Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En protokoll for Analysere Hepatitt C-virus Replication

Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51362
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA
* These authors contributed equally

Abstract

Hepatitt C-virus (HCV) påvirker 3% av verdens befolkning, og forårsaker alvorlige leversykdommer, inkludert kronisk hepatitt, skrumplever og leverkreft. HCV er en innhyllet RNA-virus som tilhører familien Flaviviridae. Nåværende behandling er ikke fullt ut effektiv og fører til uønskede bivirkninger. Det er ingen HCV-vaksine tilgjengelig. Således fortsettes innsats som kreves for å utvikle en vaksine og bedre terapi. En HCV cellekultur system er avgjørende for å studere ulike stadier av HCV vekst inkludert viral inntreden, genomet replikering, emballasje, og avstigning. I dagens prosedyre presenteres, brukte vi en villtype intragenotype 2a kimære virus, FNX-HCV, og en rekombinant FNX-Rluc viruset bærer en Renilla luciferase reporter genet for å studere virusreplikasjon. En human hepatom-cellelinje (Huh-7 basert) ble anvendt for transfeksjon in vitro transkribert HCV genomisk RNA. Cell-free kultur-supernatanter, protein lysater og total RNA ble høstet ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon for å vurdere veksten av HCV. HCV genomreplikasjon status ble evaluert ved kvantitativ RT-PCR og visualisere nærværet av HCV dobbelt-trådet RNA. HCV protein uttrykk ble verifisert av Western blot og immunofluorescence analyser ved hjelp antistoffer spesifikke for HCV NS3 og NS5A proteiner. HCV-RNA-transfekterte celler utgitt infeksiøse partikler i kultur supernatanten, og den virale titer ble målt. Luciferase assay ble anvendt for å vurdere replikasjonsnivå og infektivitet av reporter HCV. I konklusjonen, presenterer vi ulike virologiske analyser for å karakterisere ulike stadier av HCV replikering syklus.

Introduction

Hepatitt C-virus (HCV) fører til skrumplever og leverkreft. Den rammer 170 millioner mennesker over hele verden med 350 000 mennesker dør årlig 1-3. HCV er en positiv streng RNA-virus med et genom størrelse på 9,6 kb. De HCV-genomet er oversatt som et enkelt polyprotein på ~ 3000 aminosyrerester som er proteolytisk spaltet ved forskjellige cellulære og virale proteaser inn i 10-polypeptider. HCV er prototypen virus i slekten Hepacivirus og tilhører familien Flaviviridae fire. Ved eksponering, etablerer HCV kronisk infeksjon hos 80% av individene. Infeksjonen er mest symptomfri og rettidig diagnose kan tillate terapeutisk intervensjon for å hindre leveren forverring. Dagens behandling er suboptimal, og ingen vaksine er tilgjengelig 5,6.

Årsakene til hepatitt C ble først beskrevet i 1989 7. Studerer HCV replikering er viktig for hepatitt C vaksine og behandling forskning, men det hadde værtlenge hindret av mangelen på en effektiv viruskultur-system. En molekylær klone av HCV ble vist å være smittsomme i sjimpanser ved intrahepatisk inokulasjon 8. Deretter HCV sub-genomisk replikoner ble beskrevet, som tillot å dissekere viral genomet replikering scenen i en cellekultur system 9,10. Oppdagelsen av en genotype 2a HCV isolere JFH-1 (japansk Fulminant hepatitt-1), i stand til å infisere cellekultur åpnet nye veier for HCV-replikasjon forskning 11-13. Genotype 2a belastning JFH-en basert inter-og intra genotypiske kimære virus og genotype 1 HCV basert smittsomme kultur-systemer er også tilgjengelig 14-18.

Vi har med hell brukt JFH-en belastning og HCV intragenotype 2a kimert virus for å skaffe høy oppløsning funksjonell profilering kartet av protein domener og cis-virkende RNA elementer 19,20. Ifølge denne, her vi beskrive en effektiv kultur system rutinemessig brukt som gjør atstudere ulike stadier av HCV replikering syklus og vert-patogen interaksjon. Vi presenterer virologiske analyser for å vurdere viral genomet replikering og de ​​novo smittsomhet av intragenotype 2a HCV og en Renilla luciferase basert reporter HCV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En generell oversikt av protokollen er vist i figur 1.

En. Cells

  1. Klargjør komplett vekstmedier som inneholder 10 til 15% fetalt bovint serum (FBS), 10 mM ikke-essensielle aminosyrer, 10 mM Hepes, penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 mg / ml), og 2 mM L-glutamin.
  2. Oppretthold Huh-7.5.1-celler 13 i fullstendig vekstmedier inneholdende de ovennevnte tilskudd for in vitro analyse av hepatitt C-virus-replikasjonssyklus.
  3. Kultur virusstammer i Huh-7.5.1 celler med den angitte supplert vekstmedier ved 37 ° C med 5% CO 2.

2. Virus og plasmidkonstruksjoner

  1. Generer den komplementære DNA (cDNA) form av HCV RNA og klone den inn i en plasmidvektor for enkel genetisk manipulering. Merk: Oppdagelsen av den japanske fulminant hepatitt 1, JFH-en (genotype 2a HCV), isolat har vært avgjørende for HCV forskning og erførst og fremst brukes til å studere HCV replikering syklus 11-13. Inter-og intragenotypic kimære virus basert på JFH-1 HCV blir ofte brukt i forskning 14-18. Bygging av syntetisk intragenotype 2a kimære virus, FNX-HCV, og en monocistronic kimert reporter belastningen ble tidligere 19 og konstruksjonsdetaljer er utenfor rammen av denne protokollen beskrevet.
  2. Bruk pFNX-HCV intragenotype 2a virus som den inneholder en 5'NTR, strukturelle regioner og P7, og en del av de NS2 ikke-strukturelle regioner (nukleotider 1-2878) av J6CF foreldre belastning (NCBI tiltredelse no. AF177036), som tillegg til de ikke-strukturelle komponenter av JFH-1 viral stamme (NCBI tiltredelse no. AB047639). Merk: FNX-HCV ble syntetisert basert på rekkefølgen av JC1 intragenotype 2a kimert HCV rapportert tidligere 15.
  3. Generer et monocistronic chimerisk reporter viral konstruksjon, den pFNX-Rluc, basert på pFNX-HCV stamme (ovenfor i trinn 2.2) ved å sette inn en Renilla luciferase genet mellom 5 'NTR og kjerne-genet (mellom nt 388 og 389). Deretter kobler luciferase-genet og kjerne-genet av denne konstruksjon ved hjelp av et munn-og klovsyke-virus 2A (F2A) peptidsekvens, som ville virke som en spalting signal.
  4. Engineer RNA polymerase-null (Pol-) viral konstruere ved hjelp av enten pFNX-HCV eller pFNX-Rluc viral bakgrunn. Bytt NS5B polymerase katalytiske rester, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), av en av disse virus stamnett med AAG aminosyreresiduer.

Tre. In Vitro HCV RNA transkripsjon

  1. Bruk en intragenotype 2a kimert virus FNX-HCV og FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV for evaluering av virusreplikasjon (Figur 2A).
  2. Linear de virale plasmider med Xbal restriksjonsenzym og deretter behandle med mung bønne nuklease for å generere butte ender. Rense fordøyd plasmider ved anionbytterkromatografi. Kontroller integriteten of linearisert plasmid DNA ved å underkastet agarosegelelektroforese (Figur 2B).
  3. Transkribere de lineariserte viral plasmider ved hjelp av T7-RNA polymerase.
  4. Rense nysyntetiserte DNase-behandlet RNA ved hjelp av en RNA-rensing kit.
  5. Verifiserings RNA-produksjonen ved agarose-gel-elektroforese (fig. 2C).
  6. Kvantifisere RNA ved spektrofotometri.
  7. Oppbevar den genererte RNA i -80 ° C i 10 mikrogram arbeider mengdene. Merk: For å minimalisere variasjonen av RNA kvalitet innenfor hver eksperimentell design ved å transkribere RNA alt for hver virusprøve og kontroll til samme tid.

4. HCV RNA Transfection og Prøvetaking

  1. Høste Huh-7.5.1 celler ved hjelp av trypsin.
  2. Å skylle celler, sentrifuger og resuspender suspensjon to ganger med kaldt lavt serum media. Resuspender cellene i lavt serum materiale på 1 x 10 7 celler per ml.
  3. Bland totalt 10 & #956 g av viralt RNA transkribert med 400 pl av resuspenderte celler (4 x 10 6 celler) i en 0,4 cm kyvette electroporation. Transfektere celler via elektroporering ved 270 V, 100 Ω og 950 mF.
  4. Suspender electroporated celler i 10 ml komplett vekstmedier med 15% FBS. Merk: Økt overlevelsesevnen electroporated celler blir sett når de Huh-7.5.1 celler ble dyrket i 15% Fetal Bovine Serum.
  5. Plate cellene i både T-25 kolber (1,2 x 10 ~ 6 celler pr kolbe) og 48-brønns plater (1 x 10 4 celler pr brønn) for hvert av de følgende tidspunkter: 4, 48 og 96 timer.
  6. Bytt ut media på 4-8 timers post-transfeksjon med frisk supplert vekstmedier med 10% FBS å fjerne døde celleavfall fra de dyrkede kolber og plater.
  7. Innhøstingscellekultur-supernatanter ved 48, 96 hr tidspunkter og fjerne cellulært avfall fra innsamlede prøvene ved sentrifugering av cellene ved 1500 rpm i 10 min ved 4 º C.
  8. Lagre de cellefrie supernatanter ved -80 ° C. Lysere cellene for protein og RNA-analyse ved Western blot og revers transkripsjon-kvantitativ PCR ved de angitte tidspunkter.

5. Revers transkripsjon-kvantitativ PCR (RT-qPCR) for vurdering av HCV Genome kopier

  1. Utføre en to-trinns RT-qPCR å bestemme HCV genomisk RNA-kopitall.
  2. Omvendt transkriberer 1 pg av total cellulær RNA ved hjelp av revers transkriptase og en primer spesifikk for HCV forstand tråd som binder seg til 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') eller en primer som er spesifikke for husholdningsgenet peptidylprolyl isomerase G (R PPIG : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Også reversere transkribere FNX-HCV RNA (generert i trinn 3) over kjente genom eksemplarer (10 januar til 10 september standard) med HCV forstand tråd primer.
  3. Gjennomføre qPCR ved å bruke 50 ng av den resulterende transkribert cDNA ved hjelp av spesifikke HCV primere (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') og DNA bindende grønt fargestoff som inneholder qPCR super mix. Utfør qPCR for husholdningsgenet PPIG også (primere PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Merk: For å beregne nøyaktig intracellulær HCV RNA nivå på tvers av prøvene, bruker mobilnettet husholdningsgenet, PPIG , uttrykk nivå (Ct syklus) for normalisering. Bruk kopien nummeret til FNX-HCV genomet som standard for kopien nummer besluttsomhet.
  4. Bruk følgende forhold når du kjører qPCR å bestemme HCV RNA kopi nummer: 95 º C i 15 sek og 60   ° C i 30 sekunder (40 sykluser) ved hjelp av sanntids-PCR-system.
  5. Se figurene 3A og 3B for genomreplikasjonsresultater.

6. Western Blotting analyse for å påvise HCV Protein Expression (Figur 3C)

  1. Bruk cellelysater frOM viral RNA transfektert på 96 hr innlegg transfeksjon for protein western blotting analyse.
  2. Løs cellelysat hjelp SDS-PAGE og overføring til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran.
  3. Blokker membranen ved hjelp av et blokkeringsoppløsning inneholdende 5% skummet melk, 0,2% Tween 20 i fosfat-bufret saltvann (PBS).
  4. Inkuber membranen med primær mus monoklonalt antistoff NS3 (1 i 1 000 fortynning) og beta-aktin (1 i 5000 fortynning).
  5. Til geit-anti-mus IgG konjugert til pepperrot peroksydase (1 i 5000 fortynning) og detektere ved kjemiluminescens.

7. Immunfluorescens analysen (IFA)

  1. Løser de HCV-infiserte og transfekterte celler ved hjelp av metanol i 30 min ved -20 ° C i immunfluorescens-analyse.
  2. Vask celle med PBS tre ganger, og blokk med IFA blokkeringsbuffer.
  3. Bruk kanin polyklonale anti-NS5A primært antistoff (vennlig levert av Dr. Dasgupta, UCLA) eller monoklonalt anti-DSRNA J2 antistoff ved en fortynning på 1:200 (1 pg / ml) og inkuberes i 5 timer til over natten ved 4 º C.
  4. Vask cellene med PBS tre ganger etter at det primære antistoff.
  5. Til geite-anti-kanin IgG-488 polyklonalt antistoff eller sekundært geite-anti-mus-IgG-594 polyklonalt sekundære antistoff ved en 1:1.000 fortynning (1 pg / ml) og inkuberes i 1 time ved romtemperatur.
  6. Vask cellene med PBS tre ganger og flekk kjerner ved hjelp Hoechst fargestoff og visning bruker fluorescerende mikroskop (Figur 3D).

8. Måling virustiter

  1. Plate naive Huh-7.5.1-celler på omtrent 3 x 10 3 celler / brønn ved hjelp av en 96-brønns plate. Den neste dagen, utføre 10-ganger serie-fortynninger av cellefri kultur supernatant høstet fra HCV-RNA-transfekterte celler ved hjelp av vekstmateriale og inokuler i triplikat på Huh-7.5.1-celler.
  2. Fiks celler ved 72 timer etter infeksjon ved bruk av metanol (i 30 min ved -20
  3. Bruk den høyeste fortynning å telle for NS5A positive brennpunkter og beregne gjennomsnittlig antall fokus dannende enhet (FFU) per milliliter. Se figur 4 for HCV titer.

9. Renilla Luciferase reporter analysen for Viral Genome Replication og Smittsomhet

  1. For å evaluere viral genomet replikering, plate HCV RNA-electroporated Huh-7.5.1 celler i tre eksemplarer i 48-brønners plater (1 x 10 4 celler / brønn).
  2. Lyse av cellene med 75 pl av passiv lyseringsbuffer ved 6 timer, 48 timer og 96 timer post-transfeksjon.
  3. Skjer platene forsiktig i 15 min ved romtemperatur og oppbevares ved -80 ° C.
  4. For å måle Renilla-luciferase enzymatisk aktivitet, tine protein lysatet og Renilla luciferase assay-reagenser til romtemperatur.
  5. Tilsett 20 pl av protein lysat per brønn av en 96-AN l hvit luminescens plate og plassere platen i et luminometer.
  6. Tilsett 100 mL av Renilla luciferase assay reagens (coelenterazine substrat + buffer) per brønn, og etter en 2 sek forhånds lese forsinkelse; integrere det avgitte lys i 10 sek.
  7. Beregn gjennomsnitt og standardavvik for hver prøve fra luciferase verdier av biologiske triplicates og utsett data til statistisk analyse (figur 5).
  8. For å vurdere smittsomhet, inokuler 500 pl av cellefrie supernatant oppnådd fra HCV RNA-transfekterte celler for de angitte tidspunkt (48 timer og 96 timer) i triplikat på naive Huh-7.5.1-celler i 48-brønners plater.
  9. Sett på viruspodestoff med 500 ul friskt medium per brønn etter 6 timer etter infeksjon.
  10. Lyse av celler ved 48 timer etter infeksjon og avhengig av Renilla-luciferase assay som er beskrevet i trinn 8.2 til 8.7 (figur 5).
itle "> 10. Statistisk analyse

  1. De feilfelt i grafene viser standardavvik (SD). De P-verdier ble beregnet ved den uparede t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hepatitt C-virus er et RNA virus. Således for genetisk manipulasjon formål, har HCV genomisk cDNA blitt klonet inn i en bakteriell plasmid vektor. A T7 RNA polymerase promoter-sekvensen ble innført umiddelbart før den 5'-enden av HCV genomet. En generell oversikt over arbeidsflyt HCV analyse er presentert i figur 1.. For å generere HCV genomisk RNA med presis 3'-enden, blir HCV-genomet inneholdende plasmidet kuttet med Xbal-restriksjonsenzymet, og den genererte enkelt-trådet overheng ble avstumpet med mung bønne nuklease fordøyelse . Kvaliteten på linearisert HCV plasmid ble bestemt ved agarosegel-elektroforese (fig. 2B). De HCV-DNA ble underkastet T7 RNA polymerase formidlet in vitro transkripsjon og det resulterende RNA ga et enkelt produkt på 9,6 kilobase (figur 2C).

Vi testet vekstkinetikk av en intragenotype 2a HCV (Figur60, 3). De Huh-7.5.1-celler ble elektroporert med in vitro-transkribert RNA fra villtype (WT) og polymerase null virus. Vi evaluerte viral forstand genomet replikering av RT-qPCR. Resultatene indikerte at WT virus replikert effektivt genomet (Fig. 3A og 3B). Den villtype oppviste 1-3 log høyere nivå av genom-replikasjon i forhold til det av Pol-virus. WT virus produserer NS3 proteinet (figur 3C) som er involvert i viral protein spalting (protease-aktivitet), og genom-replikasjon (helicase-aktivitet). Også WT virus uttrykt NS5A protein som vurderes av Immunfluorescens analysen (Figur 3D). NS5A protein er en del av HCV RNA-replicase kompleks. For å visualisere virale genom replikasjon, undersøkte vi nærvær av dobbelt-trådet (ds) HCV-RNA ved bruk av et antistoff som spesifikt gjenkjenner dsRNA. I løpet av HCV genomet forsterkning, er det fornuftig tråd RNA copied til anti-sense-genomet, og dermed dobbelt-trådet RNA-mellomprodukter er til stede i den infiserte cellen cytoplasma. Den NS5A protein og dsRNA co-lokaliserer i det cellulære cytoplasma (fig. 3D) av WT transfekterte celler antyder at aktive virusreplikasjon. Tatt sammen, WT-viruset etablert aktiv replikasjon i transfekterte Huh-7.5.1 celler.

Progress in HCV forskning har vært begrenset på grunn av mangel på en mikrocellekultursystem. Oppdagelsen av JFH-en stamme av HCV, og den etterfølgende karakterisering av kimære laboratoriestammer mulig for oss å undersøke hele HCV-replikasjonssyklus i cellekultur inkludert viral inngang, RNA-translasjon, RNA-replikasjon og dannelsen av smittsomme virus-avkom. For å vurdere HCV titer og de ​​novo smittsomhet, vi vaksinert de celle-dyrkningssupernatanter høstet fra HCV RNA transfektert celler. De HCV-infeksjon ble visualisert ved å påvise HCV NS5A protein og beregnetviral titer ved å telle den smittsomme foci (figur 4). Vi vurderte isolert klynge av celler (over 2 celler) positive for NS5A som en enkelt fokus. Resultatene indikerte at WT-viruset er smittsomt og produserer over 10 fire foci dannende enheter / ml av infeksiøs partikkel.

Vi har også etablert et HCV reporter virus husing Renilla luciferase (Rluc) reporter genet (figur 5A). En reporter HCV kan benyttes for testing av stort antall mutante virus, så vel som for høyt innhold screening-analyser. Her presenterer vi vurderingen av vekst fenotyper av WT og Pol-reporter virus. Hvis det virale genom replikerer, ville luciferase-aktivitet øker overtid etter transfeksjon. De økte genom replikering nivåer kan utledes fra økt luciferase aktivitet. Derfor luciferase-aktivitet gir indirekte måling av nivået av genomreplikasjon. De lysates høstet fra WT eller Pol-viral RNA-transfekterte celler ved angitte tidspunkter ble undersøkt for luciferase-aktivitets. Ved 6 timers post-transfeksjon, både WT og Pol-virus hadde lignende luciferase-aktivitets, indikerer tilsvarende inngangsnivå transfektert RNA som var blitt oversatt (figur 5B). Men ved 48 timer og 96 timer post-transfeksjon, viste WT virus økt genomreplikasjonsnivå sammenlignet med det av Pol-virus. Også, WT virus produsert viral NS3 protein som verifisert ved Western blot-analyse (figur 5C). Deretter testet vi smittsomhet av WT og Pol-reporter virus ved inokulering av naive Huh-7.5.1-celler med den celle-frie supernatanter samlet fra 48 timers og 96-timers post-transfektert cellekulturer. Den Pol-virus hadde basisnivå luciferase-aktivitet, mens WT virus hadde 2-3 log høyere nivå av replikasjon som i Pol-reporter virus (figur 5D). Resultatene viser at vi har et robust HCV smittsomme celle Cultu re systemet.

Figur 1
Figur 1. Generell oversikt av HCV-replikasjonsanalyse-arbeidsflyt. Linearisert HCV plasmidkonstruksjonen inneholdende T7 RNA polymerase promoter (T7P) er utsatt for in vitro transkripsjon. Den renset HCV RNA genom er elektroporert inn Huh-7.5.1 celler og belagt i kolber og 48-brønns plate. Ved 4 timer, 48 timer og 96 timer post-transfeksjon, blir den cellulære RNA-og kultur-supernatanter høstet fra kolber. Cellene fra 48-brønns plate benyttes for rengjøring av protein lysatet, og er fast for Immunofluorescens-analyse. Genome kopi nummer analyse av RT-qPCR, er Western blotting og måle viral titer gjort for å vurdere HCV replikering.

1362fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figur 2. Fremstilling av HCV genomisk RNA fra in vitro-transkripsjon av konstruerte plasmid DNA'er. A) Genomisk organisering av J6CF/JFH-1 intragenotype 2a kimære virus, FNX-HCV og FNX-HCV Pol null. Den J6CF belastningen regionen (5'NTR til en del av NS2) er avbildet i mørk grå og JFH-en belastning regionen (del av NS2 til 3'NTR) vises i lys grå. NS5B polymerase katalytisk domene mutasjon (GDD til AAG) er merket med en stjerne. B) trinn er involvert i å generere linearized HCV plasmid. Gel Bildet viser de lineariserte, butte endte plasmid DNA-molekyler som er produsert av Xbal og grønne bønner nuclease fordøyelsen, klar for in vitro transkripsjon. 0,8% agarosegel ble anvendt for å løse DNA. C) Gel bilde viser den HCV genomisk RNA produsert ved in vitro-transkripsjon ved bruk av T7 RNA-polymerase-systemet. WT: vill-type; Pol-: Polymerase null; M:markør.

Figur 3
Figur 3. Vurdere vekst fenotyper av HCV konstruksjoner. A) Evaluering av genomet replikering kinetikk av vill-type (WT) og polymerase null (Pol-) virus. Genomet kopiere numre av forstand RNA tråd vurdert av RT-qPCR er presentert i søylediagram. Den virale genom kopier av Pol-virus ble redusert over tid indikerer replikering mangel fenotype. B) Relative genom replikering nivå av vill-type HCV blir sammenlignet med det av Pol-virus. C) Western blot analyse av HCV-proteinekspresjon. HCV NS3 proteinet detekteres og beta-aktin er brukt som en cellulær kontroll. D) Immunofluorescens-analyse for å undersøke viral replikasjon. Ved 96 timer etter elektroporering ble cellene festet og underkastet immunostaining for HCV NS5A protein og dobbel-strandet RNA (ds RNA), en markør for HCV RNA replikering mellomprodukter. Kjernene ble visualisert med Hoechst flekken (Scale bar 50 mikrometer). HPT:. timer etter transfeksjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4 Undersøkelse smittsomhet av villtype-HCV og måle virustiter.. A) Naive Huh-7.5.1 celler ble brukt for infeksjonsstudier. Den cellefrie supernatant oppsamlet ved 48 og 96 timer post-transfeksjon (HPT) av HCV RNA ble utsatt for ti-ganger seriefortynning og tilsatt til cellene i en 96-brønns plate i triplikat. 72 timer etter infeksjon, ble cellene fiksert og immunostained for HCV-NS5A-protein. Cellene med NS5a positiv farging (rød) er infisert med virus. For å vurdere Foci Forming Unit (FFU), ble den positive fokus på høyeste fortynning telles. Representative paneler av bilder vises (Scale bar 100 mikrometer). B) gjennomsnittsverdier og standardavvik av viral titer i FFU per milliliter er vist i grafen. Polymerase null mutant ikke produsere smittsomme partikler. WT: vill-type; Pol-:. Polymerase null Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Vurderer genomet replikering og smittsomhet av reporter HCV. A) En tegneserie av intragenotype 2a kimert reporter virus er presentert. Den Renilla-luciferase-genet er innsatt inframe mellom 5'NTR og kjerne. B) genomet replikering kinetikk av villtype og Pol-mutant reporter virus på angitte tidspunkter post-transfeksjon er vist i grafen. Protein lysater ble høstet ved 6 timer, 48 timer og 96 timers tidspunkter for måling av Renilla-luciferase enzymatisk aktivitet. Gjennomsnitt og standardavvik beregnet ut fra tre eksemplarer Renilla luciferase verdier (RIV) for hvert virus er presentert i grafen. C) Western blotting panelet viser HCV NS3 protein uttrykk. Et ikke-spesifikt antigen detekteres av NS3 primære antistoff virker som en lastkontroll. Villtype (WT) reporter virus produserer høyt nivå av NS3 proteinet. D) Analyse av virus smittsomhet. Naive Huh-7.5.1-celler ble inokulert med den cellefrie supernatant oppnådd fra transfektert kultur ved 48 timer og 96 timers tidspunkter. Renilla luciferase aktiviteter av infiserte celler ble målt ved 48 timer etter infeksjon.Gjennomsnittsverdier med standardavvik er vist i grafen. Den Pol-reporter virusinfiserte celler hadde bare bakgrunnsnivået av luciferase-aktivitet, mens WT reporter virus utviste høy smittsomhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne illustrasjon beskriver en fremgangsmåte for å analysere hepatitt C virus replikasjonssyklus. HCV er et menneskelig patogen og det foreskrevne biosikkerhet protokollen vil måtte følges nøye. Smittsomme HCV cellekultursystemer har blitt beskrevet tidligere 11-13,16,17. Det er noen viktige punkter vi implementerer når følge illustrert protokollen. For det første er det av stor betydning å ha god kvalitet av intakt full lengde viralt genomisk RNA til nedstrøms studier. Inngangs plasmid som bærer virale cDNA må lineariseres og avstumpet nøye. Den Mung-bønne-nuklease anvendes til å dempe Xbal overheng er en ikke-spesifikk nuklease og forlenget inkubasjon vil resultere i skade eller nedbrytning av 3'-enden av virusgenomet. Den nuklease må fjernes umiddelbart etter den angitte 30 min inkubasjon ved anionbytte kolonne rensing fenol-kloroform ekstraksjon eller. Gel utvinning av nuklease-behandlet DNA kan ikke anbefales somEnzymet er aktiv under gel elektroforese prosessen.

For påfølgende in vitro RNA transkripsjon trinn, generelt, vil man også ta bredspektret forholdsregler for å minimere ribonuklease (RNase) forurensning. Alle reagenser og materialer som brukes bør RNase gratis. For å generere høykvalitets genomisk RNA med minimale RNA-strengbrudd, RNA må underkastes mindre fysisk stress ved å unngå harde virvling og gjentatt pipettering under rensingen og nedstrømshåndteringstrinn. Etter fullførelse av RNA-transkripsjon, inngangs plasmid-DNA-maler må fjernes fra transkribert RNA-blanding av DNase (RNase-fri) behandling. Ufullstendig fjerning kan resultere i overføring av plasmid-DNA inn i transfekterte celler og påvirker kvantifisering av absolutt genomkopitall av replikert viral RNA. Derav bruke DNase enzym ved en konsentrasjon på 1 enhet per mikrogram DNA, og også å ha ekstra 15 min av DNase inkubering ved 37 º C kanhjelpe. De transkriberte RNA kan renses enten ved fenol-kloroform ekstraksjon eller anionbytter-kolonnen. Forsiktighet bør utvises for å unngå overføring av fenol eller andre reagenser til det rensede RNA prøven, som kan være cytotoksiske og forstyrre molekylære assays.

For electroporation formål, har det rensede RNA å bli oppløst i RNase-fri sterilt vann. Hvis RNA-pelleten er vanskelig å oppløse, oppvarming av prøven til 65 ° C i 5 min vil hjelpe. Etter transkripsjon er avsluttet, er det viktig å lagre RNA umiddelbart i 10 ug av arbeids aliquoter gjort i RNase-fritt vann ved -80 ° C. Formålet med alikvoter er å hindre gjentatt fryse / tine-mediert RNA-degradering. For konsistente eksperimentelle resultater, er det anbefalt å transkribere alle prøver og kontroller samtidig. Høy kvalitet RNA anbefales for en viral titer høyere utbytte. For transfeksjon HCV genomisk RNA, polymer og lipid basert transfeksjon agenter kan også be brukte 21,22.

Viral og vertsfaktorer i stor grad påvirke vekstkinetikk av HCV stammer. Derivater menneskelig hepatomcellelinje (Huh-7) Huh-7.5, Huh-7.5.1 og Huh7-Lunet cellelinjer blir ofte brukt for å vurdere viral vekst 11-13,15. Toppen viral produksjon av JFH-1-stamme i Huh7-celler er Lunet på 3-4 dager post-transfeksjon, mens i Huh-7.5.1-celler er det etter 21 dager post-transfeksjon 13,15. Den intragenotype 2a kimære virus FNX-HCV å ha ikke-strukturelle gener fra JFH-en belastning har peak titer på fire dager etter transfeksjon i Huh-7.5.1 celler 19,20. For virusproduksjon fra in vitro-transkriberte RNA, er tidlig passasje human hepatom-cellelinje foretrukket. Virusproduksjonen er betydelig redusert ved bruk Huh-7.5.1 celler over passasjen nummer 20. Å sikre økt celleoverlevelsesevne etter elektroporering, tinte Huh-7.5.1 celler tillates en to ukers periode før gjennomføring av forsøk og maintained i 12% -15% FBS. Sammen med dette kriterium, resuspendering av cellene i vekstmedia inneholdende 15% FBS umiddelbart etter elektroporering øker celleoverlevelse som åpner for bedre virusproduksjonen. Etter den første 8 timers tidspunkt ble cellene deretter byttet til media inneholdende 10% FBS. For å minimere bære over celle-debris, blir viruskultur supernatant underkastet sentrifugering og filtrering gjennom fire mikron filter. De ukonsentrerte eller konsentrerte virale supernatantene alikvoteres og lagres i -80 ° C for videre in vitro og in vivo eksperimenter. Disse forholdsreglene og forslag kan hjelpe forskere for vellykket utfører analyse av HCV replikering syklus.

En annen variant av reporter HCV som havner en markør genet som fluorescerende protein og en utskilt form av Gaussia luciferase (Gluc) er beskrevet for HCV forskning 18,23,24. For forskere som fokuserer på å undersøke HCVgenomet replikering, er HCV sub-genomisk replicon (mangler gener kjernen til NS2) et verdifullt verktøy 9,10. HCV Replikoner er ikke-smittsomme, og dermed krever mindre bio-sikkerhetsforskrifter og enklere å jobbe med i forhold til smittsomme cellekultur HCV og kliniske isolater. HCV NS5B polymerase mangelfull i aktivitet er en kritisk kontroll for å studere HCV-replikasjonssyklus 11,12. HCV mangler kappeglykoproteiner (deltaet E1E2), eller p7-NS2 aktivitet kan være nyttige kontroller for studier med HCV oppføring, virion morfogenese og egress 12,19,25-27.

Angående begrensninger, for tiden den smittsomme cellekultur systemet er bare tilgjengelig for HCV genotyper en og to. Autentisk virusstammer tilhører genotyper 3 til 6 som er i stand til å vokse effektivt i cellekultur ennå ikke identifisert. Intergenotypic rekombinante virus er nyttige alternativer for å studere replikering syklus av ulike genotyper. Replikering kompetent kimert virus harboring kjernen til NS2 regionen fra genotype 1 til 7, og resten av sekvensen fra JFH-genotype 1 2a-genomet er beskrevet 15,18. En annen begrensning er at det virale utbyttet av JFH-1 og dens avledede kimære stammer er i området fra 10 mars-10 juni per ml, noe som er forholdsvis lav sammenlignet med andre RNA-virus slik som polio-og influensa. HCV stamme med robust vekst må utvikles. Future undersøkelser omfatter bruk av reporteren HCV for high-throughput screening av bibliotek for å identifisere potente antivirale midler og fokus på utvikling av vaksine-kandidater til å forebygge hepatitt C-infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

Tags

Infectious Diseases utgave 88 Hepatitt C-virus hepatitt C Tumor-virus hepatitt C Skrumplever leverkreft leverkreft
En protokoll for Analysere Hepatitt C-virus Replication
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, S., Contreras, D.,… More

Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter