Summary
ここでは、GABA海馬ニューロンにおける受容体表面局在およびエンドサイトーシスを測定するために、ブンガロトキシンをαに結合された蛍光Alexaの色素の使用を示す。 α-ブンガロトキシンに結合する細胞外の短いタグを有する構築物の使用によって、血漿膜タンパク質のエンドサイトーシス輸送の分析を達成することができる。
Abstract
これは、ますます明らかであるイオンチャネル型GABA A受容体（GABAAR）、展示高度に動的な輸送および細胞表面移動度1-7を含む神経伝達物質受容体、。受容体細胞表面局在化およびエンドサイトーシスを研究するために、ここに記載された技術は、α-ブンガロトキシン（BGT）結合部位（BBS）を含む構築物を発現する細胞と蛍光α-ブンガロトキシンの使用を兼ね備えています。 BBS（WRYYESSLEPYPD）は、高親和性8,9でBGTをバインドし、筋肉ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニットに基づいています。掲示板サイトの取り込みは、以前に、GABA Aと代謝型GABABの追跡2,10受容体で説明したように、表面局在および受容体の挿入または外因性蛍光BGTの適用と除去の測定を可能にする。 BBS部位に加えて、我々は標準mで成熟GABAARサブユニットのアミノ酸4と5の間のpH感受性GFP（pHGFP 11）に挿入olecular分子生物学およびPCRクローニングストラテジー12（ 図1参照）。 BBSは、13個のアミノ酸のアラニン/プロリンリンカーにより分離、pH感受性GFPレポーターの3 'である。固定したサンプルに基づいており、この文書に記載されて人身売買の研究のために、pHGFPが全体の記者がBGTの正規化は、全受容体集団に受容体集団をラベル付けできるように、GABAARサブユニットタンパク質レベルタグとして機能します。これはタグ付けされたGABAARサブユニットの高いまたは低いベースライン発現に起因する細胞BGT染色シグナルの変動にセルを最小限に抑えることができます。さらにpHGFPタグは、ライブまたは固定イメージング実験用の細胞を発現する構築物を容易に識別することができます。
Introduction
の蛍光体の局在とダイナミクスを研究するため、α-ブンガロトキシンを結合された使用は、ニコチン性アセチルコリン受容体13〜15、毒素の内因性標的の研究で開拓された。続いて、最小限のBGT結合ペプチド（BBS）の組み込みは、興奮性および阻害性リガンド依存性イオンチャネルおよびGタンパク質共役受容体2,10,16-21両方の輸送を研究するために使用されている。このBBSベースの技術は、表面ビオチン化法、細胞外エピトープに対する抗体を用いた生細胞の抗体標識、および（FRAP）を光退色後蛍光回復などの人身売買の研究に使用される他のアプローチには利点を提供します。細胞表面の間にビオチン化遊離アミンが共有結合し細胞活性に影響を与える可能性を秘めた、変更されます。抗体ベースの研究は、多くの場合、人身売買のイベントを変更することができ、表面抗原クラスタリングまたはキャッピングによって妨げられてきた。原因FRAP sの漂白工程へtudies、重要な関心事は、下にある細胞構造を損傷している。さらなる利点は、BBSが構築物はまた、ビオチン結合ロバにブンガロトキシン受容体の輸送生化学手法を用いることができるタグ付けすることである。この技術は、細胞株および初代細胞に容易に適用可能である。示されるように、ニコチン性アセチルコリン（nAChRの）受容体を発現する細胞で使用するためには、のnAChR拮抗ツボクラリンは、プロトコル全体で使用されている必要があります。ツボクラリンの非存在下でトランスフェクトしていない細胞に（エンドサイトーシスプロトコルのT = 0の時点に相当）の単純な表面BGT標識を行うと、内因性nAChRの証拠を提供する。
それは、目的のタンパク質が原形質膜に送達される細胞外の位置に存在するように、この技術を使用するための重要な考慮事項は、BBSの適切な挿入である。例えば、GABAARサブユニットのN-末端ドメインは、人身中に水疱ルーメン内に常駐fickingおよび細胞表面受容体およびエンドサイトーシスイベントによる細胞表面からの除去の評価の特異的標識を可能にする、原形質膜中の受容体の挿入後に細胞外になります。我々は以前GABAARサブユニットのこのドメインへのGFP、mycを、BBS又はエピトープの添加は、機能的にサイレントであることが示されている。標準コントロールは、それが適切に局在すること、タグ付きタンパク質はタグなし構築物に類似したレベルで発現されることを保証するために行われ、それが受容体の機能に影響を与えないべきである。トランスフェクトコンストラクトのこの特性は、トラブルシューティングの過剰発現の懸念を支援します。
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Protocol
以下に説明されているすべてのプロトコルは、動物実験委員会と医学のピッツバーグ大学大学院のIRB制度審査委員会に従う。
1。組織培養フード内の海馬ニューロン培養の調製
注意：プロトコル1全体で使用無菌技術および試薬を。
- 神経細胞培養のための基質としてポリ-D-リジン（0.1 mg / mlの中のH 2 O）、コーティングされたガラス製カバースリップを準備します。
- 各3.5センチメートル組織培養皿の内側4-5ラウンドガラス製カバースリップを配置。
- 各12ミリメートルのカバーガラス上にスポット70μlのポリ-D-リジン。注：ライブイメージングのために、ガラスは、（埋め込まれた14ミリメートルのガラス製カバースリップ上に200μlのポリ-D-リジンを発見）3.5 cmの組織培養皿を用いることができる有底。
- 組織培養フードのO / Nで惣菜を残すポリ-D-リジンの蒸発を最小限に抑え、組織培養フードに無菌表面を保ち、窓サッシを閉鎖し、目をオフにするにはEブロワーのO / N注意：UVランプは、O / Nインキュベーション中に使用されていません。
- 翌朝、食器は、H 2 Oの2ミリリットルで3回洗浄
- 最後のH 2 Oの洗浄を除去した後、各3.5センチメートル皿にメディアの2ミリリットルを追加し、ステップ1.4でニューロンをめっきする準備が整うまでインキュベーター内で料理をしておきます。
- 海馬ニューロンは、胎生18〜19（ゴズリン22から改変）（E18-19）のラットから調製される。
- マキシ構築DNAの1-4μgの培養の日に新鮮に解離した神経細胞をトランスフェクト。
注意：一般的にDNAの3μgの50％の生存率および200万ニューロンから始まる60％のトランスフェクション効率（ 例えばで、100万〜200万ニューロンにトランスフェクトされる。（（2×10 6ニューロンX 0.5）0.6）を提供します約百万ニューロン; 1をトランスフェクトされる60万々の潜在的な問題のトラブルシューティングを行うときに、構築物のDNAの異なる量のトランスフェクトすることができる。過剰発現は、構築物の局在と機能の適切な特性評価を行った。 - プレートの3.5cm皿当たり約20万のニューロンの最終的な密度で、ポリ-D-リジンコートしたカバーガラス上にトランスフェクションしたニューロンを。注意：ガラスボトムディッシュのために、14ミリメートルのガラス面積に4〜5万ニューロンをプレート。
- 神経細胞は、in vitro（DIV）または所望の段階で 14〜17日まで、インキュベーター内で開発できるようにして、神経細胞培養の調製後のメディア4月24日時間を交換してください。
2。エンドサイトーシスアッセイ
注意：α-ブンガロトキシンおよびツボクラリン廃棄や取り扱いに注意してください：
- すべてのペプチド神経毒の扱いは、バイオセーフティレベル2（BL-2）研究プロトコールのガイドラインの範囲内でお勧めします。すべての適切な個人保護具を着用しなければならない。凍結乾燥された毒素粉末は、製造業者の説明書に従って再構成されるべきである。毒素廃棄寿LDは支配機関の環境衛生および安全に関するガイドラインを遵守して処分される。
- 貯蔵中に形成されている可能性のある潜在的なペプチド凝集体を除去するために、α-ブンガロトキシンのアリコートを使用前に短時間遠心分離されるべきであり、そして上清を実験に使用されるべきである。
- α-ブンガロトキシン（BGT）ストックは-20℃での滅菌H 2 O中の1 mg / mlの濃度に再懸濁し、10μlのアリコートで保存されている蛍光結合されたBGTストックを3μg/ mlの時に使用されている。ツボクラリンは、150μMの最終濃度で使用されている。
- 上に薄いアルミニウムやステンレス板と低温室で16℃に設定し、ベンチトップヒーターブロック。可能な場合あるいは、ベンチトップ冷却/加熱装置は16℃を必要とする各工程のために使用することができる
- 単位はmM含有クール外Hepes緩衝生理食塩水（HBS：135のNaCl、4.7 KCl、10mMのHEPES、11グルコース、1.2のMgCl 2、および2.5CaCl 2を 、水浴中で16°CまでpH7.4）中。
- 16℃、5分間のクールでアルミ板への転送ニューロン料理を。
- メディアを取り出す（ ステップ2.8、エンドサイトーシスアッセイの時点インキュベーター内条件培地と予備を保持 ）し、2分間16℃で、HBS +のツボクラリン（150μm）で1ミリリットルと交換してください。
- ラベルされた廃棄物容器にHBS +ツボクラリンを削除し、アレクサ594 [3μg/ mlの]、15分間16℃でインキュベートする1ミリリットル16の℃のHBS +のツボクラリン（150μM）+α-ブンガロトキシンと交換します。
- 取り外しHBS +ツボクラリン+α-ブンガロアレクサ594（洗浄は50％の漂白剤50ミリリットルを含む真空フラスコに吸引を介して収集することができます）廃棄物容器とラベルと料理は16℃、HBSの2ミリリットルで3回洗浄します。
- ガラスを用いた受容体エンドサイトーシスに続いてライブイメージング時系列実験3.5 10cm培養皿の底には、2.1〜2.6の手順を実行し、次に加熱ステージに皿を転送する（ペルチェ素子）顕微鏡、共焦点またはTIRF顕微鏡のセットアップを画像化を開始します。
- 2.9ステップに他のカバースリップを続け、20分間RT 4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロースの皿にT = 0の時点カバースリップを転送する。
- 他の時点では、エアコンとHBSを交換する（ステップ2.4に予約）37℃のメディアを平衡化し、37℃（注）でエンドサイトーシスのためのインキュベーターに戻る：T = 15、30、および60の追加の時点を示唆した。
- の時点で必要に応じて、インキュベーターから料理を取るのRTのDPBS 2mlですばやく2回洗わない（カルシウム、マグネシウムをDPBSない）、その後20分間、4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロースで固定します。
- 20分固定後、コンテナを無駄にし、2ミリリットルのRT DPBSで二度皿を洗うために4％パラホルムアルデヒド/ 4％ショ糖を除去します。
- 透磁率0.2％トリトンX-100を含有する免疫蛍光ブロック溶液（ブロック溶液= 5％ウマ血清、DPBS中の0.5％BSA）中で室温で10分間カバースリップをインキュベートするニューロンをIZE、細胞内受容体プールと/または関心のある他のタンパク質の標識の抗GFP免疫染色を可能にする。
- ブロック+0.2％トリトンX-100を取り外し、20〜30分のためのトリトンX-100なしで免疫蛍光ブロック溶液中でカバースリップをインキュベートする。
- 4℃でRTまたはO / Nで数時間ブロックにカバースリップの一次抗体インキュベーションを行う注：4°のCO / Nにおける原色とカバースリップのインキュベーションは日常の改良免疫蛍光結果を生成します。
- 洗浄はDPBSで3回（各洗浄工程のための5分間）カバースリップ。
- 室温で1時間ブロック溶液中の二次抗体を用いてカバースリップをインキュベートする。
- 洗浄はDPBSで3回（各洗浄工程のための5分間）カバースリップ。
- マウントカバースリップ、個別に各カバースリップの処理：スライドガラス上にメディアをマウントする4μLにカバースリップを反転して、実験室組織とカバーガラスの背面から過剰な液体を除去。
- そしてSTスライドを30分間に覆わRTで乾燥させる顕微鏡法を実行する準備するまで4℃で鉱石。
- 共焦点顕微鏡（実験条件にブラインド）を用いた実験の画像取得と分析。 60XオイルNA以下のレーザーで1.49浸対物レンズ：アルゴンガスは488nm、561ダイオード、640ダイオード。
- 同じ画像取得設定を使用して、神経細胞体及びフォーカスのいくつかの樹状突起を有する単一のZ部分画像を取得する。
- すべてのエンドサイトーデータの分析のために同じ閾値を用いて、ニューロンあたり3-4近位の樹状突起に沿って20μmのα-ブンガロトキシンAlexaの蛍光シグナル及びGFP免疫染色を定量する。
- いくつかの独立した神経細胞培養を用いた実験を繰り返して、各時点で10〜12ニューロンからのデータを分析。
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Representative Results
BBSタグ付けされた構造のキャラクタリゼーションは、発現されたタンパク質は（特に複数のサブユニットからなる受容体に）適切に組み立てるかどうかを判断するなどの重要なコントロールが含まれ、細胞表面にトラフィックを適切局在する。抑制性シナプスは、阻害足場タンパク質ゲフィリンと共局在し、シナプス小胞（VIAAT / VGAT）にGABAおよびグリシンをロード水疱性抑制性アミノ酸トランスポーターによって識別されるシナプス前抑制端末に並置された受容体表面のクラスターは、GABAで構成されています。 図2に示されている抗GFP抗体を用いた総受容体集団の免疫染色し、シナプス後抑制性足場タンパク質のゲフィリン（ 図2A）またはVIAAT（ 図2B）のいずれかに続いてBGTで標識された表面GABAARで発現ニューロンα2pHGFP+掲示板です。
図3は、αのエンドサイトーシスを示しています2 15 DIVの海馬神経細胞にGABAARを含む。パネル（ 図3A）に示すように、個々の樹状突起のBGT蛍光測定は、GFP抗体染色を介して、構築物の発現レベルに正規化される。 図3Bに示すように、時点の最終的な比較は、T = 0の測定に正規化することによって行われる。経時的な蛍光信号の変化から60分の期間（ 図3B）上の受容体の内在化の定量化（平均±SEM：T0 = 100±7.2、T15 = 74.7±12.9、T30 = 44.7±5.6、およびT60 = 19.1±3.4分T 1/2 = 26±4.8分）：）最高の37℃での（単一指数によって記述されていた。
図4に示されている別のアプローチは、ライブイメージングタイムラプス共焦点顕微鏡法により、単一のニューロンにおける受容体エンドサイトーシスに従うことです。点状と表面pHGFPの重複蛍光はGABAARとBGT Lタグ abeled受容体実験（T0）の開始時に表示されている。時間経過にわたって、BGTは受容体はエンドサイトーシスとしてpHGFP信号が原因で、新しい受容体の挿入に高いままのGABA AR信号は、減少するラベル。 phGFP信号における最小の減少は、細胞表面受容体の分布が変化し、光退色に起因する。
図1。掲示板やpHGFPのダイアグラムGABAARサブユニットとエンドサイトーシスアッセイをタグ付けされた。エンドサイトーシスは、最初の非結合毒素を除去するための簡単な洗浄を行う神経細胞や細胞に蛍光標識したブンガを印加して測定され、その後、蛍光損失が受容体であるように監視されている内部化。
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図2。掲示板やpHGFPの共焦点イメージングはGABAARは抑制性シナプスのコンポーネントと適切なローカライズを示すタグを付け。発現ニューロンα2pHGFP+ BBSにおける表面GABAARを免疫染色に続いて、α-ブンガロアレクサ594（赤）で標識し、樹状突起の引き伸ばしをするように示されている各ニューロンの権利。 （赤中のα-ブンガロアレクサ594、青、緑、ゲフィリンまたはVIAATにおけるGFP）マージされたパネル。表面BGTは、シナプス前のマーカーVIAATに）Aでシナプス後抑制性足場タンパク質のゲフィリンおよびB）並置をGABAARショーの共局在をラベル。 （スケールバーは10μm。）
図3。15 DIV海馬ニューロンにおけるGABAARエンドサイトーシスの共焦点イメージング。 A） 。B）グラフは、T = 0の正規化（エンドサイトーシスに時間をかけて表面GABAARのα-ブンガロトキシンアレクサ594蛍光損失を表し）（時点ごとに10から12の神経細胞を分析4プロセスニューロンごとに、エラーバーは）平均±SEM表す。
図4。15 DIV海馬ニューロンにおけるGABAARのエンドサイトーシスのライブ共焦点イメージング。 A）B3pHGFP +ニューロンにおける表面GABAARを含むBBS、洗浄により未結合のα-ブンガロアレクサ594について簡単に除去することにより、α-ブンガロアレクサ594（赤）でライブ標識した。ニューロンは、1分間隔（スケールバーは10μm）で20分間、HBS中、37℃で、共焦点顕微鏡で画像化した。 BGT標識GABAARsは、T0におけるpHGFP信号との共局在によって見られるように、T0で細胞表面に局在していた。時間経過にわたって、BGTは、GABA ARの信号が受容体はエンドサイトーシスとして、受容体を発現する新しいpHGFPが継続的に挿入される、減少ラベルなので、pHGFP信号がほぼ一定である。
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Discussion
ここで説明するBBS基づいて、固定技術は、生細胞株、ニューロン、および他の一次細胞における受容体または他の原形質膜タンパク質の輸送を追跡するために使用することができる。この方法は、正常膜挿入およびリガンド依存性イオンチャネルの除去およびGPCRを研究による受容体アゴニストおよびモジュレーターの存在下にトラフィッキングの変化を評価するために使用されている。重要な側面は、適切な細胞外の場所にタグの局在とBBSの添加を確実にするための制御を行う（GFPなど他の記者のための標準として）機能的に沈黙しているが含まれています。示されるように、ニコチン性アセチルコリン（nAChRの）受容体を発現する細胞で使用するためには、のnAChR拮抗ツボクラリンは、プロトコル全体で使用されている必要があります。追加のGFPタグが使用されない場合、合計BBSは、タンパク質レベルは、追加の固定後に別のフルオロフォアに結合されたα-ブンガロトキシンとpermeabilizによる染色を介して決定することができるタグ付きATION。目的の受容体/タンパク質のエンドサイトーシスの速度を測定するための時点の選択は、以上の時点の初期使用と組み合わせ、受容体/タンパク質のための人身売買の最新の知識を評価する必要があります。この技術は、容易に、従来の免疫染色に使用することができる。また、ライブ共焦点イメージング実験を通じて受容体エンドサイトーシスを追跡するための別のアプローチについて説明します。設備の可用性、ライブの実験、および他の実験制約の時間の要件は、メソッド、両方とも実行可能と公表された技術の選択をガイドします。 BBS技術の将来のアプリケーション、 すなわち 、リソソームを経由して、細胞膜や劣化にエンドソームおよび再配信をリサイクルへのターゲティング、受容体の運命に従うことをエンドソームやリソソームのマーカーと組み合わせて、ライブまたは固定画像が含まれています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
サポートは、医学のピッツバーグ大学大学院の薬理学およびケミカルバイオロジー部門からスタートアップ資金によって提供された。ニコラス·グラフ：ビデオの提出に貢献ヤコブラボメンバーの謝辞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
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