Summary
Ici, nous démontrons l'utilisation de colorant fluorescent Alexa couplé à α-bungarotoxine à mesurer récepteur GABA A de localisation à la surface et l'endocytose dans les neurones de l'hippocampe. Grâce à l'utilisation de constructions portant une étiquette extracellulaire qui se lie à court α-bungarotoxine, l'analyse de la membrane plasmique protéine endocytose trafic peut être atteint.
Abstract
Il est de plus en plus évident que les récepteurs de neurotransmetteurs, dont les récepteurs ionotropiques GABAA (GABAAR), exposition traite très dynamique et la mobilité de la surface de la cellule 1-7. Pour étudier la localisation des récepteurs de surface cellulaire et l'endocytose, la technique décrite ici combine l'utilisation d'α-bungarotoxine fluorescent avec des cellules exprimant des constructions contenant une α-bungarotoxine (Bgt) du site de liaison (BBS). Le BBS (WRYYESSLEPYPD) est basé sur la sous-unité α du récepteur nicotinique de l'acétylcholine de muscle, qui se lie avec une grande affinité Bgt 8,9. Incorporation du site BBS permet la localisation de surface et des mesures de l'insertion ou du retrait du récepteur avec application de la fluorescence exogène Bgt, comme décrit précédemment dans le cheminement de GABAA et GABAB récepteurs métabotropiques 2,10. En plus du site de BBS, on a inséré une GFP sensible au pH (pHGFP 11) entre les acides aminés 4 et 5 de la sous-unité mature par GABAAR m-typestratégies de biologie et de clonage PCR olecular (voir la figure 1) 12. Le BBS est en 3 'de la GFP reporter sensible au pH, séparés par une alanine / acide proline lieur 13-amino. Pour le trafic études décrites dans cette publication qui sont basées sur des échantillons fixés, le pHGFP sert un journaliste du total marqué GABAAR niveaux de sous-unité protéique, permettant la normalisation de la Bgt marqué population de récepteur à récepteur population totale. Cela minimise cellule à Bgt coloration variabilité du signal résultant de supérieur ou inférieur expression de base des sous-unités GABAAR marqués. En outre, l'étiquette pHGFP permet une identification facile des cellules de construction exprimant des expériences en direct ou fixes imagerie.
Introduction
L'utilisation de la fluorescence couplé α-bungarotoxine à étudier la localisation du récepteur et la dynamique a été lancée dans des études sur le récepteur nicotinique de l'acétylcholine 13-15, cible endogène de la toxine. Par la suite, l'incorporation du peptide minimal Bgt liaison (BBS) a été utilisée pour étudier la traite des canaux ioniques excitateurs et inhibiteurs ligand-dépendants et G récepteurs couplés aux protéines 2,10,16-21. Cette technique basée sur la BBS offre des avantages à d'autres approches utilisées pour les études de trafic tels que les méthodes de biotinylation de surface, marquage de l'anticorps de cellules vivantes avec des anticorps à des épitopes extracellulaires, et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Au cours de la surface cellulaire biotinylation amines libres sont modifiés de manière covalente, avec le potentiel d'affecter l'activité cellulaire. Études basées anticorps ont souvent été entravés par le regroupement ou le plafonnement de l'antigène de surface, ce qui peut modifier les événements de la traite. En raison de l'étape de blanchiment pour FRAP ses études, une préoccupation importante est endommager la structure cellulaire sous-jacent. Un avantage supplémentaire est que l'étiquette BBS constructions peuvent aussi être utilisées pour des méthodes biochimiques avec le trafic de récepteur couplé à la biotine bungarotoxine à ânes. Cette technique est facilement applicable à des lignées cellulaires et des cellules primaires. Pour une utilisation dans des cellules qui expriment l'acétylcholine nicotinique (nAChR) des récepteurs, l'antagoniste tubocurarine nAChR doit être utilisé dans le protocole comme indiqué. Exécution d'une simple surface étiquetage Bgt (équivalent au point de temps T = 0 pour le protocole d'endocytose) sur les cellules non transfectées en l'absence de tubocurarine fournira la preuve de nAChR endogène.
Une considération importante pour l'utilisation de cette technique est l'insertion appropriée du BBS de sorte qu'il est présent à un emplacement extracellulaire lorsque la protéine d'intérêt est délivré à la membrane plasmique. Par exemple, les domaines N-terminaux des sous-unités GABAAR résident dans la lumière au cours de la traite vésiculairesficking et devenir extracellulaire après l'insertion du récepteur dans la membrane plasmatique, ce qui permet le marquage spécifique de récepteurs de surface cellulaire et l'évaluation de leur retrait de la surface de la cellule par endocytose événements. Nous avons précédemment montré que l'addition de GFP, myc, ou BBS épitopes de ce domaine de sous-unités GABAAR est fonctionnellement silencieuse. Les contrôles standard doivent être effectuées afin de s'assurer que la protéine marquée est exprimée à des niveaux similaires à un produit d'assemblage non marqué, qu'il localisé de manière appropriée, et que cela n'affecte pas la fonction du récepteur. Cette caractérisation de constructions transfectées aidera également à dépannage surexpression préoccupations.
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Protocol
Tous les protocoles décrits ci-dessous sont conformes à la IACUC et NI comités d'éthique de l'Université de Pittsburgh School of Medicine.
Une. Préparation des cultures de neurones de l'hippocampe en culture de tissus capot
Note: Utiliser une technique stérile et réactifs tout au long de protocole 1.
- Préparer le poly-D-lysine (0,1 mg / ml dans H 2 O) des lamelles de verre revêtu en tant que substrat pour la culture des neurones.
- Placez 4-5 lamelles rondes de verre à l'intérieur de chaque boîte de culture de tissu de 3,5 cm.
- Coin 70 ul de poly-D-lysine sur chaque lamelle couvre-objet de 12 mm. Remarque: pour l'imagerie en temps réel, un fond de verre de 3,5 cm boîte de culture de tissu peut être utilisé (repérer 200 pi poly-D-lysine sur incorporé 14 mm lamelle de verre).
- Laissez les plats préparés dans la culture de tissus capot O / N. Pour minimiser la poly-D-lysine évaporation et maintenir les surfaces stériles dans la hotte de culture de tissus, fermer la fenêtre à guillotine et éteignez ee soufflante O / N. Remarque: les lampes UV ne sont pas utilisés pendant l'incubation O / N.
- Le lendemain matin, laver la vaisselle 3x avec 2 ml de H 2 O.
- Après avoir retiré le dernier H 2 O lavage, ajouter 2 ml de milieu à chaque 3,5 cm plat et laissez plats dans l'incubateur jusqu'à ce que prêt à plaquer les neurones à l'étape 1.4.
- Neurones de l'hippocampe sont préparés à partir de jour embryonnaire 18-19 (E18-19) (rats modifiés de Goslin 22).
- Transfecter des neurones dissociés fraîchement le jour de mise en culture avec de 1 à 4 pg d'ADN de construction maxiprepped.
Note: en général 3 pg d'ADN est transfecté dans 1-2000000 neurones, avec une viabilité de 50% et une efficacité de transfection de 60% (par exemple, en commençant par les neurones: 2000000 ((2 x 10 6 x neurones 0,5) 0,6) prévoit environ 1 million de neurones;. 600000. qui sont transfectées 1 quantités différentes de construction d'ADN peuvent être transfectées lors de la résolution des problèmes potentiels desur-expression, suivi par une caractérisation appropriée de construction localisation et leur fonction. - Plate neurones transfectées sur des poly-D-lysine lamelles enrobées à une densité finale d'approximativement 200 000 neurones par 3,5 cm plat. Remarque: pour un fond de verre plat, assiette 40,000-50,000 neurones sur la surface vitrée de 14 mm.
- Remplacez le support 4-24 heures après la préparation des cultures de neurones, puis permettent aux neurones de se développer dans l'incubateur jusqu'à 14-17 jours in vitro (DIV) ou stade désiré.
2. Endocytose Assay
ATTENTION: Note sur α-bungarotoxine et déchets de tubocurarine et la manipulation:
- Manipulation de tous les neurotoxines peptidiques est recommandé dans les lignes directrices de biosécurité de niveau 2 (BL-2) protocoles de recherche. Tout l'équipement de protection individuelle approprié doit être porté. Poudres de toxine lyophilisés doivent être reconstitués selon les instructions du fabricant. Toxine déchets should être éliminés en conformité avec les directives de santé et sécurité de l'environnement de l'institution gouvernementale.
- Pour éliminer les agrégats peptidiques potentiels qui se sont formées au cours du stockage, des aliquotes α-bungarotoxine doivent être centrifugés brièvement avant utilisation, et le surnageant doivent être utilisées pour l'expérience.
- α-bungarotoxine (Bgt) les stocks sont remises en suspension à une concentration de 1 mg / ml dans H 2 O stérile et stocké dans des aliquotes de 10 ul à -20 ° C. Les stocks BGT fluorescence couplés sont utilisés à 3 pg / ml. Tubocurarine est utilisé à une concentration finale de 150 uM.
- Réglez paillasse bloc chauffant à 16 ° C dans une chambre froide avec de l'aluminium mince ou plaque d'acier inoxydable sur le dessus. Alternativement, si disponible, un haut dispositif de refroidissement / chauffage de banc peut être utilisé pour chaque étape nécessitant 16 ° C.
- Frais extracellulaire salines Hepes tamponné (HBS contenant en mm: 135 NaCl, KCl 4,7, 10 HEPES, 11 glucose, 1,2 MgCl 2 et 2,5CaCl2, pH 7,4) à 16 ° C dans un bain d'eau.
- Transfert des plats de neurones à la plaque d'aluminium à 16 ° C et laisser refroidir pendant 5 minutes.
- Retirez le support (garder milieux conditionnés et réserve dans l'incubateur pour l'étape 2.8, points de temps de dosage d'endocytose) et le remplacer par 1 ml de 16 ° C HBS + tubocurarine (150 M) pendant 2 min.
- Retirer HBS + tubocurarine à conteneur à déchets dûment et remplacer par 1 ml de 16 ° C HBS + tubocurarine (150 M) + α-bungarotoxine Alexa 594 [3 pg / ml], l'incubation à 16 ° C pendant 15 min.
- Retirer HBS + + tubocurarine α-bungarotoxine marquée à l'Alexa 594 conteneur de déchets et laver la vaisselle 3x avec 2 ml de 16 ° C HBS (les lavages peuvent être collectées par l'intermédiaire d'une aspiration dans une fiole à vide contenant 50 ml d'eau de Javel à 50%).
- Pour les expériences d'imagerie en direct de séries chronologiques suivantes endocytose récepteur à l'aide d'un fond de verre de 3,5 cm boîte de culture, effectuer les étapes 2.1 au 2.6, puis transférer plat à platine chauffante(Dispositif à effet Peltier) sur microscope, et commencer l'imagerie confocale avec un ou configuration FRBR de microscope.
- Transfert T = 0 point de temps lamelles dans un plat de RT paraformaldéhyde à 4% / 4% de saccharose pendant 20 min, en continuant avec d'autres lamelles à l'étape 2.9.
- Pour d'autres points dans le temps, remplacer HBS avec conditionnée équilibrée 37 ° C médias (réservé à l'étape 2.4) et revenir à l'incubateur pour l'endocytose à 37 ° C. Note: suggéré points supplémentaires de temps de T = 15, 30, et 60.
- Aux points de temps nécessaire, prendre des plats de l'incubateur, lavez rapidement deux fois avec 2 ml de RT DPBS (dPBS pas de calcium, magnésium), puis fixer à 4% de paraformaldéhyde / 4% de saccharose pendant 20 min.
- Après 20 min de fixation, retirez du paraformaldéhyde 4% / 4% de saccharose à perdre récipient et laver la vaisselle deux fois avec 2 ml RT DPBS.
- Incuber les lamelles à température ambiante pendant 10 min dans une solution de bloc d'immunofluorescence (solution de bloc = sérum de cheval à 5%, BSA à 0,5% dans du DPBS) contenant 0,2% de Triton X-100 à perméabilitéiser les neurones et permettre immunomarquage anti-GFP de la piscine et / ou à l'étiquetage d'autres protéines d'intérêt récepteur intracellulaire.
- Retirer bloc + 0,2% de Triton X-100 et incuber dans une solution de lamelles couvre-bloc d'immunofluorescence sans Triton X-100 pendant 20-30 min.
- Effectuer des incubations d'anticorps primaires de lamelles couvre-objet en bloc pendant plusieurs heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Remarque: l'incubation des lamelles avec les primaires à 4 ° CO / N produit régulièrement des résultats améliorés d'immunofluorescence.
- Laver 3 fois avec du DPBS lamelles couvre-objet (5 min à chaque étape de lavage).
- Incuber les lamelles couvre-objet avec des anticorps secondaires dans la solution de bloc pour une heure à température ambiante.
- Laver 3 fois avec du DPBS lamelles couvre-objet (5 min à chaque étape de lavage).
- Des lamelles de montage, la manutention chaque lamelle individuelle: supprimer l'excès de liquide de l'arrière de la lamelle avec un tissu de laboratoire, puis inversez lamelle sur 4 pi de milieu de montage sur une lame de verre.
- Permettre diapositives à sécher à la température ambiante couverts pendant 30 min puis stminerai à 4 ° C jusqu'au moment de réaliser la microscopie.
- Acquisition et l'analyse de l'expérience avec la microscopie confocale (aveugle à condition expérimentale) l'image. Huile 60X NA 1.49 objectif d'immersion avec les lasers suivants: gaz Argon 488 nm, 561 diode, diode 640.
- En utilisant les mêmes paramètres d'acquisition d'images, d'acquérir des images de la section de Z simples avec le corps des cellules neuronales et plusieurs processus dendritiques dans la discussion.
- Quantifier α-bungarotoxine Alexa signal de fluorescence GFP et immunocoloration 20 um de long 04.03 dendrites proximales par neurone, en utilisant le même seuil pour l'analyse de toutes les données d'endocytose.
- Analyser les données de 10 à 12 neurones pour chaque point de temps, répétant l'expérience avec plusieurs cultures de neurones indépendants.
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Representative Results
Caractérisation d'une construction BBS marqué comprend des contrôles importants, tels que la détermination de si la protéine exprimée assemble correctement (en particulier avec des récepteurs constitués de plusieurs sous-unités), des trafics à la surface de la cellule et se localise de façon appropriée. Synapses inhibitrices sont composées de GABA A grappes de surface des récepteurs qui sont colocalisées avec l'inhibiteur géphyrine de protéine d'échafaudage et sont apposés à des bornes inhibiteurs pré-synaptiques, identifiées par le transporteur vésiculaire inhibiteur d'amino-acide qui charge le GABA et la glycine dans les vésicules synaptiques (VIAAT / de VGAT). Représenté sur la Figure 2 sont α2pHGFP + BBS neurones exprimant avec GABAAR de surface marquée avec Bgt, suivi par une coloration immunologique pour la population des récepteurs totale avec un anticorps anti-GFP et soit l'inhibiteur géphyrine post-synaptique de la protéine d'échafaudage (figure 2A) ou VIAAT (figure 2B).
La figure 3 montre l'endocytose de α2 contenant GABAAR dans les neurones de l'hippocampe au 15 DIV. BGT fluorescence mesures des processus dendritiques individuels comme représenté sur les panneaux (Figure 3A) sont normalisées au niveau de l'expression du produit d'assemblage par l'intermédiaire de la coloration d'anticorps de la GFP. Comparaison finale des points dans le temps est effectué par une normalisation de la mesure T = 0, comme représenté sur la figure 3B. Quantification de l'internalisation des récepteurs sur une période de 60 min (figure 3B) de changements de signaux de fluorescence au cours du temps (moyenne ± SEM: T0 = 100 ± 7,2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6, et T60 = 19,1 ± 3,4 min ) a été mieux décrit par une seule exponentielle (à 37 º C: t 1/2 = 26 ± 4,8 min).
Une autre approche, représentée sur la figure 4, est de suivre l'endocytose récepteur dans un seul neurone par l'imagerie en direct time-lapse microscopie confocale. Le ponctuée et la fluorescence chevauchement des pHGFP de surface marquées GABAAR et Bgt l récepteurs abeled est visible au début de l'expérience (T0). Au cours du temps, Bgt étiqueté signal AR GABA diminue, comme les récepteurs endocytose, tandis que le signal pHGFP reste élevé en raison de nouvelle insertion du récepteur. La diminution minimale du signal phGFP est due à des changements et des photoblanchiment de distribution des récepteurs de la surface cellulaire.
Figure 1. Schéma d'un BBS et pHGFP étiqueté GABAAR sous-unité et le dosage de l'endocytose. L'endocytose est mesurée en appliquant d'abord une bungarotoxine marquée par fluorescence à des neurones ou des cellules, suivie par un bref lavage pour éliminer la toxine non liée, puis la perte de fluorescence est surveillée en tant que récepteurs sont intériorisée.
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Figure 2. Confocal d'imagerie de BBS et pHGFP étiqueté GABAAR montrant la localisation appropriée avec des composants synaptiques inhibiteurs. Surface GABAAR dans α2pHGFP + BBS exprimant les neurones ont été marquées avec α-bungarotoxine Alexa 594 (rouge), suivie d'une immuno-coloration, des agrandissements de dendrites sont présentés à la droit de chaque neurone. Panneau fusionné (α-bungarotoxine Alexa 594 en rouge, en vert GFP, géphyrine ou VIAAT en bleu). Surface Bgt marqué GABAAR spectacle colocalisation avec A) l'inhibiteur de protéine échafaudage géphyrine et B) l'apposition post-synaptique au marqueur VIAAT présynaptique. (Barres d'échelle, 10 um.)
Figure 3. Imagerie confocale de GABAAR endocytose dans 15 neurones de l'hippocampe DIV. A) B) graphique représente le GABAAR de surface α-bungarotoxine Alexa 594 perte de fluorescence au cours du temps à l'endocytose (normalisée à T = 0) (10-12 neurones par point de temps, quatre processus analysés par neurone; barres d'erreur représentent la moyenne ± SEM).
Figure 4. Vivez l'imagerie confocale de GABAAR endocytose dans 15 neurones de l'hippocampe DIV. A) B3pHGFP + BBS contenant GABAAR de surface dans les neurones étaient en direct marqué avec α-bungarotoxine Alexa 594 (rouge), suivie par une brève suppression de non liée α-bungarotoxine Alexa 594 par lavage. Les neurones ont été imagées par microscopie confocale à 37 ° C dans du HBS pendant 20 min à un intervalle de 1 min (barres d'échelle, 10 pm). GABAARs Bgt marquées ont été localisés à la surface des cellules à T0, comme on le voit par colocalisation avec le signal pHGFP à T0. Au cours du temps, Bgt étiqueté signal AR GABA diminue, comme les récepteurs endocytose, nouveau pHGFP exprimant des récepteurs sont constamment inséré, si le signal pHGFP reste à peu près constante.
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Discussion
Les techniques fixes et vivants basés BBS décrites ici peuvent être utilisés pour suivre récepteur ou autre membrane plasmique protéine traite des lignées de cellules, les neurones et d'autres cellules primaires. Cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier l'insertion de membrane et la suppression des canaux ioniques et des GPCR ligand-dépendants et évaluer les changements dans le trafic en raison de la présence d'agonistes des récepteurs et des modulateurs. Aspects clés comprennent la localisation appropriée de la balise à un emplacement extracellulaire et effectuer des contrôles pour s'assurer que l'addition du BBS (en standard pour d'autres journalistes, comme la GFP) est fonctionnellement silencieuse. Pour une utilisation dans des cellules qui expriment l'acétylcholine nicotinique (nAChR) des récepteurs, l'antagoniste tubocurarine nAChR doit être utilisé dans le protocole comme indiqué. Dans le cas où le mot-clé de la GFP supplémentaire n'est pas utilisé, au total BBS étiqueté niveau de la protéine peut être déterminée au moyen d'une coloration avec une α-bungarotoxine supplémentaire couplé à un autre fluorophore après fixation et permeabilization. Choix de points dans le temps pour mesurer les taux de récepteur / protéine d'intérêt endocytose faut évaluer les connaissances actuelles de la traite pour le récepteur / protéine, combinée avec l'utilisation initiale de plus de points dans le temps. Cette technique peut également être facilement utilisé avec immunomarquage classique. Nous décrivons également une approche alternative pour l'endocytose du récepteur de suivi en direct par l'intermédiaire d'expériences d'imagerie confocale. la disponibilité de l'équipement, les délais pour des expériences en direct, et d'autres contraintes expérimentales guideront le choix de la méthode, les deux techniques viables et publiées être. Les applications futures de techniques BBS comprennent l'imagerie en direct ou fixe combinée avec des marqueurs de endosomes et lysosomes de suivre le destin de récepteur, c'est à dire visant au recyclage des endosomes et restitution à la membrane plasmique ou de la dégradation par les lysosomes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Un soutien a été fourni par startup-fonds du Département de biologie et pharmacologie chimique à l'Université de Pittsburgh School of Medicine. Accusé de membres du laboratoire Jacob qui ont contribué à la présentation de la vidéo: Nicolas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
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