Ett protokoll för Analysera hepatit C-virus replikering

Abstract

Hepatit C-virus (HCV) drabbar 3% av världens befolkning och orsakar allvarliga leversjukdomar, inklusive kronisk hepatit, cirros och levercancer. HCV är ett höljebärande RNA-virus som tillhör familjen Flaviviridae. Nuvarande behandling är inte helt effektivt och orsakar negativa biverkningar. Det finns ingen HCV-vaccin tillgängligt. Således fortsätter ansträngning som krävs för att utveckla ett vaccin och bättre behandling. En HCV cellodlingssystem är avgörande för att studera olika stadier av HCV-tillväxt inklusive viralt inträde, genom replikering, förpackning och avstigning. I det nuvarande förfarandet som presenteras, använde vi en vildtyp intragenotype 2a chimära virus, FNX-HCV, och ett rekombinant FNX-Rluc viruset bär en Renilla luciferasrapportörgen att studera virusreplikationen. En human hepatom-cellinje (Huh-7 baserad) användes för transfektion av in vitro transkriberad HCV-genomiska RNA. Cellfria kultursupernatanter, proteinlysat och totalt RNA skördades vid olika tidpunkter efter transfektion för att bedöma HCV tillväxt. HCV-genomet replikering status undersöktes genom kvantitativ RT-PCR och visualisera närvaron av HCV dubbelsträngat RNA. HCV-proteinuttryck verifierades genom Western blot och immunfluorescensanalyser med hjälp av antikroppar som är specifika för HCV NS3 och NS5A proteiner. HCV RNA-transfekterade celler frigjorda infektiösa partiklar i odlingssupernatanten och den virala titern mättes. Luciferas-analyser användes för att bedöma replikeringsnivå och infektiviteten av reporter HCV. Sammanfattningsvis presenterar vi flera virologiska analyser för att karaktärisera olika stadier av HCV-replikationscykeln.

Introduction

Hepatit C-virus (HCV) orsakar skrumplever och levercancer. Det drabbar 170 miljoner människor över hela världen med 350.000 personer dör årligen ^1-3. HCV är ett positiv sträng-RNA-virus med en genomstorlek av 9,6 kb. HCV-genomet översätts som en enda polyprotein med ~ 3000 aminosyrarester som proteolytiskt klyvs av olika cellulära och virala proteaser till 10 polypeptider. HCV är prototypen virus i släktet Hepacivirus och tillhör familjen Flaviviridae ^4. Vid exponering, etablerar HCV kronisk infektion i 80% av individerna. Infektionen är oftast asymtomatiska och snabb diagnos kan tillåta terapeutisk intervention för att förhindra leverförsämring. Nuvarande behandling är suboptimal och inget vaccin finns tillgängligt ^5,6.

Etiologin av hepatit C beskrevs första gången 1989 ^7. Studera HCV-replikering är viktigt för hepatit C-vaccin och behandlingsforskning, men det hade varitlänge hindras av bristen på ett effektivt virusodling systemet. En molekylär klon av HCV visade sig vara smittsam i schimpanser vid intrahepatisk ympning ^8. Därefter tillsattes HCV sub-genomiska replikoner beskrivits, som tillät att dissekera det virala genomet replikering steg i ett cellkultursystem ^9,10. Upptäckt av en genotyp 2a HCV isolat JFH-1 (japansk fulminant hepatit-1), kan infektera cellodling öppnat nya vägar för HCV-replikering forskning ^11-13. Genotyp 2a stam JFH-1 baserade inter-och intra-genotypiska chimära virus och genotyp 1 HCV-baserade smittkultursystem finns också ^14-18.

Vi har med framgång använt JFH-1-stammen och HCV intragenotype 2a chimärt virus för att erhålla hög upplösning funktionell profilering karta över proteindomäner och cis-verkande RNA-element ^19,20. Enligt denna, här beskriver vi ett effektivt odlingssystem som rutinmässigt används som tillåterstudera olika stadier av HCV-replikationscykeln och värdpatogen interaktion. Vi presenterar virologiska tester för att bedöma virusgenom replikering och de novo smittsamheten intragenotype 2a HCV och en Renilla luciferas baserad reporter HCV.

Protocol

En allmän beskrivning av protokollet illustreras i figur 1.

1. Celler

1. Förbered komplett tillväxtmedium som innehåller 10 till 15% fetalt bovint serum (FBS), 10 mM icke-essentiella aminosyror, 10 mM Hepes, penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 mg / ml), och 2 mM L-glutamin.
2. Behåll Huh-7.5.1-celler ¹³ i kompletta tillväxtmedier som innehåller ovanstående tillskott för in vitro-analys av hepatit C-virusreplikationscykeln.
3. Kultur virusstammar i Huh-7.5.1 celler med den angivna komplettetillväxtmedier vid 37 ° C med 5% _CO2.

2. Virus och plasmidkonstruktioner

1. Generera den komplementära DNA (cDNA)-formen av HCV RNA och klona den i en plasmidvektor för att underlätta genetisk manipulation. OBS: Upptäckten av den japanska fulminant hepatit 1, JFH-1 (genotyp 2a HCV), har isolat varit avgörande för HCV forskning och äri första hand används för att studera den HCV-replikationscykeln ^11-13. Inter-och intragenotypic chimära virus baserade på JFH-1 HCV används ofta i forskning ^14-18. Konstruktion av syntetiskt intragenotype 2a chimära virus, FNX-HCV, och en monocistroniska chimär reporter stam beskrivits tidigare ¹⁹ och konstruktionsdetaljer är utanför ramen för detta protokoll.
2. Använd pFNX-HCV intragenotype 2a viruset eftersom den innehåller en 5'NTR, strukturella regioner och p7, och en del av NS2 icke-strukturregioner (nukleotiderna 1-2878) hos J6CF moderstammen (NCBI accessionsnummer. AF177036), i dess samt de icke-strukturella komponenter i JFH-1 virusstam (NCBI anslutning nr. AB047639). OBS: FNX-HCV syntetiserades baserat på sekvensen av JC1 intragenotype 2a chimär HCV rapporterade tidigare ^15.
3. Generera en monocistroniska chimär reporter virala konstrukt, det pFNX-Rluc, baserat på den pFNX-HCV-stammen (ovan i steg 2,2) genom att infoga ett Renilla luciferasgenen mellan 5 'NTR och kärngenen (mellan nukleotiderna 388 och 389). Därefter ansluter luciferasgenen och kärngenen av denna konstruktion med hjälp av en mul-och klövsjukevirus 2A (F2A) peptidsekvens, som skulle fungera som en klyvning signal.
4. Ingenjör med RNA-polymeras-null (Pol-) virus konstruktion med antingen pFNX-HCV eller pFNX-Rluc viral bakgrund. Byt ut NS5B polymeras katalytiska rester, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), i någon av dessa virus stamnät med AAG aminosyror.

3. In vitro HCV RNA Transkription

1. Använd en intragenotype 2a chimära virus FNX-HCV och FNX-HCV-Pol null (Pol-) HCV för utvärdering av virusreplikation (Figur 2A).
2. Linjärisera de virala plasmider med Xbal-restriktionsenzym och därefter behandla med mungböna-nukleas för att generera trubbiga ändar. Rena de uppdelade plasmider genom anjonbyteskromatografi. Verifiera integriteten of den linjeariserade plasmiden genom att utsätta DNA för elektrofores på agarosgel (Figur 2B).
3. Transkribera den linjäriserade virala plasmider med användning av T7-RNA-polymeras.
4. Rena nyligen syntetiserade DNas behandlade RNA med hjälp av en RNA-reningssats.
5. Verifiera RNA-produktion genom agarosgelelektrofores (figur 2C).
6. Kvantifiera RNA genom spektrofotometri.
7. Förvara den genererade RNA i -80 ° C i 10 | j, g arbetar alikvoter. OBS: För att minimera variation av RNA kvalitet inom varje experimentell design genom att transkribera alla RNA för varje virusprov och kontroll samtidigt.

4. HCV RNA-transfektion och Provtagning

1. Skörda Huh-7.5.1-celler med hjälp av trypsin.
2. För att skölja celler, centrifugera och suspendera suspension två gånger med kall låg serummedier. Resuspendera cellerna i lågt serum media vid 1 x 10 ⁷ celler per ml.
3. Blanda totalt 10 & #956, g transkriberas viralt RNA med 400 l av resuspenderade celler (4 x 10 ⁶ celler) i en 0,4-cm elektroporation kyvett. Transfektera cellerna via elektroporering vid 270 V, 100 Ω, och 950 uF.
4. Resuspendera elektroporerade cellerna i 10 ml komplett tillväxt media med 15% FBS. Notera: Ökade överlevnadsförmågan för elektroporerade celler ses då Huh-7.5.1-celler odlades i 15% fetalt bovint serum.
5. Plate cellerna i både T-25-kolvar (~ 1,2 x 10 ⁶ celler per kolv) och 48-brunnsplattor (1 x 10 ⁴ celler per brunn) för var och en av följande tidpunkter: 4, 48 och 96 timmar.
6. Byt medium vid 4-8 h efter transfektion med färskt kompletterat tillväxtmedium med 10% FBS för att avlägsna döda cellrester från de odlade kolvar och plattor.
7. Harvest cellodlingssupernatanter vid 48, 96 h tidpunkterna och avlägsna cellrester från insamlade proven genom centrifugering av cellerna vid 1500 rpm under 10 min vid 4 º C.
8. Förvara de cellfria supernatanterna vid -80 ° C. Lysera cellerna för protein-och RNA-analys med Western blot och omvänd transkription-kvantitativ PCR vid de angivna tidpunkterna.

5. Omvänd transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) för bedömning av HCV Genome kopior

1. Utför en två-stegs RT-qPCR att bestämma HCV-genomiska RNA-kopietal.
2. Omvänt transkribera ett ug av totalt cellulärt RNA med användning av omvänt transkriptas och en primer som är specifik för HCV senssträngen som binder till 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') eller en primer som är specifik för housekeeping-genen peptidylprolyl isomeras G (PPIG R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Vända även transkribera FNX-HCV-RNA (som genereras i steg 3) av kända genomkopior ^{(1 oktober - 9 OKTOBER} standard) med HCV-sense-strängen primer.
3. Utför qPCR med 50 ng av den resulte transkriberade cDNA med hjälp av specifika HCV primers (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') och DNA-bindande grönt färgämne innehållande qPCR super mix. Utför qPCR för städning gen PPIG samt (primers PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Anmärkning: För att beräkna exakt intracellulär HCV RNA-nivå över prov, använder cellulära städning gen, PPIG , uttrycksnivå (Ct cykel) för normalisering. Använd kopietalet av FNX-HCV-genomet som standard för kopietalet bestämning.
4. Använd följande villkor när du kör qPCR att bestämma HCV RNA antal kopior: 95 º C i 15 sekunder och 60   º C i 30 sek (40 cykler) med hjälp av realtids-PCR-system.
5. Se figurerna 3A och 3B för genomreplikation resultat.

6. Western Blotting Analys för Detektion HCV Protein Expression (Figur 3C)

1. Använd cellysat frOMs viralt RNA transfekterades vid 96 h efter transfektion för protein western blotting-analys.
2. Lös cellysatet med användning av SDS-PAGE och överföring till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran.
3. Blockera membranet med användning av en blockeringslösning innehållande 5% skummjölk, 0,2% Tween 20 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
4. Inkubera membranet med primär monoklonal antikropp NS3 (1 av 1000 utspädning) och beta-aktin (1 i 5.000 utspädning).
5. Lägg get-anti-mus-IgG konjugerat till pepparrotsperoxidas (1 i 5000 utspädning) och detektera genom kemiluminescens.

7. Immunofluorescensanalys (IFA)

1. Fäst HCV-infekterade och transfekterade celler med hjälp av metanol i 30 min vid -20 ° C för immunfluorescensanalys.
2. Tvätta cellen med PBS tre gånger och blockera med IFA blockerande buffert.
3. Använd kanin polyklonal anti-NS5A primärt antikropp (vänligen tillhandahållen av Dr Dasgupta, UCLA) eller mus-monoklonal anti-DSRNA antikropp J2 vid en utspädning av 1:200 (1 | ig / ml) och inkubera under 5 h till över natten vid 4 º C.
4. Tvätta cellerna med PBS tre gånger efter den primära antikroppen.
5. Lägg get-anti-kanin-IgG-488 polyklonal sekundär antikropp eller get-anti-mus-IgG-594 polyklonal sekundär antikropp vid en 1:1000 spädning (1 pg / ml) och inkubera under 1 timme vid rumstemperatur.
6. Tvätta cellerna med PBS tre gånger och fläck kärnor använder Hoechst färgämne och utsikt med fluorescerande mikroskop (Figur 3D).

8. Mätning Virustiter

1. Tallrik naiva Huh-7.5.1-celler vid ungefär 3 x 10 ³ celler / brunn med hjälp av en 96-brunnsplatta. Nästa dag, utför 10-faldiga serieutspädningar av cellfri odlingssupernatant skördades från HCV-RNA-transfekterade celler med användning av tillväxtmedium och ympa i triplikat på Huh-7.5.1-celler.
2. Fix-celler vid 72 h efter infektion med användning av metanol (för 30 minuter vid -20
3. Använd den högsta utspädning att räkna för NS5A positiva fokus och beräkna det genomsnittliga antalet fokusbildande enhet (FFU) per ml. Se figur 4 för HCV titer.

9. Renilla Luciferase Reporter analys för Viral Genome replikering och Smitt

1. För utvärdering av virusgenom replikering, tallrik HCV RNA-electroporated Huh-7.5.1-celler i tre exemplar i 48-hålsplattor (1 x 10 ⁴ celler / brunn).
2. Lysera cellerna med 75 | il av passiv lysbuffert vid 6 h, 48 h och 96 h efter transfektion.
3. Vagga plattorna försiktigt under 15 min vid rumstemperatur och förvara vid -80 ° C.
4. För mätning av Renilla-luciferas-enzymatisk aktivitet, tina proteinet lysat och Renilla luciferas-analysreagens till rumstemperatur.
5. Addera 20 pl av protein-lysat per brunn i en 96-wel l vit luminiscens tallrik och placera plattan i en luminometer.
6. Fördela 100 pl Renilla luciferas analysreagens (coelenterazine substrat + buffert) per brunn och efter 2 sekunder i förväg läsa fördröjning; integrera det emitterade ljuset för 10 sek.
7. Beräkna medelvärde och standardavvikelse för varje prov från luciferas värden för biologiska tripletter och utsätta data till statistisk analys (Figur 5).
8. För bedömning av smittsamhet, ympa 500 | il av cellfria supernatanten erhållen från HCV-RNA-transfekterade celler för de angivna tidpunkter (48 h och 96 h) i tre exemplar på naiva Huh-7.5.1-celler i 48-brunnsplattor.
9. Ersätt det virala inokulum med 500 | il färskt medium per brunn efter 6 h efter infektion.
10. Lyse cellerna vid 48 timmar efter infektion och på Renilla luciferas-analysen som beskrivs i steg 8,2 till 8,7 (Figur 5).

BETECKNING "> 10. Statistisk analys

1. De felstaplar i diagrammen visar standardavvikelser (SD). De P-värdena beräknades genom det oparade t-test.

Representative Results

Hepatit C-virus är ett RNA-virus. Sålunda för genetisk manipulering ändamål har HCV genomisk cDNA klonats in i en bakteriell plasmid-vektor. En T7 RNA-polymeraspromotorsekvens infördes omedelbart före 5'-änden av HCV-genomet. En allmän beskrivning av HCV-analys arbetsflöde visas i Figur 1. För att generera HCV iskt RNA med exakt 3 'änden är HCV-genomet innehållande plasmiden skära med Xbal restriktionsenzym och den genererade enkelsträngat hänget gjordes trubbigt med mungbönnukleas matsmältning . Kvaliteten på lineariserad HCV plasmiden bedömdes genom agarosgelelektroföres (figur 2B). HCV-DNA utsattes för T7 RNA-polymeras-medierad transkription in vitro och det resulterande RNA gav en enda produkt på 9,6 kilobas (figur 2C).

Vi testade tillväxt kinetik en intragenotype 2a HCV (Figur60, 3). De Huh-7.5.1-celler elektro med in vitro transkriberade RNA av vildtyp (WT) och polymeras null virus. Vi utvärderade den virala mening genomet replikering av RT-qPCR. Resultaten visade att WT-virus replikeras genomet effektivt (fig. 3A och 3B). Den vildtyp uppvisade 1-3 log högre nivå av genomreplikation jämfört med den för Pol-viruset. WT-virus producerar NS3-protein (figur 3C) som är involverad i virusprotein klyvning (proteasaktivitet) och genomreplikation (helikas-aktivitet). Även WT-virus uttryckt NS5A protein som bedöms av immunofluorescens analys (Figur 3D). NS5A-proteinet är en del av HCV-RNA-replikaskomplexet. Att visualisera viralt genom replikation, undersökte vi närvaron av dubbelsträngade (ds) HCV-RNA med användning av en antikropp som specifikt känner igen dsRNA. Under HCV-genom förstärkning, är senssträngen RNA-copied till anti-sense-genomet, vilket de dubbelsträngade RNA-mellanprodukter är närvarande i den infekterade cellens cytoplasma. Den NS5A protein och dsRNA co-lokaliserar i den cellulära cytoplasman (Figur 3D) i WT transfekterade celler tyder på aktiv virusreplikation. Sammantaget etablerade WT-virus aktivt replikering i transfekterade Huh-7.5.1-celler.

Framsteg i HCV forskning hade varit begränsad på grund av bristen på en infektiös cellkultursystem. Upptäckten av JFH-1-stammen av HCV och den efterföljande karakteriseringen av chimära laboratoriestammar tillät oss att undersöka hela HCV-replikationscykeln i cellkultur innefattande viralt inträde, RNA-translation, RNA-replikation och bildning av infektiös virusavkomma. För att bedöma HCV-titer och de novo-smittsamhet, ympade vi de cell-odlingssupematanter skördade från HCV RNA-transfekterade celler. Den HCV-infektion visualiserades genom att detektera HCV NS5A-proteinet och beräknasvirustiter genom räkning av det infektiösa foci (figur 4). Vi ansåg isolerade kluster av celler (över 2 celler) positiva för NS5A som ett enda fokus. Resultaten visade att WT-viruset är smittsam och producerar över 10 ⁴ härdar bildar enheter / ml infektiös partikel.

Vi har också etablerat en HCV-reporter virus hyser Renilla luciferas (Rluc) reportergenen (Figur 5A). En reporter HCV kan användas för att testa ett stort antal muterade virusen såväl som för hög-innehåll screeningsanalyser. Här presenterar vi en bedömning av tillväxt fenotyper av WT och Pol-reporter virus. Om det virala genomet replikeras, skulle luciferasaktiviteten öka övertid efter transfektion. De ökade genomreplikation nivåer kan härledas från ökad luciferasaktivitet. Följaktligen tillhandahåller luciferasaktiviteten indirekt mätning av nivån av genomreplikation. Lysaten skördats från WT eller Pol-viral RNA transfekterade celler vid angivna tidpunkter testades för luciferasaktiviteter. Vid 6 h efter transfektion, både WT och Pol-virus hade liknande luciferasaktiviteter, vilket tyder på liknande ingångsnivån hos transfekterade RNA som hade översatts (Figur 5B). Emellertid vid 48 h och 96 h efter transfektion, uppvisade WT-virus ökade genomreplikation nivåer jämfört med den för Pol-viruset. Också, WT-virus producerade viral NS3-protein som kontrolleras av Western blotting-analys (figur 5C). Därefter testade vi infektiviteten av WT och Pol-reporter-virus genom att ympa naiva Huh-7.5.1-celler med de cellfria supematantema uppsamlade från 48 h och 96 h efter-transfekterade cellkulturer. Pol-viruset hade bas-nivå luciferasaktivitet, medan WT-viruset hade 2-3 log högre replikering till det av Pol-reporter virus (Figur 5D). Resultaten visar att vi har en robust HCV smittsam cell kultu re systemet.

Figur 1. Allmän beskrivning av HCV-replikationsanalys arbetsflöde. Linjäriserad HCV plasmid konstruktion som innehåller T7-RNA-polymeraspromotor (T7P) utsätts för in vitro transkription. Den renade HCV-RNA-genomet är electroporated in Huh-7.5.1-celler och plattströks i kolvar och 48-brunnar. Vid 4 h, 48 h och 96 h efter transfektion, är den cellulära RNA och odlingssupernatanterna skördades från kolvar. Cellerna från 48-brunnars platta används för att skörda proteinet lysat och fastställs för immunfluorescensanalys. Genom antal kopior analys av RT-qPCR, är Western blotting och mäta viral titer göras för att bedöma HCV-replikering.

1362fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figur 2. Framställning av HCV-genomiska RNA-molekyler genom transkription in vitro av konstruerade plasmid-DNA. A) Genomisk organisation av J6CF/JFH-1 intragenotype 2a chimära virus, FNX-HCV och FNX-HCV-Pol null. Den J6CF stam-regionen (5'NTR till en del av NS2) visas i mörkgrått och JFH-1-stam-regionen (en del av NS2 till 3'NTR) visas i ljusgrått. NS5B polymeras katalytisk domän mutation (GDD till AAG) indikeras med en asterisk. B) Stegen i generera linjäriserade HCV plasmid. Gel Bilden visar de linjäriserade, trubbiga ändar plasmid-DNA produceras av Xbal och mungbönnukleas matsmältning, redo för in vitro transkription. 0,8% agarosgel användes för att lösa DNA. C) Gel bilden visar HCV-genomiska RNA produceras genom transkription in vitro med användning av T7-RNA-polymeras-systemet. WT: vildtyp; Pol-: Polymerase null; M:markör.

Figur 3. Bedöma tillväxt fenotyper av HCV-konstruktioner. A) Utvärdera genomet replikering kinetik vildtyp (WT) och polymeras null (Pol-) virus. Genomet kopieantal av sens-RNA-strängen bedömas genom RT-qPCR presenteras i stapeldiagrammet. De virala genomet kopior av Pol-virus minskat under den tidsperiod som anger replikerings bristfällig fenotyp. B) Relativ genomet replikering nivån vildtyp HCV jämförs med den för Pol-virus. C) Western blot-analys av HCV-proteinuttryck. HCV-protein NS3 detekteras och beta-aktin användes som en cellulär kontroll. D) immunfluorescensanalys för att undersöka viral replikation. Vid 96 h efter elektroporering fixerades cellerna och utsattes för immunostaining för HCV NS5A-protein och dubbelsträngat RNA (ds RNA), en markör för HCV RNA-replikationsmellanprodukter. Kärnorna visualiserades med Hoechst färgämne (Scale bar 50 ^ m). HPT:. timmar efter transfektion Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Undersöka infektiviteten av vildtyp HCV och mätning av virustiter. A) Naiv Huh-7.5.1-celler användes för infektionsstudier. Den cellfria supernatanten uppsamlades vid 48 och 96 h efter transfektion (HPT) av HCV-RNA utsattes för 10-faldig seriespädning och tillsattes till cellerna i en platta med 96 brunnar i triplikat. 72 h efter infektion, fixerades cellerna och immunfärgades för HCV NS5A-proteinet. Cellerna med NS5A positiv färgning (röd) är infekterade med virus. För bedömning Foci Forming Unit (FFU), var den positiva fokus på högsta utspädning räknas. Representativa paneler av bilder ska visas (Scale bar 100 | im). B) Medelvärden och standardavvikelser för virustiter i FFU per milliliter visas i grafen. Den polymeras null mutant producerade inte infektiösa partiklar. WT: vildtyp; Pol-:. Polymerase null Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Utvärdera genomet replikering och smittsamhet av reporter HCV. A) En tecknad av intragenotype 2a chimär reporter virus presenteras. Den Renilla luciferasgen är insatt inframe mellan 5'NTR och kärna. B) genomet replikerings kinetiken för vildtyp och Pol-mutanta reporter virus vid indikerade tidpunkter efter transfektion visas i grafen. Protein lysat skördades vid 6 h, 48 h och 96 h tidpunkterna för mätning av Renilla-luciferas-enzymatisk aktivitet. Medelvärdet och standardavvikelsen beräknad utifrån trippel Renilla luciferas värden (RLV) för varje virus presenteras i diagrammet. C) Western blotting panelen visar HCV NS3-proteinuttryck. En icke-specifik antigen detekteras av NS3 primär antikropp fungerar som en laddningskontroll. Vildtyp (WT) reporter virus producerar hög nivå av NS3-proteinet. D) Analys av virusinfektivitet. Naiva Huh-7.5.1-celler inokulerades med den cellfria supernatanten erhållen från transfekterade kulturen vid 48 h och 96 h tidpunkterna. Renilla luciferas aktiviteter infekterade celler mättes vid 48 h efter infektion.Medelvärden med standardavvikelse visas i grafen. Pol-reporter virusinfekterade celler hade bara bakgrundsnivån luciferasaktivitet, medan WT reporter virus uppvisade hög smittsamhet.

Discussion

Denna illustration beskriver en metod för analys av hepatit C-virus-replikationscykeln. HCV är en mänsklig patogen och föreskrivna protokoll om biosäkerhet måste följas strikt. Smitt HCV cellodlingssystem har beskrivits tidigare ^11-13,16,17. Det finns några viktiga punkter som vi genomför när man följer den illustrerade protokoll. För det första är det av stor vikt att ha god kvalitet på intakt fullängds viral iskt RNA för efterföljande studier. Ingångs plasmid som bär den virala cDNA måste linjäriseras och trubbiga noggrant. Den mung-bean-nukleas användes för att hämma den Xbal-överhäng är ett icke-specifikt nukleas och förlängd inkubation kommer att resultera i skada eller nedbrytning av 3'-änden av virusgenomet. Den nukleas måste avlägsnas omedelbart efter det specificerade 30 min inkubation genom fenol-kloroform-extraktion eller anjonbytarkolonn rening. Gel utvinning av nukleas behandlade DNA kan inte rekommenderas somEnzymet är aktivt under gelelektrofores processen.

För senare i RNA transkription vitro steg, i allmänhet, man kommer också att ta bredspektrum försiktighetsåtgärder för att minimera ribonukleas (RNas) föroreningar. Alla reagens och material som används bör RNas fritt. För att generera hög kvalitet genom-RNA med minimal RNA-strängbrott, RNA behöva utsättas för mindre fysisk stress genom att undvika hårda skakning och upprepad pipettering under reningen och efterföljande hanteringssteg. Efter slutförandet av RNA-transkription, de inmatade plasmid-DNA-mallar måste avlägsnas från transkriberad RNA-blandning av DNas (RNas-fri) behandling. Ofullständig borttagning kan leda till överföring av plasmid-DNA i transfekterade celler och påverka kvantifiering av absoluta genomet kopior antal replikerad viralt RNA. Hence använda DNas enzymet vid en koncentration av en enhet per mikrogram DNA och även ha extra 15 min av DNas inkubation vid 37 º C kanhjälp. Den transkriberade RNA kan renas genom antingen fenol-kloroform-extraktion eller anjonbyteskolonn. Försiktighet bör iakttas för att undvika överföring av fenol eller andra reagenser till det renade RNA-prov, vilket kan vara cytotoxiska och störa molekylära analyser.

För elektroporation ändamål, har det renade RNA för att lösas i RNas-fritt sterilt vatten. Om RNA-pelleten är svår att lösa upp, upphettning av provet till 65 ° C under 5 minuter kommer att hjälpa. Så snart transkriptionen har slutförts, är det viktigt att lagra RNA omedelbart i 10 | j, g av arbets alikvoter gjordes i RNas-fritt vatten vid -80 ° C. Syftet med alikvoter är att förhindra upprepad frysning / tining medierad RNA-nedbrytning. För konsekventa experimentella resultat, rekommenderas att transkribera alla prover och kontroller samtidigt. Högkvalitets RNA rekommenderas för en högre virustiter utbyte. För transfektion av HCV-genom-RNA, polymer-och lipid baserad transfektionsmedel kan också be används ^21,22.

Viral och värdfaktorer påverkar kraftigt tillväxt kinetik HCV-stammar. Humant hepatom cellinje (Huh-7)-derivat Huh-7,5, Huh-7.5.1 och Huh7-LUNET cellinjer är vanligen används för utvärdering av virustillväxt ^11-13,15. Toppens viral produktion av JFH-1-stam i Huh7-LUNET celler är vid 3-4 dagar efter transfektion, medan det i Huh-7.5.1 celler är det vid 21 dagar efter transfektion ^13,15. Den intragenotype 2a chimärt virus FNX-HCV med icke-strukturella gener från JFH-1-stam har peak titer vid 4 dagar efter transfektion i Huh-7.5.1 celler ^19,20. För virusproduktion från in vitro-transkriberat RNA, tidig passage humana hepatomcellinjen föredragna. Viral produktionen minskar avsevärt när du använder Huh-7.5.1 celler över passagenummer 20. För att säkerställa ökad cellöverlevnadsförmåga efter elektroporation, tinade Huh-7.5.1-celler får en två veckors återhämtningsperiod innan de utför ett experiment och maintained i 12% -15% FBS. Tillsammans med detta kriterium, ökar återsuspension av cellerna i tillväxtmedium innehållande 15% FBS omedelbart efter elektroporering av cellöverlevnad möjliggör bättre viral produktion. Efter att den första 8 tim tidpunkt cellerna sedan om till media innehållande 10% FBS. För att minimera Rest cellulärt skräp, är den virala kultursupernatanten utsattes för centrifugering och filtrering genom 4 mikron filter. De okoncentrerade eller koncentrerade virala supernatanterna alikvoter och lagras i -80 º C för ytterligare in vitro-och in vivo-experiment. Varningarna och förslag kan hjälpa forskare för att framgångsrikt genomföra en analys av HCV-replikationscykeln.

En annan variant av reporter HCV som hyser en markörgen såsom fluorescerande protein och en utsöndrad form av Gaussia luciferas (Gluc) beskrivs för HCV forskning ^18,23,24. För forskare med fokus på att undersöka HCVgenomet replikering är HCV sub-genomisk replikonen (saknar gener kärnan till NS2) ett värdefullt verktyg ^9,10. HCV replikoner är icke-smittsamma, vilket kräver färre regler för biosäkerhet och lättare att arbeta med jämfört med den smittcellodlings HCV och kliniska isolat. HCV saknar NS5B polymerasaktivitet är en viktig kontroll för att studera HCV-replikationscykeln ^11,12. HCV saknar höljesglykoproteiner (delta E1E2), eller p7-NS2 aktivitet kan vara användbara kontroller för studier med HCV-post, virus morfogenes och avstigning ^12,19,25-27.

När det gäller begränsningar, den smittcellodlingssystem är för närvarande endast tillgänglig för HCV genotyp 1 och 2. Autentiska virusstammar tillhör genotyper 3 till 6 som kan växa effektivt i cellkultur ännu inte identifierats. Intergenotypic rekombinanta virus är användbara alternativ för att studera replikationscykeln för olika genotyper. Replikationskompetent chimärt virus harboring kärnan till NS2-regionen från genotyperna 1 till 7, och resten av sekvensen från JFH-1-genotyp 2a genomet beskrevs ^15,18. En annan begränsning är att det virala utbytet av JFH-1 och dess härledda chimära stammar är i intervallet från ^{10 Mars-10} JUNI per ml, som är relativt låg jämfört med den för andra RNA-virus såsom polio och influensa. HCV-stam med stark tillväxt behöver utvecklas. Framtida utredning innefattar användning av reportern HCV för high-throughput bibliotek screening för att identifiera potenta antivirala och fokusera på att utveckla vaccinkandidater för att förhindra HCV-infektion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Non essential amino acid	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mung Bean Nuclease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF membrane package	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]	Abcam	ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 real-time PCR system	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System kit	Promega	E2810
RNase-Free DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)	Promega