재 부상이 더 바이러스 생산을 허용 세포의 생존을 증가시킨다. 제 8 시간 시점 후, 세포는 10 % FBS를 함유하는 매체로 전환된다. 세포 파편 위에 반송을 최소화하기 위해, 바이러스 배양 상청은 4 마이크론 필터를 통해 여과 및 원심 분리를 실시한다. 농축되지 또는 농축 된 바이러스 상층 액은 -80에 분주 저장됩니다 º C 생체 외 및 생체 내 실험에서 추가하십시오. 이러한주의 사항 및 제안이 성공적으로 HCV의 복제주기의 분석을 수행하기위한 연구를하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이러한 형광 단백질과 Gaussia 루시 페라 제 (Gluc)의 분비 형태로 마커 유전자를 비호 기자 HCV의 또 다른 변화는 HCV 연구 18,23,24에 대해 설명합니다. 연구팀은 HCV 조사에 초점을위한게놈 복제 (NS2에 유전자 코어 부족) HCV 서브 게놈 플리 귀중한 도구 9,10입니다. HCV의 플리 따라서 작은 생물 안전 규정 및 감염 세포 배양 HCV 임상 분리 균주에 비해 훨씬 작업이 쉬워을 필요로 비 감염성 있습니다. NS5B 효소 활성이 결핍 HCV는 HCV의 복제 사이클 11, 12, 공부를위한 중요한 컨트롤입니다. HCV 봉투 당 단백질 (델타 E1E2를) 부족, 또는 P7-NS2 활동은 HCV 항목, 비리의 형태 형성 및 송신 12,19,25-27 관련된 연구에 유용하게 컨트롤 할 수 있습니다.
제한에 관해서는, 현재 감염 세포 배양 시스템은 HCV 유전자형 1, 2 사용할 수 있습니다. 정통 바이러스 변종이 확인 될 아직 세포 배양에 효율적으로 성장 할 수있는 6 3 유전자형에 속한다. Intergenotypic 재조합 바이러스는 다양한 유전자형의 복제주기를 공부에 유용한 대안이다. 복제 능력 키메라 바이러스 harbori유전자형 1 ~ 7 및 JFH-1 유전자형 2A의 게놈 시퀀스의 나머지는 15,18을 설명했다에서 NS2 지역에 NG 코어. 또 다른 한계는 JFH-1 및 이의 유도체 균주의 키메라 바이러스 수율 등 소아마비, 인플루엔자 등의 RNA 바이러스에 비해 상대적으로 낮은 10월 3일부터 10월 6일까지 당 밀리리터의 범위로되어있다. 강력한 성장 HCV 균주 개발 될 필요가있다. 미래 연구는 강력한 항 바이러스를 식별하고 HCV 감염을 방지하기위한 백신 후보의 개발에 초점을 높은 처리량 라이브러리 검사에 대한 기자 HCV의 사용을 포함한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
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