Summary
여기에서 우리는 GABA 해마 신경 세포에있는 수용체 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 측정하기 위해-bungarotoxin을 α에 결합 형광 알렉사 염료의 사용을 보여줍니다. α-bungarotoxin, 세포막 단백질의 세포 내 이입 매매 분석을 달성 할 수있는 바인딩 짧은 세포 태그 베어링 구조의 사용을 통해.
Abstract
그것은 점점 더 분명 그 이온 성 GABA 수용체 (GABAAR), 전시 매우 역동적 인 인신 매매와 세포 표면의 이동성 1-7 등의 신경 전달 물질 수용체,. 수용체 세포 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 연구하기 위해, 여기에 설명 된 기술은 세포가 α-bungarotoxin (BGT) 결합 부위 (BBS)를 포함하는 구조를 표현하는 형광 α-bungarotoxin의 사용을 결합한다. BBS (WRYYESSLEPYPD)는 높은 친화력 8,9와 BGT를 결합하는 근육 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 α 서브 유닛을 기반으로합니다. BBS 사이트의 설립 이전에 GABAA 및 대사성 GABAB의 추적 2,10 수용체에 설명 된대로, 표면의 현지화 및 수용체의 삽입 또는 외인성 형광 BGT의 응용 프로그램 제거를 측정 할 수 있습니다. BBS 사이트 또, 아미노산 및 4 표준 m 의하여 성숙한 GABAAR 소단위의 (5) 사이에 pH 민감성 GFP (pHGFP 11)을 삽입olecular 생물학 및 PCR 클로닝 전략 12 (그림 1 참조). BBS는 13 아미노산 알라닌 / 프로 링커에 의해 분리 된 pH 민감성 GFP 기자의 3 '입니다. 총의 기자가 BGT 정상화 총 수용체 인구 수용체 인구를 표시하므로 GABAAR 소단위 단백질 수준을 태그로 고정 샘플을 기반으로이 책에서 설명한 연구 인신 매매의 경우, pHGFP는 역할을한다. 이것은 태그 GABAAR 소단위의 높거나 낮은 기준선 식의 결과 BGT 염색 신호 가변성 세포 간을 최소화한다. 또한 pHGFP 태그 라이브 또는 고정 이미징 실험을위한 구조 발현하는 세포를 쉽게 식별 할 수 있습니다.
Introduction
의 형광 수용체 현지화 및 역학을 연구하는 α-bungarotoxin을 결합 사용은 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 13-15, 독소의 내생 대상의 연구에서 개척되었다. 그 후, 최소한의 BGT 바인딩 펩타이드 (BBS)의 결합은 두 흥분성과 억제 리간드 게이트 이온 채널 및 G 단백질 결합 수용체 2,10,16-21의 인신 매매를 연구하는 데 사용되었습니다. 이 BBS 기반 기술은 표면의 바이오 티 닐화 방법, 세포 항원에 대한 항체와 살아있는 세포의 항체 라벨 및 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구와 같은 인신 매매의 연구에 사용되는 다른 방법에 이점을 제공한다. 세포 표면 동안 바이오 티 닐화 무료 아민이 공유 결합으로 세포 활동에 영향을 미칠 가능성과 함께 수정됩니다. 항체 기반의 연구는 종종 인신 매매 이벤트를 변경할 수있는 표면 항원의 클러스터링이나 모자를 씌우기에 의해 방해되었다. 때문에 FRAP들에 대한 표백 단계에tudies, 중요한 문제는 기본 세포 구조를 손상된다. 추가적인 장점은 BBS는 구조도 바이오틴 결합 엉덩이에 bungarotoxin 수용체 인신 매매와 생화학 적 방법에 사용할 수있는 태그입니다. 이 기술은 세포주 및 일차 전지가 쉽게 적용 가능하다. 표시된 바와 같이 니코틴 아세틸 콜린 (nAChR의) 수용체를 발현하는 세포에 사용하기위한, nAChR의 길항제 tubocurarine는 프로토콜에서 사용되어야한다. tubocurarine의 부재에 형질 감염되지 않은 세포 (엔도 시토 시스 프로토콜 T = 0 시점에 해당) 간단한 표면 BGT 라벨을 수행하면 내생 nAChR의 증거를 제공 할 것입니다.
그것은 또한 단백질이 세포막에 전달되는 세포의 위치에 존재하도록 이러한 기술을 사용하기위한 중요한 고려 사항은 BBS의 적절한 삽입이다. 예를 들어, GABAAR 서브 유닛의 N-말단 도메인은 인신 동안 기공을 갖는 루멘에 상주ficking 및 세포 표면 수용체와 세포 내 이입에 의해 이벤트가 세포 표면에서 그들의 제거의 평가의 구체적인 표시를 허용 세포막에있는 수용체 삽입 후 세포가된다. 우리는 이전에 GFP, MYC, 또는 BBS의 추가 GABAAR 서브 유닛이 도메인에 항원 것으로 나타났습니다 것은 기능적으로 침묵이다. 표준 컨트롤은 적절 지역화 것을 태그로 단백질을 구성하는 태그없는 유사한 수준으로 발현 될 수 있도록 수행되고, 그것은 수용체 기능에 영향을주지해야한다. 형질 구조의이 특성은 문제 해결의 과발현 문제에 도움이됩니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 프로토콜은 IACUC 의학의 피츠버그 대학의 대학의 IRB 제도 평가 보드에 따른다.
1. 조직 문화 후드에있는 해마 신경 세포 배양의 준비
주 : 1 프로토콜에 걸쳐 사용 멸균 기술과 시약.
- 신경 세포의 배양 기질로 폴리-D-라이신 (0.1 ㎎ / ㎖의 H 2 O) 코팅 된 유리 커버 슬립을 준비합니다.
- 각 3.5 cm 조직 배양 접시 안에 4-5 라운드 유리 커버 슬립을 놓습니다.
- 각 12mm의 coverslip에 위에 자리 70 ㎕의 폴리-D-라이신. 참고 : 라이브 영상을 위해, 유리는 3.5 cm의 조직 배양 접시 (내장 14mm 유리 커버 슬립에 200 ㎕의 폴리-D-라이신 자리)를 사용할 수 있습니다 바닥.
- 조직 문화 후드의 O / N.에 준비된 요리를 남겨 폴리-D-라이신 증발을 최소화하고 조직 문화 후드에서 멸균 표면을 유지, 창틀을 닫고 일을 해제하려면전자 송풍기 O / N. 참고 : UV 빛은 O / N 배양 중에 사용되지 않습니다.
- 다음날 아침 씻어 요리 H 2 O 2 ㎖로 3 배
- 2 O 세척 마지막 H를 제거한 후, 각 3.5 cm 접시에 미디어 2 ㎖를 추가하고 단계 1.4에 신경을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 접시를 둡니다.
- 해마 신경 세포는 배아 일 18-19 (Goslin 22에서 수정) (E18-19) 쥐에서 준비가되어 있습니다.
- maxiprepped 구조의 DNA의 1-4 μg과 배양의 날에 갓 해리 신경 세포를 형질.
참고 : 일반적으로 DNA의 3 μg 50 %의 생존과 2 백만 신경 세포로 시작하는 60 %의 형질 전환 효율 (예 :와, 1-2000000 신경 세포로 형질 전환된다 : ((2 × 10 6 뉴런 × 0.5) 0.6)를 제공합니다 약 1 백만 신경;..의 잠재적 인 문제를 해결할 때 1을 형질 600,000있는 구조의 DNA의 다른 양의 형질 전환 될 수있다구조의 현지화 및 기능의 적절한 특성 다음에 표현. - 3.5 cm 접시 당 약 20 만 뉴런의 최종 밀도 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 슬립에 형질 전환 된 뉴런을 접시. 참고 : 유리 접시를 바닥에, 14mm 유리 지역에 4 만 ~ 5 만 신경을 접시.
- 미디어에게 연결을 문화의 준비 후 4-24 시간을 교체 한 후 뉴런은 체외 (DIV) 또는 원하는 단계에서 14~17일 때까지 인큐베이터에서 개발할 수 있습니다.
2. 엔도 시토 시스의 분석
주의 : α-bungarotoxin 및 tubocurarine 폐기물 및 취급시주의 사항 :
- 모든 펩타이드 신경 독소의 처리는 바이오 안전성 레벨 2 (BL-2) 연구 프로토콜의 가이드 라인에 좋습니다. 모든 적절한 개인 보호 장비를 착용해야한다. 동결 건조 독소 분말은 제조 업체의 지침에 따라 재구성해야한다. 독소 폐기물 수오LD는 통치 기관의 환경, 보건 및 안전 지침을 준수하여 폐기 될 수있다.
- 저장 중에 형성 할 수있는 잠재적 인 펩티드 응집물을 제거하고, α-bungarotoxin 분취 량은 사용 전에 잠깐 원심 분리되어야하고, 상청액은 실험을 위해 사용되어야한다.
- α-bungarotoxin (BGT) 주식은 -20 ℃에서 멸균 H 2 O 1 ㎎ / ㎖의 농도로 재현 탁하고 10 ㎕의 분취 량에 저장됩니다 형광 결합 BGT의 주식은 3 ㎍ / ml로 사용된다. Tubocurarine 150 μM의 최종 농도로 사용된다.
- 위에 얇은 알루미늄이나 스테인리스 강판 차가운 방에서 16 ° C로 설정 벤치 탑 히터 블록. 가능한 경우 또는, 벤치 탑 냉각 / 가열 장치는 16 ° C를 필요로하는 각 단계에 사용할 수 있습니다
- 밀리미터에 포함 쿨 세포 헤 페스 완충 식염수 (HBS : 135의 NaCl, 4.7 KCl을, 10 HEPES, 11 포도당, 1.2 MgCl2를, 2.5염화칼슘, 물을 욕조에 16 ° C에 산도 7.4).
- 16 ° C에서 알루미늄 판에 전송 신경 세포의 요리를 5 분 동안 차가운.
- 용지를 제거하고 (단계 2.8, 엔도 시토 시스의 시간을 분석 포인트를 인큐베이터에서 에어컨 미디어 및 예비 유지) 2 분 동안 16 ° C HBS +의 tubocurarine (150 μM)의 1 ㎖로 대체합니다.
- 라벨 표시 한 폐기 용기에 HBS + tubocurarine를 제거하고 알렉사 594 [3 ㎍ / ㎖의], 15 분 동안 16 ° C에서 배양 1 ㎖ 16 ° C HBS +의 tubocurarine (150 μM) + α-bungarotoxin로 교체.
- 제거 HBS + tubocurarine + α-bungarotoxin 알렉사 594 (세척 50 % 표백제 50 ㎖를 포함하는 진공 플라스크에 흡입을 통해 수집 할 수 있습니다) 폐기물 컨테이너를 표시하고 요리를 16 ° C HBS의 2 ㎖로 3 배 세척합니다.
- 유리를 사용하여 수용체 엔도 사이토 시스를 따르는 라이브 영상 시계열 실험은 3.5 cm 배양 접시 바닥의 경우, 단계 2.1-2.6를 수행 가열 단계로 요리를 전송(펠티어 소자) 현미경과 공 초점 또는 TIRF 현미경 설정으로 촬영을 시작한다.
- 2.9 단계로 다른 커버 슬립을 계속, 20 분 동안 RT 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 % 자당의 접시에 T = 0 시점의 coverslips을 전송합니다.
- 다른 시간 지점의 경우와 HBS 교체 37 ° C 미디어 (단계 2.4에 예약) 및 37 ° C. 주에서 엔도 사이토 시스를위한 인큐베이터에 반환이 평형 에어컨 : 추가 시간 T = 15 점, 30, 60를 제안했다.
- 시점에서 필요한, 인큐베이터에서 접시를 취할 RT DPBS 2 ㎖로 빠르게 두 번 세척 (더 칼슘, 마그네슘을 DPBS 없음) 한 후 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 %의 자당에 고정합니다.
- 20 분 고정 후, 용기를 낭비하고 2 ㎖ RT DPBS로 두 번 설거지를 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 %의 자당을 제거합니다.
- 면역 형광 블록 용액에 10 분 동안 RT에서 커버 슬립을 배양한다 (블록 용액 = DPBS에 5 % 말 혈청, 0.5 % BSA) permeabil 위하여 0.2 % 트리톤 X-100을 함유신경이지는 세포 내 수용체 수영장 및 / 또는 관심의 다른 단백질의 라벨의 안티 GFP 면역 염색을 가능하게합니다.
- 블록 + 0.2 % 트리톤 X-100을 제거하고 20 ~ 30 분 동안 트리톤 X-100하지 않고 면역 블록 솔루션의 coverslips을 품어.
- 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 몇 시간 동안 블록에 커버 슬립의 기본 항체 배양을 수행 참고 : 4 ° CO / N에서 예비 선거와 커버 슬립의 배양이 일상적으로 향상된 면역 결과를 얻을 수 있습니다.
- 워시 DPBS (각 세척 단계에 대한 5 분)와 함께 배를 커버 슬립.
- 실온에서 1 시간 동안 차단 솔루션 차 항체와의 coverslips을 품어.
- 워시 DPBS (각 세척 단계에 대한 5 분)와 함께 배를 커버 슬립.
- 개별적으로 커버 슬립을 처리 마운트 커버 슬립이 : 실험실 조직과 커버 슬립의 뒷면에서 물기를 제거한 다음 유리 슬라이드에 장착 매체의 4 μL에 커버 슬립을 반전.
- 실온에서 건조 슬라이드 생 후 30 분 동안 적용 허용4 ° C에서 광석 현미경을 수행 할 준비가 될 때까지.
- 이미지 수집 및 공 초점 현미경 (실험 조건에 블라인드)와 실험의 분석. 60X 오일 NA 다음 레이저와 1.49 침수 목적 : 아르곤 가스를 488 나노 미터, 561 다이오드, 640 다이오드.
- 동일한 화상 취득 설정을 사용하여, 신경 세포의 세포체 및 포커스 몇개 수지상 프로세스와 단일 Z 단면 이미지를 얻기.
- 모든 엔도 시토 시스 데이터의 분석에 대해 동일한 임계 값을 사용하여, 신경 세포 당 3 ~ 4 근위 수상 돌기의 20 μm의를 따라 α-bungarotoxin 알렉사 형광 신호 및 GFP의 면역 염색을 정량화.
- 여러 독립적 인 연결을 문화와 실험을 반복, 각 시점에 10-12 뉴런에서 데이터를 분석 할 수 있습니다.
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Representative Results
BBS 태그 구조의 특성이 같은 표현 단백질 (특히 여러 개의 서브 유닛으로 구성 수용체)가 제대로 조립 여부를 결정하는 중요한 컨트롤이 포함되어, 세포 표면에 교통 정체를 적절하게 지역화. 억제 시냅스는 억제 비계 단백질 gephyrin와 colocalize과 시냅스 소포 (VIAAT / VGAT)에 GABA와 글리신을로드하는 기공 억제 아미노산 수송에 의해 확인 시냅스 억제 터미널, 나란히 놓여있다 수용체 표면 클러스터는 GABA로 구성된다. α2pHGFP + BBS는 안티 GFP 항체와 시냅스 억제 비계 단백질 gephyrin (그림 2A) 또는 VIAAT (그림 2B) 중 하나와 전체 수용체 인구에 대한 면역 염색 한 다음 BGT으로 표시 표면 GABAAR과 뉴런을 표현하는 그림 2에 표시됩니다.
그림 3은 α의 엔도 시토 시스를 보여줍니다2 15 DIV에서 해마 신경 세포에서 GABAAR를 포함. 패널 (도 3a)에 도시 된 바와 같이 개별 수지상 프로세스 BGT 형광 측정은 GFP 항체 염색을 통한 구조체의 발현 레벨로 정규화된다. 도 3b에 도시 된 바와 같이 시점의 최종 비교는, T = 0 측량 정규화 제. 시간이 지남에 따라 형광 신호의 변화에서 60 분 동안 (그림 3B)를 통해 수용체의 내면화의 정량 (SEM ± 평균 : T0 = 100 ± 7.2, T15는 = 74.7 ± 12.9, T30 = 44.7 ± 5.6, 및 T60은 = 19.1 ± 3.4 분 T 1 / 2 = 26 ± 4.8 분)) 최고 37 º C에서 (하나의 지수에 의해 설명되었다.
그림 4와 같이 다른 방법은, 라이브 영상 시간 경과 공 초점 현미경으로 단일 신경 세포의 수용체 엔도 사이토 시스를 수행하는 것입니다. 표면 pHGFP의 반점이 중복되는 형광 GABAAR와 BGT L 태그 abeled 수용체 실험 (T0)의 시작에서 볼 수있다. 시간 과정 동안, BGT는 수용체 endocytose로 pHGFP 신호 인해 새로운 수용체 삽입을 높게 유지하면서 GABA의 AR 신호가 감소 표지. phGFP 신호에 최소한의 감소는 세포 표면 수용체 분포 변화 및 광표백에 기인한다.
그림 1. BBS와 pHGFP의 다이어그램 GABAAR 서브 유닛과 엔도 시토 시스 분석 태그. 엔도 시토 시스가 처음으로 결합되지 않은 독소를 제거하는 간단한 세척 한 다음 신경 세포 또는 세포에 형광 표지 bungarotoxin을 적용하여 측정 한 다음 형광 손실이 수용체가 같이 모니터링 내면화.
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BBS와 pHGFP의 그림 2. 공 촛점 이미징 억제 시냅스의 구성 요소와 적절한 현지화를 보여주는 GABAAR 태그. 신경 세포는 α-bungarotoxin 알렉사 594 면역 염색 한 다음 (빨간색)으로 표시 한 표현 α2pHGFP + BBS에 GABAAR 표면, 수상 돌기의 대형화가에 표시됩니다 각 신경 세포의 권리. 합병 패널 (파란색 α-bungarotoxin 빨간색 알렉사 594, GFP 녹색, gephyrin 또는 VIAAT). 표면 BGT는 시냅스 마커 VIAAT에)와 시냅스 억제 비계 단백질 gephyrin 및 B) 동격을 GABAAR 쇼 colocalization을 레이블. (스케일 바, 10 μm의.)
그림 3. 15 DIV 해마 신경 세포에있는 GABAAR의 엔도 시토 시스의 공 촛점 이미징. A) B) 그래프 알렉사 분석 4 프로세스, 시점 10-12 뉴런 () T = 0 (정규화 된 엔도 사이토 시스와 시간에 594 형광 손실을 표면 GABAAR의 α-bungarotoxin를 나타냅니다 있습니다 신경 세포 당, 오차 막대) ± SEM을 뜻 나타냅니다.
그림 4. 15 DIV 해마 신경 세포에서 GABAAR의 엔도 시토 시스의 공 촛점 이미징을 살고 있습니다. A) B3pH신경 세포의 표면 GABAAR를 포함 GFP + BBS 라이브 표지 α-bungarotoxin 알렉사 594 세탁에 의한 언 바운드 α-bungarotoxin 알렉사 594의 간단한 제거 다음에 (빨간색)로했다. 신경 세포는 1 분 간격 (스케일 바, 10 μm의)에서 20 분 동안 HBS에서 37 ° C에서 공 초점 현미경으로 몇 군데 있었다. T0에서 pHGFP 신호 colocalization을 볼로 BGT 레이블 GABAARs은 T0에서 세포 표면에 국소했다. 시간 과정 동안, BGT는 GABA의 AR 신호 수용체 endocytose으로서, 수용체를 발현하는 신규 pHGFP 지속적으로 삽입되고, 레이블이 감소하므로 pHGFP 신호는 거의 일정하게 유지된다.
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Discussion
여기에 설명 BBS 기반 고정 라이브 기법 수용체 또는 세포주, 뉴런, 및 다른 프라이 머리 셀의 다른 세포막 단백질 매매를 추적하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 성공적 막 삽입 및 리간드 관문 이온 채널과 GPCR의 제거를 연구 인해 수용체 작용제 및 조절제의 존재로 매매의 변화를 평가하기 위해 사용되었다. 주요 측면은 적절한 세포 위치 태그의 현지화 및 BBS의 추가를 확인하기 위해 컨트롤을 수행 (예 : GFP와 같은 다른 기자들에 대한 표준) 기능 침묵 있습니다. 표시된 바와 같이 니코틴 아세틸 콜린 (nAChR의) 수용체를 발현하는 세포에 사용하기위한, nAChR의 길항제 tubocurarine는 프로토콜에서 사용되어야한다. 추가적인 GFP 태그가 사용되지 않는 경우에는, 전체 BBS 단백질 수준은 고정 및 permeabiliz 후에 다른 형광 물질에 결합 부가 α-bungarotoxin로 염색을 통해 결정될 수있다 태그ATION. 관심의 수용체 / 단백질의 세포 내 이입 속도를 측정하는 시점의 선택은 더 많은 시간이 지점의 초기 사용과 결합 수용체 / 단백질에 대한 인신 매매의 현재 지식을 평가가 필요합니다. 이 기술은 종래의 면역 염색으로 용이하게 사용될 수있다. 우리는 또한 라이브 공 촛점 이미징 실험을 통해 추적 수용체 엔도 사이토 시스에 대한 대체 방법을 설명합니다. 장비의 가용성, 라이브 실험과 다른 실험적인 제약에 대한 시간 요구 사항이 방법 모두 존재 가능한 및 출판 기술의 선택을 안내 할 것입니다. BBS 기술의 미래 응용 프로그램 즉, 리소좀을 통해 세포막 또는 저하 엔도 좀하고 다시 배달을 재활용 대상, 수용체의 운명을 따라 엔도 좀과 리소좀 마커와 함께 라이브 또는 고정 이미징 (가) 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
지원은 의학의 피츠버그 대학의 학교에서 약리학 및 화학 생물학과에서 시작 - 기금에 의해 제공되었다. 니콜라스 그라프 : 비디오 제출에 기여 야곱 실험실 구성원의 확인.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
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