Summary
Her har vi demonstrere brugen af fluorescerende Alexa farvestof koblet til α-bungarotoxin at måle GABAA receptor overflade lokalisering og endocytose i hippocampus neuroner. Gennem brug af konstruktionerne, der bærer en kort ekstracellulære tag, der binder α-bungarotoxin, kan opnås analyse af plasmamembranprotein endocytiske handel.
Abstract
Det er i stigende grad klart, at neurotransmitterreceptorer, herunder ionotropic GABA A receptorer (GABAAR), udviser meget dynamisk handel og celleoverfladen mobilitet 1-7. For at undersøge receptor celleoverfladen lokalisering og endocytose, den her beskrevne teknik kombinerer brugen af fluorescerende α-bungarotoxin med celler, der udtrykker konstruktioner indeholdende en α-bungarotoxin (Bgt) bindingssted (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) er baseret på α-underenheden af musklen nikotinacetylcholinreceptoren, som binder Bgt med høj affinitet 8,9. Inkorporering af BBS hjemmeside giver overflade lokalisering og måling af receptor indsættelse eller fjernelse med anvendelse af eksogene fluorescerende Bgt, som tidligere beskrevet i sporing af GABAA og metabotropisk GABAB receptorer 2,10. Ud over BBS site, vi indsat en pH-følsom GFP (pHGFP 11) mellem aminosyrerne 4 og 5 af det modne GABAAR underenheden af standard-molecular biologi og PCR kloningsstrategier (se figur 1) 12. BBS er 3 'af pH-følsomme GFP reporter, adskilt af en 13-aminosyren alanin / prolin-linker. For trafficking undersøgelser er beskrevet i denne publikation, der er baseret på faste prøver det pHGFP fungerer som en reporter af alt mærkede GABAAR subunit protein niveauer, så normalisering af Bgt mærkede receptor population til den samlede receptor befolkning. Dette minimerer celle til celle Bgt farvning signal variation som følge af højere eller lavere baseline udtryk for de mærkede GABAAR underenheder. Desuden pHGFP tag gør det let at identificere konstruere udtrykker celler til levende eller faste billeddannelse eksperimenter.
Introduction
Anvendelsen af fluorescens koblet α-bungarotoxin for at studere receptor lokalisering og dynamik var banebrydende ved undersøgelser af nikotinacetylcholinreceptoren 13-15 toksinet endogene mål. Efterfølgende har inkorporering af den minimale Bgt bindende peptid (BBS) blevet anvendt til at undersøge handel med både stimulerende og hæmmende ligandstyrede ionkanaler og G proteinkoblede receptorer 2,10,16-21. Dette BBS-baserede teknik giver fordele til andre tilgange, der anvendes til undersøgelser for menneskehandel, såsom overflade biotinyleringsbetingelserne metoder, antistof-mærkning af levende celler med antistoffer mod ekstracellulære epitoper, og fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP). Under celleoverfladen biotinyleringsbetingelserne frie aminer er kovalent modificeret med potentiale til at påvirke cellulær aktivitet. Antistof baserede undersøgelser er ofte blevet hæmmet af overfladeantigen clustering eller capping, som kan ændre begivenheder smuglerruter. På grund af blegning skridt for FRAP studies er et vigtigt indsatsområde at beskadige den underliggende cellestruktur. En yderligere fordel er, at BBS mærkede konstruktioner kan også anvendes til biokemiske metoder med biotin-koblede bungarotoxin at vurdere receptor handel. Denne teknik er let anvendelse på cellelinier og primære celler. Til brug i celler, der udtrykker nicotin-acetylcholin (nAChR)-receptorer, skal nAChR antagonist tubocurarin bruges i hele protokollen som angivet. Udførelse af en simpel overflade Bgt etikettering (svarende til T = 0 tidspunkt for endocytose protokol) på utransficerede celler i fravær af tubocurarin vil fremlægge dokumentation for endogent nAChR.
En vigtig overvejelse ved anvendelse af denne teknik er passende indsættelse af BBS, så det er til stede i en ekstracellulær placering, når proteinet af interesse er leveret til plasmamembranen. For eksempel N-terminale domæner af GABAAR underenheder bosat i vesikulære lumen under trafikskehandel og bliver ekstracellulære efter receptor indsættelse i plasmamembranen, så specifik mærkning af celleoverfladereceptorer og vurdering af deres fjernelse fra celleoverfladen ved endocytiske begivenheder. Vi har tidligere vist, at tilsætningen af GFP, myc eller BBS epitoper til dette domæne af GABAAR underenheder er funktionelt tavse. Standard kontroller bør udføres for at sikre, at den mærkede protein er udtrykt på samme niveau til et ukodet konstruktion, at det korrekt lokaliseret, og at det ikke påvirker receptor funktion. Denne karakteristik af transfekterede konstruktioner vil også støtte i fejlfinding overekspression bekymringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller, der er beskrevet nedenfor, er i overensstemmelse med IACUC og IRB Institutional Review bestyrelser University of Pittsburgh School of Medicine.
1.. Udarbejdelse af Hippocampus neuronkulturer i vævskultur Hood
Bemærk: Brug steril teknik og reagenser hele protokol 1.
- Forbered poly-D-lysin (0,1 mg / ml i H2O) coatede dækglas som et substrat for den neuronale kultur.
- Placer 4-5 runde dækglas inde hver 3,5 cm vævskulturskål.
- Spot 70 ul poly-D-lysin på hver 12 mm dækglas. Bemærk: For levende billeddannelse, bund et glas kan bruges 3,5 cm vævskulturskål (spot 200 ul poly-D-lysin på embedded 14 mm dækglas).
- Lad tilberedte retter i vævskultur hætte O / N. For at minimere poly-D-lysin fordampning og holde overflader sterile i vævskultur hætte, lukke vinduesrammen og slukke the blower O / N. Bemærk: UV lys er ikke anvendes under O / N inkubation.
- Den næste morgen, vaske 3x med 2 ml H 2 O.
- Efter at have fjernet den sidste H2O vask, tilsættes 2 ml medier til hver 3,5 cm skål og efterlade retter i kuvøse, indtil klar til plade neuronerne i trin 1.4.
- Hippocampusneuroner fremstilles ud fra embryonisk dag 18-19 (E18-19) rotter (modificeret fra Goslin 22).
- Transficere frisk dissocierede neuroner på dagen for dyrkning med 1-4 ug maxiprepped konstrukt DNA.
Bemærk: typisk 3 ug DNA transficeres ind 1-2 millioner neuroner med en levedygtighed på 50% og en transfektionseffektivitet på 60% (fx startende med 2 millioner neuroner: ((2 x 10 6 neuroner x 0.5) 0.6) giver ca 1 million neuroner;.. 600.000 af dem er transfekteret 1 forskellige mængder konstruktion DNA kan transficeres ved fejlfinding potentielle problemer foroverekspression, efterfulgt af passende karakterisering af konstruktion lokalisering og funktion. - Plate de transfekterede neuroner på poly-D-lysin coatede dækglas på en endelig tæthed på ca 200.000 neuroner pr 3,5 cm skål. Bemærk: For et glas bund fad, tallerken 40.000-50.000 neuroner på glasset område 14 mm.
- Udskift mediet 4-24 timer efter tilberedning af neuronale kulturer, så lad neuroner til at udvikle sig i rugemaskinen indtil 14-17 dage in vitro (DIV) eller ønsket scene.
2. Endocytose Assay
ADVARSEL: Notat om α-bungarotoxin og tubocurarin affald og håndtering:
- Håndtering af alle peptid nervegifte anbefales inden for de retningslinjer for biosikkerhedsniveau-2 (BL-2) forskning protokoller. Alle korrekte personlige værnemidler skal anvendes. Frysetørrede toksin pulvere bør rekonstitueres efter producentens anvisninger. Toxin affald Should skal bortskaffes i overensstemmelse med det styrende institutionens Environmental Health and Safety retningslinjer.
- For at fjerne potentielle peptid aggregater, som kan have dannet under opbevaring bør α-bungarotoxin portioner centrifugeres kortvarigt før brug, og supernatanten bør anvendes til eksperimentet.
- α-bungarotoxin (Bgt) bestande er resuspenderet til en koncentration på 1 mg / ml i sterilt H 2 O og opbevaret i 10 portioner pi ved -20 ° C. Fluorescens koblet BGT lagrene anvendes på 3 pg / ml. Tubocurarin anvendes i en slutkoncentration på 150 uM.
- Sæt bænk top varmeblok til 16 ° C i koldt rum med tynde aluminium eller rustfri stålplade på toppen. Alternativt, hvis tilgængelig, en bænk top køling / opvarmning enhed kan bruges for hvert trin, der kræver 16 ° C.
- Cool ekstracellulære Hepes-bufret saltvand (HBS indeholdende i mM: 135 NaCl, 4,7 KCI, 10 HEPES, 11 glucose, 1,2 MgCl2 og 2,5CaCl2, pH 7,4) til 16 ° C i et vandbad.
- Overførsel neuron retter aluminiumplade ved 16 ° C og afkøles i 5 min.
- Fjern medier (holde aircondition medier og reserve i kuvøse for trin 2.8, endocytose assay tidspunkter), og udskift med 1 ml 16 ° C HBS + tubocurarin (150 uM) i 2 min.
- Fjern HBS + tubocurarin til mærket affaldsbeholder og erstatte med 1 ml 16 ° C HBS + tubocurarin (150 uM) + α-bungarotoxin Alexa 594 [3 pg / ml], inkubation ved 16 ° C i 15 min.
- Fjern HBS + tubocurarin + α-bungarotoxin Alexa 594 til mærket affaldsbeholder og vaske tallerkener 3x med 2 ml 16 ° C HBS (vaskene kan indsamles via aspiration i et vakuum kolbe indeholdende 50 ml 50% blegemiddel).
- Til serien billeddannelse tid eksperimenter efter receptor endocytose hjælp af en glas bund 3,5 cm dyrkningsskål udføre trin 2,1-2,6, og derefter overføre parabol til opvarmet scene(Peltier-enhed) på mikroskop, og begynde billeddannelse med en konfokal eller TIRF mikroskop setup.
- Transfer T = 0 tidspunkt dækglas i en skål af RT 4% paraformaldehyd / 4% saccharose i 20 minutter, fortsatte med andre dækglas til trin 2.9.
- For andre tidspunkter, erstatte HBS med aircondition ligevægt 37 ° C medier (reserveret i trin 2.4) og vende tilbage til inkubator for endocytose ved 37 ° C. Bemærk: foreslået yderligere tidspunkter af T = 15, 30 og 60 år.
- På tidspunkter, til at træffe retter fra kuvøse, vaskes hurtigt to gange med 2 ml RT DPBS (DPBS ingen calcium, magnesium) derefter lave i 4% paraformaldehyd / 4% saccharose i 20 min.
- Efter 20 min fiksering, fjerne 4% paraformaldehyd / 4% saccharose affaldsbeholder og vaske retter to gange med 2 ml RT DPBS.
- Inkubér dækglas ved stuetemperatur i 10 minutter i immunofluorescens blokopløsning (blokopløsning = 5% hesteserum, 0,5% BSA i DPBS) indeholdende 0,2% Triton X-100 til permeabilize neuroner og aktivere anti-GFP immunfarvning af intracellulær receptor pool og / eller mærkning af andre proteiner af interesse.
- Fjern blok + 0,2% Triton X-100 og inkuberes dækglas i immunfluorescens blokopløsning uden Triton X-100 i 20-30 minutter.
- Udfør primære antistofinkubationer af dækglas i blok i flere timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Bemærk: inkubation af dækglas med primærvalg ved 4 ° CO / N rutinemæssigt producerer forbedrede immunofluorescens resultater.
- Vask dækglas 3x med DPBS (5 min for hver vask trin).
- Inkubér dækglas med sekundære antistoffer i blok opløsningen i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask dækglas 3x med DPBS (5 min for hver vask trin).
- Mount dækglas, håndtering hvert dækglas individuelt: fjerne overskydende væske fra bagsiden af dækglasset med lab væv, så vend dækglas på 4 pi montering medium på en glasplade.
- Tillad dias til tørre ved RT dækket i 30 min og derefter stmalm ved 4 ° C, indtil klar til at udføre mikroskopi.
- Billede erhvervelse og analyse af forsøg med konfokal mikroskopi (blind for eksperimentel tilstand). 60X olie NA 1,49 immersionsobjektivet med følgende lasere: Argon gas 488 nm, 561 diode, 640 diode.
- Brug af samme billedindstillinger erhvervelse erhverve enkelt Z sektion billeder med den neuronale celle krop og flere dendritiske processer i fokus.
- Kvantificere α-bungarotoxin Alexa fluorescenssignal og GFP immunfarvning langs 20 um 3-4 proksimale dendritter pr neuron med den samme tærskel for analyse af alle endocytose data.
- Analyser af data fra 10 til 12 neuroner for hvert tidspunkt at gentage forsøget med flere uafhængige neuronale kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering af en BBS mærkede konstruktion omfatter vigtige kontroller såsom bestemmelse af, om det udtrykte protein samles korrekt (især med receptorer er sammensat af flere underenheder), trafikker til celleoverfladen og lokaliseres hensigtsmæssigt. Hæmmende synapser er sammensat af GABA A receptor overflade klynger, colocalize med den hæmmende stillads protein gephyrin og apposed til præsynaptiske hæmmende terminaler, identificeret af vesikulær hæmmende aminosyretransporter der indlæser GABA og glycin i synaptiske vesikler (VIAAT / VGAT). Vist i figur 2 er α2pHGFP + BBS udtrykkende neuroner i overfladen GABAAR mærket med Bgt efterfulgt af immunfarvning for total receptor befolkning med anti-GFP-antistof og enten postsynaptisk inhiberende stillads protein gephyrin (figur 2A) eller VIAAT (figur 2B).
Figur 3 viser endocytose af α2 indeholdende GABAAR i hippocampale neuroner ved 15 DIV. BGT fluorescens målinger af individuelle dendritiske processer som vist i panelerne (figur 3A) er normaliseret til det niveau af konstruktionen ekspression via GFP antistoffarvning. Endelig sammenligning af tidspunkter foretages ved normalisering til T = 0 måling, som vist i figur 3B. Kvantificering af internalisering af receptorer over en 60 min periode (figur 3B) fra fluorescens signal ændringer over tid (gennemsnit ± SEM: T0 = 100 ± 7,2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6, og T60 = 19,1 ± 3,4 min ) blev bedst beskrevet ved en enkelt eksponentiel (ved 37 º C: t 1/2 = 26 ± 4,8 min.)
En alternativ fremgangsmåde, der er vist i figur 4, er at følge receptor endocytose i en enkelt neuron levende imaging time-lapse konfokal mikroskopi. Den punktformig og overlappende fluorescens overflade pHGFP tagged GABAAR og Bgt l abeled receptorer er synligt ved begyndelsen af forsøget (T0). Over den tid naturligvis Bgt mærket GABA AR signalet falder, som receptorer endocytose, mens pHGFP signalet forbliver høj på grund af ny receptor indsættelse. Den minimale fald i phGFP signal skyldes celleoverfladereceptor distributions ændringer og fotoblegning.
Fig. 1. Diagram over et BBS og pHGFP mærkede GABAAR underenhed og endocytose assay. Endocytose måles ved først at påføre en fluorescens-mærket bungarotoxin til neuroner eller celler, efterfulgt af en kort vask for at fjerne ubundet toksin, så fluorescens tab overvåges som receptorer er internaliseret.
jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Konfokal afbildning af BBS og pHGFP mærkede GABAAR viser passende lokalisering med hæmmende synapse komponenter. Surface GABAAR i α2pHGFP + BBS udtrykkende neuroner blev mærket med α-bungarotoxin Alexa 594 (rød), efterfulgt af immunfarvning er udvidelser af dendritter vist til højre for hver neuron. Flettede panel (α-bungarotoxin Alexa 594 i rød, GFP i grøn, gephyrin eller VIAAT i blå). Surface Bgt mærket GABAAR show colokalisering med A) den postsynaptiske hæmmende stillads protein gephyrin og B) apposition til den præsynaptiske markør VIAAT. (Skalapanelerne, 10 um.)
Figur 3. Konfokal billeddannelse af GABAAR endocytose i 15 DIV hippocampale neuroner. A) B) Graf repræsenterer overfladen GABAAR α-bungarotoxin Alexa 594 fluorescens tab over tid med endocytose (normaliseret til T = 0) (10-12 neuroner pr tidspunkt, 4 processer analyserede per neuron; fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SEM).
Levende Figur 4.. Konfokal billeddannelse af GABAAR endocytose i 15 DIV hippocampus neuroner. A) B3pHGFP + BBS indeholdende overflade GABAAR i neuroner levende mærket med α-bungarotoxin Alexa 594 (rød), efterfulgt af kortvarig fjernelse af ubundet α-bungarotoxin Alexa 594 ved vask. Neuroner blev afbildet ved konfokal mikroskopi ved 37 ° C i HBS i 20 minutter ved en 1 min interval (skalapanelerne, 10 um). BGT Mærkede GABAARs blev lokaliseret til celleoverfladen på T0, som det ses ved colokalisering med pHGFP signalet på T0. Over den tid naturligvis Bgt mærket GABA AR signalet falder, som receptorer endocytose er ny pHGFP udtrykker receptorer stadighed indsat, så det pHGFP signalet forbliver næsten konstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BBS baserede faste og levende teknikker beskrevet her kan anvendes til at spore receptor eller anden plasmamembranprotein handel med cellelinier, neuroner og andre primære celler. Denne fremgangsmåde er med succes blevet brugt til at studere membran indsættelse og fjernelse af ligand-gatede ionkanaler og GPCR og vurdere ændringer i handel på grund af tilstedeværelsen af receptoragonister og modulatorer. Vigtige aspekter omfatte passende lokalisering af tag til et ekstracellulært sted og udføre kontroller for at sikre, at tilsætning af BBS (som standard for andre reportere, såsom GFP) er funktionelt tavse. Til brug i celler, der udtrykker nicotin-acetylcholin (nAChR)-receptorer, skal nAChR antagonist tubocurarin bruges i hele protokollen som angivet. I det tilfælde, hvor yderligere GFP tag ikke anvendes alt BBS mærkede proteinniveauet kan bestemmes via farvning med en ekstra α-bungarotoxin er koblet til en anden fluorofor efter fiksering og permeabilization. Valg af tidspunkter for måling endocytose satserne for receptor / protein af interesse kræver vurdere det aktuelle kendskab til menneskehandel med receptor / protein, kombineret med første brug af flere tidspunkter. Denne teknik kan også let anvendes med konventionel immunfarvning. Vi beskriver også en alternativ metode til sporing receptor endocytose via levende konfokal imaging eksperimenter. Udstyrets tilgængelighed, vil tiden for levende eksperimenter og andre eksperimentelle begrænsninger vejlede valg af metode, begge er levedygtige og offentliggjorte teknikker. Fremtidige anvendelser af BBS teknikker omfatter live eller fast billedbehandling kombineret med endosomale og lysosomale markører til at følge receptor skæbne, dvs målretning til genbrug endosomes og tilbagelevering til plasmamembranen eller nedbrydning via lysosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Der blev leveret af startup-midler fra Farmakologi og Chemical Biology Department på University of Pittsburgh School of Medicine. Anerkendelse af Jacob lab medlemmer, der har bidraget til video indsendelse: Nicholas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).
