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Neuroscience

GABA एक रिसेप्टर झिल्ली स्थानीयकरण और तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक α-bungarotoxin बाध्यकारी साइट टैग का उपयोग

Published: March 28, 2014 doi: 10.3791/51365
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pharmacology & Chemical Biology Department, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

यहाँ हम GABA hippocampal न्यूरॉन्स में एक रिसेप्टर सतह स्थानीयकरण और endocytosis करने के लिए उपाय bungarotoxin α के लिए युग्मित फ्लोरोसेंट एलेक्सा डाई के उपयोग के प्रदर्शन. Α-bungarotoxin, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन endocytic तस्करी का विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है कि बांध में एक छोटी बाह्य टैग असर निर्माणों के उपयोग के माध्यम से.

Abstract

यह तेजी से स्पष्ट है कि ionotropic GABA एक रिसेप्टर्स (GABAAR), प्रदर्शनी अत्यधिक गतिशील तस्करी और कोशिका की सतह गतिशीलता 1-7 सहित neurotransmitter रिसेप्टर्स. रिसेप्टर सेल सतह स्थानीयकरण और endocytosis का अध्ययन करने के लिए, यहाँ वर्णित तकनीक कोशिकाओं को एक α-bungarotoxin (BGT) बाध्यकारी साइट (बीबीएस) युक्त निर्माणों को व्यक्त करने के साथ फ्लोरोसेंट α-bungarotoxin के प्रयोग को जोड़ती है. बीबीएस (WRYYESSLEPYPD) उच्च आत्मीयता 8,9 साथ BGT बांधता है जो मांसपेशियों निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर के α सबयूनिट पर आधारित है. बीबीएस साइट का समावेश पहले गाबा और metabotropic GABAB की ट्रैकिंग 2,10 रिसेप्टर्स में वर्णित के रूप में, सतह स्थानीयकरण और रिसेप्टर प्रविष्टि या एक्सोजेनस फ्लोरोसेंट BGT के आवेदन के साथ हटाने की माप की अनुमति देता है. बीबीएस साइट के अलावा, हम अमीनो एसिड 4 और मानक एम द्वारा परिपक्व GABAAR सबयूनिट के 5 के बीच एक पीएच संवेदनशील GFP (pHGFP 11) डालाolecular जीव विज्ञान और पीसीआर क्लोनिंग रणनीतियों 12 (1 चित्र देखें). बीबीएस एक 13 अमीनो एसिड alanine / प्रोलाइन linker द्वारा अलग पीएच संवेदनशील GFP संवाददाता, 3 'है. कुल एक संवाददाता BGT को सामान्य बनाने में कुल रिसेप्टर आबादी के लिए रिसेप्टर आबादी लेबल की अनुमति, GABAAR सबयूनिट प्रोटीन के स्तर में चिह्नित के रूप में तय नमूनों के आधार पर कर रहे हैं कि इस प्रकाशन में वर्णित पढ़ाई की तस्करी के लिए, pHGFP में कार्य करता है. इस में चिह्नित GABAAR सब यूनिटों के अधिक या कम आधारभूत अभिव्यक्ति से उत्पन्न BGT धुंधला संकेत परिवर्तनशीलता सेल से सेल को कम करता है. इसके अलावा pHGFP टैग रहते हैं या तय इमेजिंग प्रयोगों के लिए निर्माण व्यक्त कोशिकाओं की आसान पहचान के लिए सक्षम बनाता है.

Introduction

के fluorescently रिसेप्टर स्थानीयकरण और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए α-bungarotoxin युग्मित उपयोग निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर 13-15, विष के अंतर्जात लक्ष्य की पढ़ाई में बीड़ा उठाया था. बाद में, कम से कम BGT बाध्यकारी पेप्टाइड (बीबीएस) का समावेश दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक ligand-gated आयन चैनलों और जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स 2,10,16-21 की तस्करी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस BBS आधारित तकनीक ऐसी सतह biotinylation तरीकों, कोशिकी epitopes के लिए एंटीबॉडी के साथ जीवित कोशिकाओं के एंटीबॉडी लेबलिंग, और photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में तस्करी अध्ययन के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों के लिए लाभ प्रदान करता है. कोशिका की सतह के दौरान biotinylation मुक्त amines covalently सेलुलर गतिविधि को प्रभावित करने की क्षमता के साथ, संशोधित कर रहे हैं. एंटीबॉडी आधारित अध्ययन अक्सर तस्करी की घटनाओं को बदल सकते हैं जो सतह प्रतिजन क्लस्टरिंग या कैपिंग, द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. कारण FRAP के लिए विरंजन चरण परtudies, एक महत्वपूर्ण चिंता अंतर्निहित सेलुलर संरचना हानिकारक है. एक अतिरिक्त लाभ BBS निर्माणों भी बायोटिन मिलकर गधों bungarotoxin रिसेप्टर की तस्करी के साथ जैव रासायनिक तरीके के लिए इस्तेमाल किया जा सकता टैग किया है. इस तकनीक को सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं को आसानी से लागू है. संकेत के रूप में निकोटिनिक acetylcholine (nAChR) रिसेप्टर्स व्यक्त कि कोशिकाओं में उपयोग के लिए, nAChR प्रतिपक्षी tubocurarine प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Tubocurarine के अभाव में untransfected कोशिकाओं पर (endocytosis प्रोटोकॉल के लिए टी = 0 समय बिंदु के बराबर) एक सरल सतह BGT लेबलिंग का निष्पादन अंतर्जात nAChR के सबूत प्रदान करेगा.

यह ब्याज की प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली के लिए दिया जाता है जब एक बाह्य स्थान पर मौजूद है इतना है कि इस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार बीबीएस का उचित प्रविष्टि है. उदाहरण के लिए, GABAAR सब यूनिटों के एन टर्मिनल डोमेन traf दौरान vesicular लुमेन में रहते हैंficking और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स और endocytic घटनाओं से कोशिका की सतह से उनके हटाने के आकलन के विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति, प्लाज्मा झिल्ली में रिसेप्टर प्रविष्टि के बाद बाह्य हो गया है. हम पहले से GFP, Myc, या बीबीएस के अलावा GABAAR सब यूनिटों की इस डोमेन को epitopes पता चला है कि कार्यात्मक चुप है. मानक नियंत्रण यह उचित स्थानीयकृत कि, टैग प्रोटीन एक untagged का निर्माण करने के लिए समान स्तर पर व्यक्त की है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया, और यह रिसेप्टर समारोह को प्रभावित नहीं करता है कि किया जाना चाहिए. ट्रांसफ़ेक्ट निर्माणों की यह लक्षण वर्णन भी समस्या निवारण overexpression चिंताओं में सहायता करेगा.

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Protocol

नीचे वर्णित सभी प्रोटोकॉल IACUC और चिकित्सा के पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ आईआरबी संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुसार कर रहे हैं.

1. टिशू कल्चर हुड में hippocampal neuronal संस्कृतियों की तैयारी

नोट: 1 प्रोटोकॉल भर का उपयोग बाँझ तकनीक और अभिकर्मकों.

  1. Neuronal संस्कृति के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में पाली डी lysine (0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर में 2 एच ओ) लेपित कांच coverslips तैयार करें.
    1. प्रत्येक 3.5 सेमी टिशू कल्चर पकवान अंदर 4-5 गोल कांच coverslips रखें.
    2. प्रत्येक 12 मिमी coverslip पर स्पॉट 70 μl पाली डी lysine. नोट: लाइव इमेजिंग के लिए, एक गिलास 3.5 सेमी टिशू कल्चर पकवान (एम्बेडेड 14 मिमी कांच coverslip पर 200 μl पाली डी lysine स्थान) का इस्तेमाल किया जा सकता है तली.
    3. टिशू कल्चर हुड हे / एन में तैयार व्यंजन छोड़ दो पाली डी lysine वाष्पीकरण को कम करने और टिशू कल्चर हुड में बाँझ सतहों रखना, खिड़की सैश नीचे बंद और वें बंद करने के लिएई धौंकनी ओ / एन नोट: यूवी लाइट ओ / एन ऊष्मायन के दौरान इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं.
    4. अगली सुबह, बर्तन साफ एच 2 ओ के 2 मिलीलीटर के साथ 3x
    5. 2 हे धो आखिरी एच हटाने के बाद, प्रत्येक 3.5 सेमी पकवान करने के लिए मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और कदम 1.4 में न्यूरॉन्स थाली करने के लिए तैयार है जब तक मशीन में बर्तन छोड़ दें.
  2. Hippocampal न्यूरॉन्स भ्रूण दिन 18-19 (Goslin 22 से संशोधित) (E18-19) चूहों से तैयार कर रहे हैं.
  3. Maxiprepped निर्माण डीएनए की 1-4 ग्राम के साथ संवर्धन के दिन हौसले से अलग न्यूरॉन्स Transfect.
    नोट: आमतौर पर डीएनए की 3 ग्राम 50% की व्यवहार्यता और 2 लाख न्यूरॉन्स की शुरुआत के साथ 60% की एक अभिकर्मक दक्षता (जैसे के साथ, 1-2 लाख न्यूरॉन्स में ट्रांसफ़ेक्ट है: ((2 एक्स 10 6 न्यूरॉन्स एक्स 0.5) 0.6) प्रदान करता है लगभग 1 लाख न्यूरॉन्स;.. की संभावित समस्याओं के निवारण जब 1 ट्रांसफ़ेक्ट हैं 600000 जिनमें से निर्माण डीएनए के विभिन्न मात्रा में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता हैनिर्माण स्थानीयकरण समारोह का उचित लक्षण वर्णन द्वारा पीछा अधिक अभिव्यक्ति,.
  4. 3.5 सेमी पकवान प्रति लगभग 200,000 न्यूरॉन्स के अंतिम घनत्व पर पाली डी lysine लेपित coverslips पर ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स प्लेट. नोट: एक गिलास पकवान तली के लिए, 14 मिमी कांच क्षेत्र पर 40,000-50,000 न्यूरॉन्स थाली.
  5. मीडिया neuronal संस्कृतियों की तैयारी के बाद 4-24 घंटा बदलें, तो न्यूरॉन्स इन विट्रो (DIV) या वांछित चरण में 14-17 दिनों तक इनक्यूबेटर में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.

2. Endocytosis परख

चेतावनी: α-bungarotoxin और tubocurarine बेकार और हैंडलिंग पर ध्यान दें:

  1. सभी पेप्टाइड न्यूरोटोक्सिन की हैंडलिंग जैवसुरक्षा स्तर 2 (बीएल-2) अनुसंधान प्रोटोकॉल के दिशा निर्देशों के भीतर की सिफारिश की है. सभी उचित व्यक्तिगत सुरक्षा गियर पहना जाना चाहिए. Lyophilized विष पाउडर निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठन किया जाना चाहिए. विष अपशिष्ट Shouएलडी शासी संस्था के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा के दिशा निर्देशों के अनुपालन में निपटाया जाना.
  2. भंडारण के दौरान गठन हो सकता है कि संभावित पेप्टाइड समुच्चय को दूर करने के लिए, α-bungarotoxin aliquots उपयोग करने से पहले संक्षेप centrifuged किया जाना चाहिए, और सतह पर तैरनेवाला प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  3. α-bungarotoxin (BGT) के शेयरों में -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ एच 2 ओ में 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के लिए resuspended और 10 μl aliquots में जमा हो जाती है Fluorescently युग्मित BGT शेयरों 3 ग्राम / मिलीलीटर में उपयोग किया जाता है. Tubocurarine 150 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है.
  1. शीर्ष पर पतली एल्यूमीनियम या स्टेनलेस स्टील प्लेट के साथ ठंडे कमरे में 16 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें बेंच शीर्ष हीटर ब्लॉक. यदि उपलब्ध हो तो वैकल्पिक रूप से, एक बेंच शीर्ष / हीटिंग डिवाइस 16 डिग्री सेल्सियस की आवश्यकता के प्रत्येक चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
  2. मिमी में शामिल हैं कूल कोशिकी Hepes बफर खारा (HBS: 135 NaCl, 4.7 KCl, 10 HEPES, 11 ग्लूकोज, 1.2 2 MgCl, और 2.52 CaCl, एक पानी के स्नान में 16 डिग्री सेल्सियस तक 7.4 पीएच).
  3. 16 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम प्लेट पर स्थानांतरण न्यूरॉन बर्तन और 5 मिनट के लिए शांत.
  4. मीडिया निकालें (2.8 कदम, endocytosis परख समय अंक के लिए इनक्यूबेटर में वातानुकूलित मीडिया और आरक्षित रखने) और 2 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस HBS + tubocurarine (150 माइक्रोन) के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें.
  5. लेबल अपशिष्ट कंटेनर को HBS + tubocurarine निकालें और एलेक्सा 594 [3 ग्राम / एमएल], 15 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर incubating 1 मिलीलीटर 16 डिग्री सेल्सियस HBS + tubocurarine (150 माइक्रोन) + α-bungarotoxin के साथ बदलें.
  6. निकालें HBS + tubocurarine + α-bungarotoxin एलेक्सा 594 (washes 50% ब्लीच के 50 एमएल युक्त एक वैक्यूम फ्लास्क में आकांक्षा के माध्यम से एकत्र किया जा सकता है) अपशिष्ट कंटेनर लेबल और व्यंजन 16 डिग्री सेल्सियस HBS के 2 मिलीलीटर के साथ 3x धोने के लिए.
  7. एक कांच का उपयोग रिसेप्टर endocytosis निम्नलिखित रहते इमेजिंग समय श्रृंखला प्रयोगों 3.5 सेमी संस्कृति डिश तली लिए, कदम 2.1-2.6 प्रदर्शन, फिर गरम चरण के लिए पकवान हस्तांतरण(Peltier डिवाइस) माइक्रोस्कोप पर, और एक confocal या TIRF माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ इमेजिंग शुरू करते हैं.
  8. 2.9 कदम करने के लिए अन्य coverslips के साथ जारी, 20 मिनट के लिए आरटी 4% paraformaldehyde / 4% sucrose के एक डिश में टी = 0 समय बिंदु coverslips स्थानांतरण.
  9. अन्य समय अंक के लिए, साथ HBS की जगह 37 डिग्री सेल्सियस मीडिया (2.4 चरण में आरक्षित) और 37 डिग्री सेल्सियस नोट पर endocytosis के लिए इनक्यूबेटर पर लौटने equilibrated वातानुकूलित: अतिरिक्त समय टी = 15 के अंक, 30, और 60 का सुझाव दिया.
  10. समय बिंदुओं पर की जरूरत, इनक्यूबेटर से बर्तन ले आरटी DPBS के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार जल्दी से धो (कोई कैल्शियम, मैग्नीशियम DPBS) फिर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde / 4% sucrose में तय कर लो.
  11. 20 मिनट निर्धारण के बाद, कंटेनर कचरे और 2 मिलीलीटर आरटी DPBS के साथ दो बार बर्तन धोने के लिए 4% paraformaldehyde / 4% sucrose हटा दें.
  12. Immunofluorescence ब्लॉक समाधान में 10 मिनट के लिए आरटी पर coverslips सेते (ब्लॉक समाधान = DPBS में 5% घोड़े सीरम, 0.5% बीएसए) permeabil को 0.2% ट्राइटन X-100 युक्तन्यूरॉन्स ize और intracellular रिसेप्टर पूल और / या ब्याज की अन्य प्रोटीन की लेबलिंग के विरोधी GFP immunostaining सक्षम.
  13. ब्लॉक + 0.2% ट्राइटन X-100 निकालें और 20-30 मिनट के लिए ट्राइटन X-100 के बिना immunofluorescence ब्लॉक समाधान में coverslips सेते हैं.
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या ओ / एन पर कई घंटे के लिए ब्लॉक में coverslips के प्राथमिक एंटीबॉडी incubations प्रदर्शन करना नोट: 4 ° सीओ / एन में प्राइमरी साथ coverslips के ऊष्मायन नियमित सुधार immunofluorescence परिणाम लाता है.
  15. धो DPBS (प्रत्येक धोने के कदम के लिए 5 मिनट) के साथ 3x coverslips.
  16. आरटी पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ coverslips सेते हैं.
  17. धो DPBS (प्रत्येक धोने के कदम के लिए 5 मिनट) के साथ 3x coverslips.
  18. व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक coverslip निपटने माउंट coverslips,: प्रयोगशाला ऊतक के साथ coverslip के पीछे से अतिरिक्त तरल निकालने के लिए, तो एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते मध्यम के 4 μl पर coverslip पलटना.
  19. आरटी पर सुखाने के लिए स्लाइड सेंट फिर 30 मिनट के लिए कवर की अनुमति दें4 डिग्री सेल्सियस पर अयस्क माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए तैयार है जब तक.
  20. छवि अधिग्रहण और confocal माइक्रोस्कोपी (प्रयोगात्मक हालत को अंधा) के साथ प्रयोग के विश्लेषण. 60X तेल NA निम्नलिखित लेज़रों के साथ 1.49 विसर्जन उद्देश्य: आर्गन गैस 488 एनएम, 561 डायोड, 640 डायोड.
    1. एक ही छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करना, neuronal सेल शरीर और ध्यान में कई वृक्ष के समान प्रक्रियाओं के साथ ही जेड अनुभाग प्राप्त चित्रों के.
    2. सभी endocytosis डेटा के विश्लेषण के लिए एक ही सीमा का उपयोग कर, न्यूरॉन प्रति 3-4 समीपस्थ dendrites के 20 माइक्रोन साथ α-bungarotoxin एलेक्सा प्रतिदीप्ति संकेत और GFP immunostaining यों.
    3. कई स्वतंत्र neuronal संस्कृतियों के साथ प्रयोग दोहराने, हर समय बिंदु के लिए 10-12 न्यूरॉन्स से डेटा का विश्लेषण.

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Representative Results

एक BBS में चिह्नित निर्माण की विशेषता ऐसे व्यक्त प्रोटीन (विशेष रूप से कई यूनिटों से बना रिसेप्टर्स के साथ) ठीक से assembles अगर निर्धारित करने के रूप में महत्वपूर्ण नियंत्रण भी शामिल है, कोशिका की सतह को traffics और उचित localizes. निरोधात्मक synapses निरोधात्मक पाड़ प्रोटीन gephyrin साथ colocalize और synaptic पुटिका (VIAAT / VGAT) में GABA और ग्लाइसिन कि भार vesicular निरोधात्मक अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर द्वारा की पहचान presynaptic निरोधात्मक टर्मिनल, के लिए apposed रहे हैं कि एक रिसेप्टर सतह समूहों GABA से बना रहे हैं. Α2pHGFP + BBS विरोधी GFP एंटीबॉडी और postsynaptic निरोधात्मक पाड़ प्रोटीन gephyrin (2A चित्रा) या VIAAT (चित्रा 2 बी) के साथ या तो कुल रिसेप्टर आबादी के लिए immunostaining द्वारा पीछा BGT के साथ लेबल सतह GABAAR, साथ न्यूरॉन्स व्यक्त चित्रा 2 में दिखाया गया.

चित्रा 3 α की endocytosis से पता चलता है2 15 DIV में hippocampal न्यूरॉन्स में GABAAR युक्त. पैनल (चित्रा 3) के रूप में दिखाया व्यक्ति वृक्ष के समान प्रक्रियाओं का BGT प्रतिदीप्ति माप GFP एंटीबॉडी धुंधला के माध्यम से निर्माण अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्यीकृत कर रहे हैं. चित्रा 3 बी के रूप में दिखाया समय अंक की अंतिम तुलना, = 0 टी माप को सामान्य बनाने के द्वारा किया जाता है. समय के साथ प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन से एक 60 मिनट की अवधि (3B चित्रा) से अधिक रिसेप्टर्स की internalization की मात्रा (SEM मतलब ±: t0 = 100 ± 7.2, T15 = 74.7 ± 12.9, T30 = 44.7 ± 5.6, और T60 = 19.1 ± 3.4 मिनट टी 1/2 = 26 ± 4.8 मिनट):) सर्वश्रेष्ठ 37 डिग्री सेल्सियस पर (एक घातीय द्वारा वर्णित किया गया था.

चित्रा 4 में दिखाया गया है एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, रहते इमेजिंग समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एक न्यूरॉन में रिसेप्टर endocytosis पालन करने के लिए है. सतह pHGFP के कबरा और अतिव्यापी प्रतिदीप्ति GABAAR और BGT एल में चिह्नित abeled रिसेप्टर्स प्रयोग (t0) के शुरू में दिखाई दे रहा है. समय के पाठ्यक्रम पर, BGT रिसेप्टर्स endocytose रूप pHGFP संकेत की वजह से नई रिसेप्टर प्रविष्टि के लिए उच्च बनी हुई है, जबकि GABA एआर संकेत, कम हो जाती है लेबल. phGFP संकेत में न्यूनतम कमी कोशिका की सतह रिसेप्टर वितरण में परिवर्तन और photobleaching की वजह से है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक BBS और pHGFP के चित्र GABAAR सबयूनिट और endocytosis परख में चिह्नित. Endocytosis पहले अनबाउंड विष को दूर करने के लिए एक संक्षिप्त धोने के द्वारा पीछा न्यूरॉन्स या कोशिकाओं को एक fluorescently लेबल bungarotoxin, लगाने से मापा जाता है, तो प्रतिदीप्ति नुकसान रिसेप्टर्स के रूप में नजर रखी है भली भाँति.

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बीबीएस और pHGFP की चित्रा 2. Confocal इमेजिंग निरोधात्मक synapse घटकों के साथ उचित स्थानीयकरण दिखा GABAAR टैग किया. न्यूरॉन्स α-bungarotoxin एलेक्सा 594 immunostaining के बाद (लाल) के साथ लेबल रहे थे व्यक्त α2pHGFP + बीबीएस में GABAAR भूतल, डेन्ड्राइट का enlargements के लिए दिखाए जाते हैं प्रत्येक न्यूरॉन के सही. मर्ज किए गए कक्ष (नीले रंग में α-bungarotoxin लाल एलेक्सा 594, GFP हरी, gephyrin में या VIAAT). भूतल BGT presynaptic मार्कर VIAAT के लिए) एक साथ postsynaptic निरोधात्मक पाड़ प्रोटीन gephyrin और बी) समानाधिकरण GABAAR शो colocalization लेबल. (स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन.)

चित्रा 3
चित्रा 3. 15 DIV hippocampal न्यूरॉन्स में GABAAR endocytosis के confocal इमेजिंग. ए) बी) ग्राफ़ एलेक्सा विश्लेषण किया 4 प्रक्रियाओं, समय बिंदु प्रति 10-12 न्यूरॉन्स () = 0 टी करने के लिए (सामान्यीकृत endocytosis के साथ समय के साथ 594 प्रतिदीप्ति नुकसान सतह GABAAR α-bungarotoxin का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं न्यूरॉन प्रति; त्रुटि सलाखों) मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. 15 DIV hippocampal न्यूरॉन्स में GABAAR endocytosis के confocal इमेजिंग जीते. ए) B3pHन्यूरॉन्स में सतह GABAAR युक्त GFP + BBS लाइव लेबल α-bungarotoxin एलेक्सा 594 धोने से अनबाउंड α-bungarotoxin एलेक्सा 594 का संक्षिप्त हटाने के बाद (लाल) के साथ थे. न्यूरॉन्स एक 1 मिनट का अंतराल (स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन) पर 20 मिनट के लिए HBS में 37 डिग्री सेल्सियस पर confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे. T0 पर pHGFP संकेत के साथ colocalization के रूप में देखा BGT लेबल GABAARs, t0 पर कोशिका की सतह के लिए स्थानीय थे. समय के पाठ्यक्रम पर, BGT GABA एआर संकेत रिसेप्टर्स endocytose के रूप में, रिसेप्टर्स व्यक्त नई pHGFP लगातार डाला जा रहा है, कम हो जाती है लेबल, तो pHGFP संकेत लगभग स्थिर बनी हुई है.

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Discussion

यहाँ वर्णित BBS आधारित निश्चित और जीने तकनीक रिसेप्टर या सेल लाइनों, न्यूरॉन्स, और अन्य प्राथमिक कोशिकाओं में अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पद्धति का सफलतापूर्वक झिल्ली प्रविष्टि और ligand-gated आयन चैनल और GPCR को हटाने का अध्ययन करने और कारण रिसेप्टर agonists और modulators की उपस्थिति के लिए तस्करी में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रमुख पहलुओं उपयुक्त एक बाह्य स्थान पर टैग का स्थानीयकरण और बीबीएस की कि इसके अलावा यह सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण का प्रदर्शन (जैसे GFP जैसे अन्य पत्रकारों के लिए मानक के रूप में) कार्यात्मक चुप है शामिल हैं. संकेत के रूप में निकोटिनिक acetylcholine (nAChR) रिसेप्टर्स व्यक्त कि कोशिकाओं में उपयोग के लिए, nAChR प्रतिपक्षी tubocurarine प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अतिरिक्त GFP टैग नहीं किया जाता है, जहां मामले में, कुल BBS प्रोटीन स्तर निर्धारण और permeabiliz के बाद एक और फ्लोरोफोरे करने के लिए मिलकर एक अतिरिक्त α-bungarotoxin साथ धुंधला के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता टैग कियासमझना. ब्याज की रिसेप्टर / प्रोटीन की endocytosis दर को मापने के लिए समय अंक की च्वाइस अधिक समय अंक की प्रारंभिक उपयोग के साथ संयुक्त रिसेप्टर / प्रोटीन, के लिए तस्करी की मौजूदा ज्ञान का आकलन करने की आवश्यकता है. इस तकनीक को भी आसानी से पारंपरिक immunostaining के साथ नियोजित किया जा सकता. हम भी जीना confocal इमेजिंग प्रयोगों के माध्यम से ट्रैकिंग रिसेप्टर endocytosis के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का वर्णन. उपकरणों की उपलब्धता, लाइव प्रयोगों, और अन्य प्रयोगात्मक की कमी के लिए समय की आवश्यकताओं विधि, दोनों की जा रही व्यवहार्य और प्रकाशित तकनीक के चुनाव मार्गदर्शन करेंगे. बीबीएस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों यानी लाइसोसोम के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली या गिरावट के लिए endosomes और redelivery रीसाइक्लिंग के लिए लक्षित कर, रिसेप्टर भाग्य का पालन करें endosomal और lysosomal मार्कर के साथ संयुक्त रहते हैं या तय इमेजिंग शामिल हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

समर्थन चिकित्सा के पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के स्कूल में औषध विज्ञान और रासायनिक जीवविज्ञान विभाग से स्टार्टअप फंड द्वारा प्रदान किया गया. निकोलस Graff: वीडियो प्रस्तुत करने के लिए जो योगदान दिया याकूब प्रयोगशाला के सदस्यों का आभार.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
P3 Primary Cell 4D kit  Lonza V4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate Molecular Probes B35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes B13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate Molecular Probes B13423
(+)-Tubocurarine chloride Tocris 2820
Mounting medium  DAKO cS703
DPBS no calcium, magnesium Invitrogen 14190-136
Poly-D-lysine  Sigma P6407
Gephyrin antibody Synaptic Systems 147 011 1:300
VIAAT/VGAT antibody Synaptic Systems 131 002 1:1,000
anti GFP Life Technologies A6455 1:2,000
Glass bottom tissue culture dish MatTek Corporation P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm Warner Instruments 640-0702

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References

  1. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  2. Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
  3. Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
  4. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  5. Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
  6. Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
  7. Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
  8. Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
  9. Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
  10. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  11. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  12. Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
  13. Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
  14. Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
  15. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
  16. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
  17. Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
  18. Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
  19. Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
  20. Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
  21. Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
  22. Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 85 α-bungarotoxin बाध्यकारी साइट endocytosis immunostaining कृंतक hippocampal न्यूरॉन्स रिसेप्टर तस्करी प्लाज्मा झिल्ली
GABA एक रिसेप्टर झिल्ली स्थानीयकरण और तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक α-bungarotoxin बाध्यकारी साइट टैग का उपयोग
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Brady, M. L., Moon, C. E., Jacob, T. … More

Brady, M. L., Moon, C. E., Jacob, T. C. Using an α-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking. J. Vis. Exp. (85), e51365, doi:10.3791/51365 (2014).

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