Summary
Aqui demonstramos a utilização do corante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localização do receptor de superfície e endocitose em neurónios do hipocampo. Através da utilização de construções que ostentam uma marca curta extracelular que se liga α-bungarotoxina, análise de proteína da membrana plasmática do tráfico endocítica pode ser alcançado.
Abstract
É cada vez mais evidente que os receptores de neurotransmissores, incluindo os receptores ionotrópicos GABA A (GABAAR), exposição de tráfico altamente dinâmica e mobilidade da superfície celular 1-7. Para estudar a localização na superfície da célula do receptor e a endocitose, a técnica aqui descrita combina a utilização de fluorescência α-bungarotoxina com células expressando construções que contêm um-bungarotoxina α (TGN) local de ligação (BBS). O BBS (WRYYESSLEPYPD) baseia-se na subunidade α do receptor de acetilcolina nicotínico muscular, que se liga com alta afinidade Bgt 8,9. A incorporação do local de BBS permite a localização da superfície e as medições de inserção ou a remoção do receptor com aplicação de fluorescente Bgt exógena, tal como anteriormente descrito no rastreamento de GABAA e GABAB receptores metabotrópicos de 2,10. Além de o site da BBS, inserimos um GFP sensível ao pH (pHGFP 11) entre os aminoácidos 4 e 5 da subunidade GABAAR maduro por m padrãobiologia e PCR clonagem estratégias olecular (ver Figura 1) 12. O BBS é 3 'do repórter GFP sensível ao pH, separados por um ligante de 13 amino-ácido alanina / prolina. Por tráfico de estudos descritos nesta publicação que são baseadas em amostras fixadas, o pHGFP serve como repórter do total marcado GABAAR níveis de proteína da subunidade, permitindo a normalização da Bgt rotulado população receptor à população total receptor. Isto minimiza a célula para célula Bgt variabilidade do sinal de coloração resultante da expressão da linha de base maiores ou menores das subunidades GABAAR etiquetados. Além disso, a tag pHGFP permite uma fácil identificação de células expressando construto para experimentos com imagens ao vivo ou pré-fixados.
Introduction
A utilização da fluorescência acoplado α-bungarotoxina para estudar a localização do receptor e dinâmica foi pioneira nos estudos do receptor de acetilcolina nicotínico 13-15, alvo endógeno da toxina. Subsequentemente, a incorporação do péptido mínimo Bgt ligação (BBS) foi usado para estudar o tráfico de ambos os canais iónicos dependentes de ligandos excitatórios e inibidores e receptores acoplados a proteína G 2,10,16-21. Esta técnica baseia-BBS oferece vantagens a outras abordagens utilizadas para estudos de tráfico, tais como métodos de biotinilação superfície, rotulagem anticorpo de células vivas com anticorpos para epitopos extracelulares, e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP). Durante superfície celular biotinilação aminas livres são covalentemente modificado, com o potencial de afetar a atividade celular. Estudos baseados em anticorpos têm sido muitas vezes dificultada pela aglomeração antigénio de superfície ou capeamento, que podem alterar os acontecimentos de tráfego. Devido ao passo de branqueamento de FRAP sSTUDOS, uma preocupação importante é danificar a estrutura celular subjacente. Uma vantagem adicional é que BBS marcado construções também podem ser utilizados para as metodologias bioquímicas com tráfico receptor bungarotoxina para avaliar acoplado a biotina. Esta técnica é facilmente aplicável a linhas celulares e células primárias. Para utilização em células que expressam de acetilcolina nicotínica (nAChR) receptores, o antagonista de tubocurarina nAChR deve ser utilizada ao longo do protocolo, tal como indicado. Realizando uma Bgt rotulagem superfície simples (equivalente ao ponto de tempo t = 0 para o protocolo de endocitose) em células não transfectadas, na ausência de tubocurarina fornecerá provas de nAChR endógeno.
Uma consideração importante para o uso desta técnica é a inserção adequada da BBS, de modo que este se encontra em uma localização extracelular quando a proteína de interesse é entregue para a membrana plasmática. Por exemplo, os domínios N-terminais das subunidades GABAAR reside no lúmen vesiculares durante trafficking e tornar extracelular do receptor após a inserção na membrana do plasma, permitindo marcação específica de receptores da superfície celular e da avaliação da sua remoção da superfície da célula por endocitose eventos. Mostrámos previamente que a adição de GFP, myc, ou BBS epitopos para este domínio de subunidades GABAAR é funcionalmente silenciosa. Controlos padrão deve ser realizada para assegurar que a proteína marcada é expressa em níveis semelhantes aos de uma construção não marcado, que se adequadamente localizada, e que não afecta a função do receptor. Esta caracterização de construções transfectadas também vai ajudar na solução de problemas superexpressão preocupações.
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Protocol
Todos os protocolos descritos abaixo são de acordo com o IACUC e IRB conselhos de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh School of Medicine.
1. Preparação das Culturas Hippocampal neuronal em Cultura de Tecidos capa
Nota: Use uma técnica asséptica e reagentes em todo protocolo 1.
- Prepare a poli-D-lisina (0,1 mg / ml em H2O) lamelas de vidro revestido, como um substrato para a cultura neuronal.
- Coloque 4-5 lamínulas redondas dentro de cada 3,5 centímetros de cultura de tecidos prato.
- Mancha 70 ul de poli-D-lisina em cada lamela de 12 mm. Nota: para geração de imagens ao vivo, um fundo de vidro de 3,5 cm de cultura de tecidos prato pode ser usado (spot 200 mL de poli-D-lisina para incorporado 14 milímetros lamela de vidro).
- Deixe os pratos preparados no tecido cultura capô O / N. Para minimizar poli-D-lisina evaporação e manter as superfícies estéreis na capa de cultura de tecidos, fechar o caixilho da janela e desligar ªe ventilador O / N. Nota: luzes UV não são utilizados durante a incubação O / N.
- Na manhã seguinte, lavar os pratos 3 vezes com 2 ml de H 2 O.
- Depois de remover o último H 2 O de lavagem, adicionar 2 ml de mídia para cada 3,5 centímetros prato e deixar pratos em estufa até que esteja pronto para a chapa os neurônios no passo 1.4.
- Neurônios do hipocampo são preparados a partir de dia embrionário 18-19 (E18-19) ratos (modificado de Goslin 22).
- Transfecção neurónios dissociados de fresco no dia da cultura com 1-4 ug de ADN de construção maxiprepped.
Nota: normalmente de 3 ug de ADN é transfectado em 1.2 milhões de neurónios, com uma viabilidade de 50% e uma eficiência de transfecção de 60% (por exemplo, começando com 2 milhões de neurónios: ((2 x 10 6 neurónios x 0,5) 0,6) fornece cerca de 1 milhão de neurônios;. 600.000. dos quais são transfectadas 1 diferentes quantidades de DNA construção pode ser transfectadas ao solucionar problemas potenciais dea sobre-expressão, seguido pela caracterização adequada da localização e função de construção. - Placa neurônios transfectadas nos poli-D-lisina lamínulas revestidas em uma densidade final de aproximadamente 200.000 neurônios por 3,5 centímetros prato. Nota: para um prato fundo de vidro, placa 40.000-50.000 neurônios na área de vidro 14 mm.
- Substitua a mídia 4-24 horas após a preparação de culturas neuronais, em seguida, permitir que os neurônios para desenvolver na incubadora até 14-17 dias in vitro (DIV) ou estágio desejado.
2. Endocitose Assay
CUIDADO: Nota sobre a α-bungarotoxina e resíduos tubocurarina e manipulação:
- Manipulação de todos os neurotoxinas peptídeo é recomendado nas diretrizes do Nível de Biossegurança 2 (BL-2) protocolos de pesquisa. Todos os equipamentos individuais de proteção devem ser usados. Os pós liofilizados de toxina deve ser reconstituído de acordo com as instruções do fabricante. Toxina shou resíduosld ser eliminados de acordo com Saúde e Segurança Ambiental diretrizes da instituição governamental.
- Para remover os agregados potenciais péptidos que se possam ter formado durante o armazenamento, alíquotas α-bungarotoxina devem ser centrifugadas brevemente antes de utilização, e o sobrenadante deve ser usado para a experiência.
- α-bungarotoxina (TGN) existências são ressuspensos a uma concentração de 1 mg / ml em H 2 O estéril e armazenado em alíquotas de 10 ul a -20 ° C. Estoques Bgt fluorescente acopladas são utilizadas em 3 ug / ml. Tubocurarina é utilizado a uma concentração final de 150 uM.
- Definir bancada bloco de aquecimento a 16 ° C em câmara fria com alumínio fino ou chapa de aço inoxidável no topo. Alternativamente, se disponível, uma parte superior do dispositivo de refrigeração / aquecimento banco pode ser utilizado para cada passo requerendo 16 ° C.
- Legal extracelular salinos com Hepes (HBS contendo em mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 de glicose, 1,2 MgCl2, e 2,5CaCl2, pH 7,4) a 16 ° C em um banho de água.
- Transferência pratos neurônio a placa de alumínio a 16 ° C e deixe esfriar por 5 min.
- Remova a mídia (meios condicionados e manter reserva na incubadora para a etapa 2.8, endocitose momentos ensaio) e substituir por 1 ml de 16 ° C + HBS tubocurarina (150 mM) por 2 min.
- Retirar HBS + tubocurarina para contentor de resíduos marcados e substitua com 1 ml de 16 ° C + tubocurarina HBS (150 mM) + α-bungarotoxina Alexa 594 [3 ug / ml], incubando a 16 ° C durante 15 min.
- Retirar HBS + + tubocurarina α-bungarotoxina Alexa 594 rotulado recipiente de resíduos e lavar pratos 3x com 2 ml de 16 ° C HBS (as lavagens podem ser recolhidas através de aspiração a vácuo em um balão contendo 50 ml de 50% de lixívia).
- Para experiências de séries temporais de imagens ao vivo seguintes endocitose receptor utilizando um fundo de vidro 3,5 centímetros prato de cultura, execute os passos 2,1-2,6, depois a cápsula a fase aquecida(Dispositivo de peltier) em microscópio, e começar com uma imagem confocal ou configuração TIRF microscópio.
- Transferir lamelas T = 0 ponto de tempo em um prato de RT paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose durante 20 minutos, continuando com outras lamelas para o passo 2.9.
- Para outros pontos de tempo, substitua com HBS condicionado equilibrada 37 ° C media (reservado no passo 2.4) e retornar à incubadora para endocitose a 37 ° C. Nota: Sugere pontos adicionais de tempo de T = 15, 30 e 60.
- Em pontos de tempo necessário, levar pratos da incubadora, lavar rapidamente duas vezes com 2 mL de DPBS RT (DPBS sem cálcio, magnésio), em seguida, fixar em 4% de paraformaldeído / 4% de sacarose durante 20 min.
- Após 20 min de fixação, remova paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose para contentor de resíduos e lavar pratos duas vezes com 2 ml RT DPBS.
- Incubar lamelas à TA durante 10 min em solução de bloqueio de imunofluorescência (solução de bloqueio = 5% de soro de cavalo, 0,5% de BSA em DPBS) contendo 0,2% de Triton X-100 a permeabilize os neurônios e permitem imunomarcação anti-GFP de piscina receptor intracelular e / ou rotulagem de outras proteínas de interesse.
- Retirar bloco + 0,2% de Triton X-100 e incubar lamelas em solução de bloqueio de imunofluorescência sem Triton X-100 para 20-30 min.
- Realizar as incubações do anticorpo primário de lamelas em bloco durante várias horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. Nota: incubação de lamelas com primárias a 4 ° CO / N produz rotineiramente melhores resultados de imunofluorescência.
- Wash lamelas 3x com DPBS (5 min para cada etapa de lavagem).
- Incubar lamelas com anticorpos secundários em solução de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Wash lamelas 3x com DPBS (5 min para cada etapa de lavagem).
- Lamelas de montagem, manuseio cada lamela individualmente: remover o excesso de líquido da parte traseira da lamela com o tecido laboratório, em seguida, inverter lamela em 4 mL de meio de montagem sobre uma lâmina de vidro.
- Permitir slides para secar à temperatura ambiente coberto para 30 min, em seguida, ruaminério a 4 ° C até estar pronto para realizar a microscopia.
- A aquisição de imagens e análise de experimento com a microscopia confocal (cego a condição experimental). Óleo de 60X NA 1.49 objetiva de imersão com os seguintes lasers: gás argônio de 488 nm, 561 diodo, 640 diodo.
- Usando as mesmas configurações de aquisição de imagem, aquisição de imagens de seção Z individuais com o corpo celular neuronal e vários processos dendríticos em foco.
- Quantificar α-bungarotoxina sinal de fluorescência Alexa e GFP imunocoloração ao longo de 20 um de 3-4 dendritos proximais por neurónio, usando o mesmo limite para a análise de todos os dados de endocitose.
- Analisar dados 10-12 neurônios para cada ponto de tempo, repetindo a experiência com várias culturas neuronais independentes.
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Representative Results
Caracterização de uma construção de BBS etiquetas inclui controlos importantes, tais como determinar se a proteína expressa monta adequadamente (particularmente com receptores de múltiplas subunidades composto), transita para a superfície da célula e localiza apropriadamente. Sinapses inibitórias são compostas de GABA A aglomerados de superfície receptor que colocalize com o gefirina proteína andaime inibitório e estão apostos aos terminais inibitórios pré-sinápticos, identificados pelo transportador vesicular inibitório ácido amino que carrega GABA e glicina em vesículas sinápticas (VIAAT / VGAT). Mostrado na Figura 2 são α2pHGFP + BBS expressando neurónios com GABAAR superfície rotulada com Bgt, seguido de imunocoloração para população total de receptores com anticorpo anti-GFP e quer o gefirina pós-sináptico inibitório proteína andaime (Figura 2A) ou VIAAT (Figura 2B).
A Figura 3 mostra a endocitose de α2 contendo GABAAR em neurônios do hipocampo em 15 DIV. BGT medições de fluorescência de processos dendríticos individuais como mostrado nos painéis (Figura 3A) são normalizados para o nível de construção de expressão, através da coloração com anticorpo GFP. Comparação final de pontos de tempo é feita por normalização para a medição de T = 0, como mostrado na Figura 3B. Quantificação da internalização de receptores ao longo de um período de 60 min (Figura 3B) das alterações do sinal de fluorescência ao longo do tempo (média ± SEM: T0 = 100 ± 7,2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6, e T60 = 19,1 ± 3,4 min ) foi melhor descritos por um único exponencial (a 37 º C: t 1/2 = 26 ± 4,8 min).
Uma abordagem alternativa, mostrada na Figura 4, é a de seguir a endocitose do receptor de um único neurónio por microscopia confocal de lapso de tempo de imagem ao vivo. O punctata e sobreposição de fluorescência de pHGFP superfície marcado GABAAR e Bgt l receptores abeled é visível no início da experiência (T0). Ao longo do tempo, Bgt rotulado sinal AR GABA diminui, como receptores endocytose, enquanto o sinal pHGFP permanece elevado, devido à nova inserção receptor. A diminuição mínima no sinal phGFP é devido a mudanças de distribuição de receptores de superfície celular e fotobranqueamento.
Figura 1. Diagrama de um BBS e pHGFP marcado GABAAR subunidade e o ensaio de endocitose. Endocitose é medido aplicando primeiro um bungarotoxina marcada com fluorescência para neurónios ou células, seguido de uma breve lavagem para remover a toxina não ligada e depois a perda de fluorescência é monitorizada como receptores são internalizado.
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Figura 2. Confocal de BBS e pHGFP marcado GABAAR mostrando localização apropriado com os componentes de sinapses inibitórias. Superfície GABAAR em α2pHGFP + BBS expressando neurónios foram marcados com α-bungarotoxina Alexa 594 (vermelho), seguida por imunocoloração, alargamentos de dendritos são mostradas para o direito de cada neurônio. Painel Incorporada (α-bungarotoxina Alexa 594 em vermelho, em verde GFP, gefirina ou VIAAT em azul). Superfície Bgt rotulado GABAAR show de co-localização com A) o andaime gefirina e B proteína) aposição inibitório pós-sináptico para o marcador VIAAT pré-sináptico. (As barras de escala, 10 ^ m.)
Figura 3. Confocal de imagem de GABAAR endocitose em 15 DIV neurônios do hipocampo. Um) B) O gráfico representa o GABAAR superfície α-bungarotoxina Alexa 594 perda de fluorescência ao longo do tempo com a endocitose (normalizado para t = 0) (10-12 neurónios por ponto de tempo, quatro processos analisados por neurônio; barras de erro representam a média ± SEM).
Figura 4. Vivo confocal de imagem de GABAAR endocitose em 15 DIV neurônios do hipocampo. A) B3pHGFP + BBS contendo GABAAR superfície em neurónios foram directo marcado com α-bungarotoxina Alexa 594 (vermelho), seguido por breve remoção de desacoplado α-bungarotoxina Alexa 594 por lavagem. Os neurónios foram fotografadas por microscopia confocal a 37 ° C em HBS durante 20 minutos a um intervalo de 1 min (Barras de escala, 10 fim). GABAARs BGT marcadas foram localizados na superfície da célula em T0, como pode ser visto pela co-localização com o sinal pHGFP T0. Ao longo do tempo, Bgt marcado sinal AR GABA diminui, como receptores endocytose, novo pHGFP expressando receptores estão continuamente a ser inserido, de modo que o sinal pHGFP permanece quase constante.
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Discussion
As técnicas fixos e vivos baseado BBS descritos aqui podem ser utilizados para controlar o receptor ou outro tráfico de membrana de proteína de plasma em linhas de células, os neurónios e outras células primárias. Este método tem sido utilizado com êxito para estudar a inserção na membrana e a remoção de canais iónicos dependentes de ligandos e de GPCR e avaliar as mudanças no tráfico, devido à presença de agonistas e moduladores de receptores. Os aspectos principais incluem a localização apropriada da etiqueta para uma localização extracelular e execução de controlos para assegurar que a adição de BBS (como padrão para outros repórteres, como GFP) é funcionalmente silenciosa. Para utilização em células que expressam de acetilcolina nicotínica (nAChR) receptores, o antagonista de tubocurarina nAChR deve ser utilizada ao longo do protocolo, tal como indicado. No caso em que a etiqueta de GFP adicional não é usado, BBS total de etiquetas nível de proteína pode ser determinada por meio de coloração com um-bungarotoxina α adicional acoplada a outro fluoróforo após fixação e permeabilizção. Escolha de pontos de tempo para medir as taxas de endocitose do receptor / proteína de interesse exige uma avaliação do conhecimento atual do tráfico para receptor / proteína, combinada com o uso inicial de mais pontos no tempo. Esta técnica também pode ser facilmente utilizado com a imunomarcação convencional. Nós também descrevem uma abordagem alternativa para a endocitose receptor de rastreamento via experimentos com imagens confocal ao vivo. Disponibilidade de equipamentos, regras de tempo para experimentos ao vivo, e outras restrições experimentais irá guiar a escolha do método, sendo ambas as técnicas viáveis e publicados. As aplicações futuras de técnicas BBS incluem imagens ao vivo ou fixa combinada com marcadores endossomais e lisossomais para seguir o destino dos receptores, ou seja, o alvo para a reciclagem de endossomas e devolução para a membrana do plasma ou a degradação através de lisossomas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O apoio foi fornecido pelo startup-fundos do Departamento de Farmacologia e Biologia Química da Universidade de Pittsburgh School of Medicine. Aviso de membros do laboratório Jacob que contribuíram para a apresentação de vídeo: Nicholas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
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