Summary
Aquí se demuestra el uso de colorante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localización en la superficie del receptor y endocitosis en las neuronas del hipocampo. A través del uso de construcciones que tienen una etiqueta extracelular corta que se une α-bungarotoxina, análisis de membrana de tráfico endocítica de proteínas de plasma se puede lograr.
Abstract
Cada vez es más evidente que los receptores de neurotransmisores, entre ellos los receptores ionotrópicos GABAA (GABAAR), exhibición tráfico altamente dinámico y la movilidad de la superficie celular 1-7. Para estudiar receptor de células localización en la superficie y la endocitosis, la técnica descrita aquí combina el uso de fluorescente α-bungarotoxina con células que expresan construcciones que contienen un-bungarotoxina α (Bgt) sitio de unión (BBS). El BBS (WRYYESSLEPYPD) se basa en la subunidad α del receptor nicotínico de la acetilcolina del músculo, que se une con alta afinidad Bgt 8,9. Incorporación del sitio BBS permite la localización de la superficie y mediciones de la inserción del receptor o la retirada con la aplicación de fluorescente exógeno Bgt, tal como se describe anteriormente en el seguimiento de GABAA y metabotrópicos GABAB receptores 2,10. Además del sitio de BBS, insertamos una GFP sensible al pH (pHGFP 11) entre los aminoácidos 4 y 5 de la subunidad madura GABAAR por m estándarestrategias de biología y de clonación PCR olecular (ver figura 1) 12. El BBS es 3 'de la GFP reportero sensible al pH, separadas por un enlazador alanina / ácido prolina 13-amino. Para el tráfico de los estudios descritos en esta publicación que se basan en muestras fijas, la pHGFP sirve como reportero del total etiquetado GABAAR los niveles de proteína de la subunidad, permitiendo la normalización del etiquetado Bgt población receptora de población total al receptor. Esto minimiza célula a célula Bgt tinción variabilidad de la señal resultante de la mayor o menor expresión basal de las subunidades GABAAR etiquetados. Además, la etiqueta pHGFP permite una fácil identificación de las células que expresan constructos para experimentos de imagen en vivo o fijos.
Introduction
El uso de acoplado con fluorescencia α-bungarotoxina para estudiar la localización del receptor y la dinámica fue pionera en los estudios del receptor de acetilcolina nicotínico 13-15, diana endógeno de la toxina. Posteriormente, la incorporación del péptido mínima Bgt de unión (BBS) se ha utilizado para estudiar el tráfico de ambos canales de iones excitatorios e inhibitorios mediados por ligandos y receptores acoplados a proteína G 2,10,16-21. Esta técnica basada en BBS ofrece ventajas a otros enfoques utilizados para estudios de tráfico, como los métodos de biotinilación superficie, el etiquetado de anticuerpos de células vivas con anticuerpos frente a epítopos extracelulares, y la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP). Durante superficie celular biotinilación aminas libres están covalentemente modificados, con el potencial de afectar la actividad celular. Los estudios basados en anticuerpos a menudo se han visto obstaculizados por la agrupación antígeno de superficie o de nivelación, lo que puede alterar los eventos de tráfico. Debido a la etapa de blanqueo para FRAP sos estudios, un asunto importante es dañar la estructura celular subyacente. Una ventaja adicional es que BBS etiquetada construcciones también se pueden utilizar para metodologías bioquímicas con el tráfico de biotina acoplada bungarotoxina a asnos del receptor. Esta técnica es fácilmente aplicable a líneas celulares y células primarias. Para uso en células que expresan nicotínicos de acetilcolina (nAChR), los receptores, el antagonista de nAChR tubocurarina debe ser utilizado en todo el protocolo como se indica. Realización de una Bgt etiquetado simple superficie (equivalente al punto de tiempo T = 0 para el protocolo de endocitosis) en las células no transfectadas en ausencia de tubocurarina proporcionará pruebas de nAChR endógeno.
Una consideración importante para el uso de esta técnica es la inserción apropiada de la BBS de modo que está presente en una localización extracelular cuando la proteína de interés se entrega a la membrana plasmática. Por ejemplo, los dominios N-terminales de las subunidades GABAAR residen en el lumen vesiculares durante el tráficofico y convertirse extracelular después de la inserción del receptor en la membrana plasmática, lo que permite un etiquetado específico de los receptores de la superficie celular y evaluación de su eliminación de la superficie celular por eventos endocítica. Hemos demostrado anteriormente que la adición de GFP, myc, o BBS epítopos a este dominio de subunidades GABAAR es funcionalmente silenciosa. Los controles estándar se deben realizar para asegurar que la proteína marcada se expresa en niveles similares a una construcción sin etiquetar, que localiza apropiadamente, y que no afecta a la función del receptor. Esta caracterización de las construcciones transfectadas también ayudará en las preocupaciones de sobreexpresión de solución de problemas.
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Protocol
Todos los protocolos descritos a continuación son de acuerdo con la IACUC e IRB juntas de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh Facultad de Medicina.
1. Preparación de los cultivos neuronales del hipocampo en cultivo de tejidos Capucha
Nota: Utilice una técnica estéril y reactivos a lo largo Protocolo 1.
- Preparar poli-D-lisina (0,1 mg / ml en H2O) cubreobjetos de vidrio revestido como un sustrato para el cultivo neuronal.
- Coloque 4-5 cubreobjetos de vidrio redondos dentro de cada 3,5 cm de tejido placa de cultivo.
- Punto 70 l de poli-D-lisina en cada cubreobjetos de 12 mm. Nota: para imágenes en vivo, un fondo de cristal de 3,5 cm placa de cultivo de tejido se puede utilizar (detectar 200 l de poli-D-lisina en incrustado cubreobjetos de 14 mm).
- Deja los platos preparados en el cultivo de tejidos capó O / N. Para minimizar la poli-D-lisina evaporación y mantener las superficies estériles en la campana de cultivo de tejidos, cerrar la hoja de la ventana y apague ªe soplador de O / N. Nota: Las luces UV no se utilizan durante la incubación O / N.
- A la mañana siguiente, lavar los platos 3 veces con 2 ml de H 2 O.
- Después de quitar el último H2O lavado, añadir 2 ml de medio a cada placa 3,5 cm y dejar los platos en la incubadora hasta que esté listo a la placa de las neuronas en el paso 1.4.
- Las neuronas del hipocampo se preparan a partir del día embrionario 18-19 (E18-19) ratas (modificado de Goslin 22).
- Transfectar neuronas recién disociados en el día de cultivo con 1-4 g de ADN de constructo maxiprepped.
Nota: típicamente 3 g de ADN se transfecta en 1-2 Millón neuronas, con una viabilidad de 50% y una eficiencia de transfección del 60% (por ejemplo, a partir de 2 millones de neuronas: ((2 x 10 6 neuronas x 0.5) 0.6) proporciona aproximadamente 1 millón de neuronas,.. 600.000 de los cuales son transfectadas 1 cantidades diferentes de construcción de ADN se pueden transfectar la hora de solucionar los posibles problemas desobre-expresión, seguido por la caracterización apropiada de localización y función constructo. - Placa de las neuronas transfectadas sobre los cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina a una densidad final de aproximadamente 200.000 neuronas por 3,5 cm plato. Nota: para un fondo de cristal plato, placa 40.000-50.000 neuronas en el área del cristal 14 mm.
- Sustituya el soporte 4-24 horas después de la preparación de cultivos neuronales, a continuación, permiten que las neuronas se desarrollan en la incubadora hasta 14-17 días in vitro (DIV) o de la etapa deseada.
2. Ensayo Endocitosis
PRECAUCIÓN: Nota sobre la α-bungarotoxina y residuos tubocurarina y dirección:
- Manejo de todas las neurotoxinas de péptidos se recomienda dentro de los lineamientos de Bioseguridad Nivel 2 (BL-2) los protocolos de investigación. Todo el equipo de protección personal adecuado que se debe usar. Polvos liofilizados toxina debe reconstituirse siguiendo las instrucciones del fabricante. Toxina shou residuosld eliminarse siguiendo las normativas de salud y seguridad ambiental directrices de la institución de gobierno.
- Para eliminar posibles agregados de péptidos que se puedan haber formado durante el almacenamiento, alícuotas de α-bungarotoxina deben ser centrifugadas brevemente antes de su uso, y el sobrenadante se deben utilizar para el experimento.
- α-bungarotoxina (Bgt) las existencias se resuspenden a una concentración de 1 mg / ml en H2O estéril y se almacenan en 10 ml de alícuotas a -20 ° C. Existencias Bgt fluorescencia acoplados se utilizan a 3 g / ml. Tubocurarina se utiliza a una concentración final de 150 mM.
- Banco Set top bloque calentador a 16 ° C en cámara frigorífica con aluminio delgado o placa de acero inoxidable en la parte superior. Alternativamente, si está disponible, un alto dispositivo de refrigeración / calefacción banco se puede utilizar para cada paso que requiere 16 ° C.
- Enfriar extracelular solución salina tamponada con Hepes (HBS contienen en mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 de glucosa, 1,2 MgCl 2 y 2,5CaCl2, pH 7,4) a 16 ° C en un baño de agua.
- Transferencia de los platos de la neurona a la placa de aluminio a 16 ° C y enfriar durante 5 min.
- Retire los medios de comunicación (mantener medios condicionados y reserva en la incubadora para el paso 2.8, endocitosis puntos de tiempo de ensayo) y reemplazar con 1 ml de 16 ° C HBS + tubocurarina (150 M) durante 2 min.
- Eliminar HBS + tubocurarina al contenedor de desperdicio etiquetado y sustituir con 1 ml de 16 ° C HBS + tubocurarina (150 M) + α-bungarotoxina Alexa 594 [3 g / ml], incubando a 16 ° C durante 15 min.
- Eliminar HBS + tubocurarina + α-bungarotoxina Alexa 594 a la etiqueta contenedor de residuos y lavar platos 3 veces con 2 ml de 16 ° C HBS (los lavados se pueden recoger a través de aspiración en un matraz de vacío que contiene 50 ml de 50% de lejía).
- Para los experimentos de series temporales de imágenes en vivo siguientes endocitosis del receptor utilizando un fondo de cristal 3,5 cm placa de cultivo, realice los pasos 2.1 hasta 2.6, a continuación, llevar la cápsula a la etapa de calefacción(Dispositivo Peltier) en el microscopio, y comenzar de imágenes con un microscopio confocal o configuración TIRF.
- La transferencia de T = 0 cubreobjetos de punto de tiempo en un plato de la RT 4% de paraformaldehído / 4% de sacarosa durante 20 minutos, continuando con otros cubreobjetos en el paso 2.9.
- Para otros momentos de la hora, sustituya HBS con condicionados equilibró 37 ° C Medios (reservado en el paso 2.4) y volver a la incubadora por endocitosis a 37 ° C. Nota: sugirieron puntos adicionales de tiempo de T = 15, 30 y 60.
- En los puntos de tiempo necesario, tomar los platos de la incubadora, lave rápidamente dos veces con 2 ml de RT DPBS (DPBS sin calcio, magnesio) a continuación, fijar en paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa durante 20 min.
- Después de 20 min de fijación, retire paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa que perder envase y lavar los platos dos veces con 2 ml RT DPBS.
- Incubar cubreobjetos a TA durante 10 min en solución de bloqueo de inmunofluorescencia (solución de bloqueo = 5% de suero de caballo, 0,5% de BSA en DPBS) que contiene 0,2% de Triton X-100 a la permeabilidadize las neuronas y permitir inmunotinción anti GFP de la piscina receptor intracelular y / o etiquetado de las otras proteínas de interés.
- Extraiga el bloque de + 0,2% Triton X-100 y se incuba cubreobjetos en solución de bloqueo inmunofluorescencia sin Triton X-100 durante 20 a 30 min.
- Realice las incubaciones de anticuerpos primarios de cubreobjetos en bloque durante varias horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Nota: la incubación de cubreobjetos con primarios a 4 ° CO / N produce rutinariamente mejores resultados de inmunofluorescencia.
- Lave cubreobjetos 3 veces con DPBS (5 min para cada etapa de lavado).
- Incubar cubreobjetos con anticuerpos secundarios en solución de bloqueo durante 1 hora a TA.
- Lave cubreobjetos 3 veces con DPBS (5 min para cada etapa de lavado).
- Cubreobjetos montaje, manejo cada cubreobjetos de forma individual: eliminar el exceso de líquido de la parte posterior del cubreobjetos con papel de laboratorio, luego invierta cubreobjetos en 4 l de medio de montaje sobre un portaobjetos de vidrio.
- Permita que se sequen a temperatura ambiente cubiertos durante 30 minutos y luego stmineral a 4 ° C hasta el momento de la microscopía.
- Adquisición y análisis de experimentos con microscopía confocal (ciegos a condición experimental) Imagen. 60X petróleo NA 1.49 objetivo de inmersión con los siguientes láseres: gas argón de 488 nm, 561 diode, diodo 640.
- Utilizando los mismos parámetros de adquisición de imágenes, la obtención de imágenes de sección Z individuales con el cuerpo celular neuronal y varios procesos dendríticas en foco.
- Cuantificar α-bungarotoxina Alexa señal de fluorescencia de GFP y la inmunotinción a lo largo de 20 micras de 3-4 dendritas proximales por neurona, utilizando el mismo umbral para el análisis de todos los datos de endocitosis.
- Analizar los datos de 10 a 12 neuronas para cada punto de tiempo, repitiendo el experimento con varios cultivos neuronales independientes.
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Representative Results
Caracterización de una construcción de BBS etiquetado incluye controles importantes tales como la determinación de si la proteína expresada se ensambla correctamente (en particular con los receptores de compuestos de múltiples subunidades), trafica a la superficie celular y se localiza apropiadamente. Las sinapsis inhibitorias se componen de GABA A cúmulos superficiales receptor que colocalize con el inhibidor gephyrin andamio de proteínas y están adosados a los terminales presinápticos inhibitorios, identificados por el transportador de ácido vesicular inhibitoria amino que carga GABA y glicina en vesículas sinápticas (VIAAT / VGAT). En la Figura 2 se α2pHGFP + BBS expresando neuronas con GABAAR superficie etiquetada con Bgt, seguido de inmunotinción para la población total al receptor con el anticuerpo anti-GFP y, o bien la gephyrin postsináptico inhibitorio andamio de proteínas (Figura 2A) o VIAAT (Figura 2B).
La Figura 3 muestra la endocitosis de α2 que contiene GABAAR en las neuronas del hipocampo a 15 DIV. Mediciones de fluorescencia Bgt de procesos dendríticas individuales como se muestra en los paneles (Figura 3A) se normalizan para el nivel de expresión constructo a través de la tinción de anticuerpos GFP. Comparación final de puntos de tiempo se hace por la normalización de la medición T = 0, como se muestra en la Figura 3B. Cuantificación de la internalización de los receptores de más de un período de 60 min (Figura 3B) de los cambios de la señal de fluorescencia con el tiempo (media ± SEM: T0 = 100 ± 7.2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6, y T60 = 19,1 ± 3,4 min ) fue descrito mejor por un solo exponencial (a 37 º C: t 1/2 = 26 ± 4,8 min).
Un enfoque alternativo, que se muestra en la Figura 4, es seguir la endocitosis del receptor en una sola neurona por imágenes en vivo de lapso de tiempo microscopía confocal. El puntiforme y fluorescencia superposición de pHGFP superficie etiquetados GABAAR y Bgt l receptores abeled es visible al comienzo del experimento (T0). En el transcurso del tiempo, Bgt etiquetado señal de AR GABA disminuye, como receptores de endocitosis, mientras que la señal pHGFP sigue siendo alta debido a la nueva inserción del receptor. La disminución mínima en la señal de phGFP es debido a cambios en la distribución del receptor de la superficie celular y fotoblanqueo.
Figura 1. Diagrama de un BBS y pHGFP etiquetada GABAAR subunidad y el ensayo de la endocitosis. Endocitosis se mide mediante la aplicación de una primera bungarotoxina marcada con fluorescencia a las neuronas o las células, seguido de un breve lavado para eliminar la toxina no unida, entonces la pérdida de la fluorescencia se monitoriza como receptores son internalizado.
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Figura 2. Confocal de formación de imágenes de BBS y pHGFP etiquetada GABAAR que muestra la localización apropiada con los componentes de la sinapsis inhibidoras. De superficie GABAAR en α2pHGFP + BBS expresando neuronas se marcaron con α-bungarotoxina Alexa 594 (rojo), seguido de inmunotinción, ampliaciones de dendritas se muestran a la derecho de cada neurona. Panel Fusionada (α-bungarotoxina Alexa 594 en rojo, las buenas prácticas agrarias en verde, gephyrin o VIAAT en azul). Superficie Bgt etiquetado GABAAR espectáculo colocalización con A) la proteína andamio gephyrin y B) aposición inhibitoria postsináptica a la VIAAT marcador presináptica. (Barras de escala, 10 m.)
Figura 3. Confocal de imágenes de GABAAR endocitosis en 15 neuronas del hipocampo DIV. Una) B) gráfico representa la GABAAR superficie α-bungarotoxina Alexa 594 pérdida de fluorescencia con el tiempo con la endocitosis (normalizada a T = 0) (10-12 neuronas por punto de tiempo, 4 procesos analizados por neurona, las barras de error representan la media ± SEM).
Figura 4. Vivir imagen confocal de GABAAR endocitosis en 15 neuronas del hipocampo DIV. A) B3pHGFP + BBS que contienen GABAAR superficie en las neuronas eran-vivo marcada con α-bungarotoxina Alexa 594 (rojo), seguido por la eliminación de breve no unido α-bungarotoxina Alexa 594 por lavado. Las neuronas fueron imágenes por microscopía confocal a 37 ° C en HBS durante 20 min a un intervalo de 1 min (Barras de escala, 10 micras). GABAARs Bgt marcadas se localizan en la superficie celular en T0, como se ve por colocalización con la señal de pHGFP en T0. En el transcurso del tiempo, Bgt etiquetado señal AR GABA disminuye, como receptores de endocitosis, están continuamente siendo insertado nueva pHGFP expresan receptores, por lo que la señal pHGFP permanece casi constante.
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Discussion
Las técnicas fijas y basadas BBS descritos aquí pueden ser utilizados para rastrear receptor u otra proteína de membrana de plasma trata de líneas de células, neuronas y otras células primarias. Este método ha sido utilizado con éxito para estudiar inserción en la membrana y la eliminación de canales iónicos activados por ligando y GPCR y evaluar los cambios en el tráfico debido a la presencia de agonistas de los receptores y moduladores. Los aspectos clave incluyen la localización apropiada de la etiqueta a una ubicación extracelular y la realización de controles para asegurar que la adición de la BBS (de serie para otros periodistas, como el GFP) es funcionalmente silenciosa. Para uso en células que expresan nicotínicos de acetilcolina (nAChR), los receptores, el antagonista de nAChR tubocurarina debe ser utilizado en todo el protocolo como se indica. En el caso en que no se utiliza la etiqueta GFP adicional, el total de BBS etiquetada nivel de proteína se puede determinar a través de la tinción con una α-bungarotoxina adicional junto a otro fluoróforo después de la fijación y permeabilizción. Elección de los puntos de tiempo para medir las tasas de endocitosis del receptor / proteína de interés requiere evaluar el conocimiento actual de la trata para el receptor / proteína, combinado con el uso inicial de más puntos de tiempo. Esta técnica también se puede emplear fácilmente con inmunotinción convencional. También describe un enfoque alternativo para la endocitosis del receptor de seguimiento vía vivo los experimentos de imagen confocal. Disponibilidad de los equipos, los requisitos de tiempo para los experimentos en vivo, y otras restricciones experimentales guiarán la elección del método, siendo ambas técnicas viables y publicados. Las futuras aplicaciones de técnicas de BBS incluyen imágenes en vivo o fijo combinado con marcadores endosomal y lisosomales para seguir el destino del receptor, es decir, la orientación para el reciclaje de los endosomas y entrega de éstos, a la membrana plasmática o la degradación a través de los lisosomas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Se prestó apoyo por inicio-fondos del Departamento de Farmacología y Biología Química de la Universidad de Pittsburgh Facultad de Medicina. El reconocimiento de los miembros del laboratorio de Jacob que contribuyeron a la presentación de vídeo: Nicholas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
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