Summary
Her kan vi demonstrere bruk av fluorescerende Alexa fargestoff koblet til α-bungarotoxin å måle GABA A-reseptoren overflaten lokalisering og endocytose i hippocampus nevroner. Gjennom bruk av konstruksjoner som bærer en kort ekstracellulære tag som binder α-bungarotoxin, kan analyse av plasma membran protein endocytic menneskehandel oppnås.
Abstract
Det er stadig tydeligere at nevrotransmitterreseptorer, inkludert ionotrofe GABA A-reseptorer (GABAAR), utviser svært dynamisk menneskehandel og celleoverflaten mobilitet 1-7. Å studere reseptor celleoverflaten lokalisering og endocytose, teknikken beskrevet her kombinerer bruk av fluorescerende α-bungarotoxin med celler uttrykker konstruksjoner som inneholder en α-bungarotoxin (Bgt) bindingssetet (BBS). Den BBS (WRYYESSLEPYPD) er basert på α-underenheten av muskelen nikotin-acetylcholin reseptoren, som bindes med høy affinitet Bgt 8,9. Inkorporering av BBS området tillater overflate lokalisering og måling av reseptor innsetting eller fjerning med anvendelse av eksogen fluorescerende Bgt, som tidligere beskrevet i sporing av GABAA-og metabotropic GABAB reseptorer 2,10. I tillegg til den BBS side, settes inn vi et pH-følsomt GFP (pHGFP 11) mellom aminosyrene 4 og 5 i det modne GABAAR subenheten av standard molecular biologi og PCR kloning strategier (se figur 1) 12. BBS er 3 'av pH-sensitive GFP reporter, atskilt med en 13-aminosyre alanine / prolin linker. For menneskehandel studier beskrevet i denne publikasjonen som er basert på faste prøver, serverer pHGFP som reporter for total tagget GABAAR subenhet protein nivåer, slik at normalisering av Bgt merket reseptor befolkningen til total reseptor befolkningen. Dette minimerer celle til celle Bgt flekker signal variasjon som følge av høyere eller lavere baseline uttrykk for de merkede GABAAR subenheter. Videre pHGFP tag muliggjør enkel identifisering av konstruere uttrykke celler for live eller faste bildebehandling eksperimenter.
Introduction
Bruken av fluorescensmerket koplet α-bungarotoxin å studere reseptor-lokalisering og dynamikk ble utviklet i studier av den nikotin-acetylcholin reseptoren 13-15, toksinet er endogene målet. Senere har innlemmelse av minimal Bgt bindende peptid (BBS) blitt brukt til å studere smugling av både stimulerende og hemmende ligandstyrte ionekanaler og G protein koblede reseptorer 2,10,16-21. Dette BBS-baserte teknikken gir fordeler til andre tilnærminger som brukes for menneskehandel studier som overflate biotinylering metoder, antistoff merking av levende celler med antistoffer mot ekstracellulære epitoper, og fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP). I løpet av celleoverflate biotinylering frie aminer er kovalent modifisert, med mulighet for å påvirke cellulær aktivitet. Antistoff baserte studier har ofte blitt hemmet av overflateantigen clustering eller tildekking, som kan endre trafficking hendelser. På grunn av den bleketrinn for FRAP studies, er en viktig bekymring skade den underliggende cellestruktur. En ekstra fordel er at BBS merket konstruksjoner kan også brukes til biokjemiske metoder med biotin-coupled bungarotoxin til asses reseptor menneskehandel. Denne teknikken kan anvendes lett til cellelinjer og primære celler. For bruk i cellene som uttrykker nikotin acetylkolin (nAChR) reseptorer, må nAChR antagonist tubocurarine brukes gjennom hele protokollen som angitt. Utføre en enkel overflate Bgt merking (ekvivalent med T = 0 tidspunktet for endocytose protokoll) på untransfected celler i fravær av tubokurarin vil gi bevis på endogen nAChR.
En viktig faktor for å bruke denne teknikken er egnet for innsetting i BBS slik at den er til stede ved et ekstracellulært sted når proteinet av interesse blir levert til plasmamembranen. For eksempel, de N-terminale domener av GABAAR subenheter bor i de vesicula lumen under traneskehandel og bli ekstracellulært etter reseptor innsetting i plasmamembranen, slik at spesifikk merking av celleoverflatereseptorer og vurdering av deres fjerning fra celleoverflaten ved endocytiske arrangementer. Vi har tidligere vist at tilsetning av GFP, myc eller BBS-epi-toper i dette domenet av GABAAR subenheter er funksjonelt stille. Standardkontroller bør utføres for å sikre at den kodede protein er uttrykt på tilsvarende nivå i et ukodet konstruksjon, at det på riktig lokalisert, og at den ikke påvirker reseptorfunksjonen. Dette karakterisering av transfekterte konstruksjoner vil også hjelpe til med feilsøking høyekspresjonsystemer bekymringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller som er beskrevet nedenfor er i samsvar med IACUC og IRB institusjonelle vurderingskomiteer ved University of Pittsburgh School of Medicine.
En. Utarbeidelse av Hippocampus Neuronal kulturer i Tissue Culture Hood
Merk: Bruk steril teknikk og reagenser gjennom protokoll 1.
- Forbered poly-D-lysin (0,1 mg / ml i H 2 O)-belagt glass dekkglass som et substrat for den neuronale kulturen.
- Plasser 4-5 runde glass Dekk inne hver 3,5 cm vev kultur parabolen.
- Spot 70 mL poly-D-lysin på hver 12 mm dekkglass. Merk: for live bildebehandling, en glassbunn 3,5-cm vev kultur fatet kan brukes (øye på 200 mL poly-D-lysin på innebygd 14 mm glass dekkglass).
- La de tilberedte retter i vevskultur panseret O / N. For å minimere poly-D-lysin fordampning og holde overflater sterile i panseret vev kultur, legge ned vindusrammen og slå av the blåser O / N. Merk: UV-lys er ikke brukt under O / N inkubasjon.
- Den neste morgen, ta oppvasken 3x med 2 ml H 2 O.
- Etter å ha fjernet den siste H 2 O vask, tilsett 2 ml av media til hver 3,5 cm tallerken og la retter i kuvøse til den er klar til plate nervecellene i trinn 1.4.
- Hippocampus nevroner er forberedt fra embryonale dag 18-19 (E18-19) rotter (modifisert fra Goslin 22).
- Transfektere fersk dissosiert nevroner på dagen for dyrking med 1-4 mikrogram av maxiprepped konstruere DNA.
Merk: typisk 3 pg av DNA transfekteres i 1-2 millioner nevroner, med en levedyktighet på 50% og en transfeksjon virkningsgrad på 60% (for eksempel fra og med 2 millioner neurons: ((2 x 10 6 nevroner x 0,5) 0,6) gir ca 1 million nerveceller;.. 600 000 av disse er transfektert en ulike mengder konstruere DNA kan bli tilført når feilsøking potensielle problemer avover-ekspresjon, etterfulgt av hensiktsmessig karakterisering av konstruktet lokalisering og funksjon. - Plate de transfekterte nevroner på poly-D-lysin belagt dekkglass på en endelig tetthet på ca 200 000 nevroner pr 3,5 cm parabolen. Merknad: for en glassbunn fatet, plate 40,000-50,000 nevroner på 14 mm glass området.
- Bytt media 4-24 timer etter tilberedning av nevrale kulturer, så la nevroner å utvikle seg i inkubatoren inntil 14-17 dager in vitro (DIV) eller ønsket scene.
2. Endocytose analysen
FORSIKTIG: Merk på α-bungarotoxin og tubocurarine avfall og håndtering:
- Håndtering av alle peptid nervegifter anbefales innenfor retningslinjene for biosikkerhet Level-2 (BL-2) forskningsprotokoller. Alt riktig personlig verneutstyr må brukes. Lyofiliserte toksin pulver bør rekonstitueres etter produsentens anvisninger. Toksin avfall shoukastes ld av i samsvar med den styrende institusjonens miljø helse og sikkerhet retningslinjer.
- For å fjerne eventuelle aggregater peptid som kan ha blitt dannet under lagring, bør α-bungarotoxin alikvoter sentrifugeres kort før bruk, og supernatanten brukes for forsøket.
- α-bungarotoxin (Bgt) stocks ble resuspendert til en konsentrasjon på 1 mg / ml i sterilt H2O og lagret i 10 mL alikvoter ved -20 ° C. Fluorescently kombinert BGT aksjer blir brukt på 3 mg / ml. Tubokurarin blir brukt ved en sluttkonsentrasjon på 150 uM.
- Sett benk topp varmeapparat blokk til 16 ° C i kaldt rom med tynn aluminium eller rustfritt stål plate på toppen. Alternativt, hvis det finnes, en benketopp kjøle / oppvarmingsinnretning kan anvendes for hvert trinn som krever 16 ° C.
- Kul ekstracellulære Hepes-bufret saltløsning (HBS inneholdende i mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 glukose, 1,2 MgCl2, og 2,5CaCl 2, pH 7,4) til 16 ° C i et vannbad.
- Transfer neuron retter til aluminiumsplate ved 16 ° C og avkjøles i 5 min.
- Fjern media (holde klimaanlegg media og reserve i inkubator for trinn 2.8, endocytose analysen tidspunkter) og erstatte med en ml av 16 ° C HBS + tubocurarine (150 mm) for 2 min.
- Fjern HBS + tubokurarin til merket avfallsbeholder og erstatte med 1 ml 16 ° C HBS + tubokurarin (150 uM) + α-bungarotoxin Alexa 594 [3 pg / ml], inkubering ved 16 ° C i 15 min.
- Fjern HBS + tubokurarin + α-bungarotoxin Alexa 594 til merket avfallsbeholderen og vaske 3 ganger med 2 ml av 16 ° C HBS (de vasker kan samles via inhalering i en vakuum-kolbe inneholdende 50 ml av 50% blekemiddel).
- For levende avbildning tidsserie eksperimenter følgende reseptor endocytose ved hjelp av en glassbunn 3,5 cm kultur fatet, utfør trinn 02.01 til 02.06, deretter overføre retten til oppvarmet scenen(Peltier-enhet) på mikroskop, og begynne bildebehandling med en confocal eller TIRF mikroskop oppsett.
- Overfør T = 0 tidspunkt Dekk inn et fat med RT 4% paraformaldehyde / 4% sukrose i 20 min, fortsetter med andre dekkglass til trinn 2.9.
- For andre tidspunkter, erstatte HBS med klimaanlegg ekvilibrerte 37 ° C media (reservert i trinn 2.4) og gå tilbake til inkubator for endocytose ved 37 ° C. Merk: foreslo flere tidspunkter av T = 15, 30 og 60 år.
- På tidspunkter nødvendig, ta retter fra inkubator, vaske raskt to ganger med 2 ml RT DPBS (DPBS ingen kalsium, magnesium) deretter fikse i 4% paraformaldehyde / 4% sukrose i 20 min.
- Etter 20 min fiksering, fjerne fire% paraformaldehyde / 4% sukrose å kaste bort beholderen og vaske to ganger med 2 ml RT DPBS.
- Inkuber dekkglass ved RT i 10 min i immunfluorescens blokk-løsning (blokk-løsning = 5% hesteserum, 0,5% BSA i DPBS) inneholdende 0,2% Triton X-100 for å permeabilize neuronene og muliggjøre anti-GFP farging av intracellulær reseptor bassenget og / eller merking av andre proteiner som er av interesse.
- Fjern blokk + 0,2% Triton X-100 og inkuber dekkglass i immunfluorescens blokk oppløsning uten Triton X-100 i 20 til 30 min.
- Utfør primære antistoff inkubasjoner av dekkglass i blokk i flere timer ved RT eller O / N ved 4 ° C. Merk: inkubasjon av dekkglass med primærvalg ved 4 ° CO / N produserer rutinemessig bedre immunofluorescence resultater.
- Vask Dekk 3x med DPBS (5 min for hvert vasketrinn).
- Inkuber Dekkglass med sekundære antistoffer i blokk-løsning i 1 time ved RT.
- Vask Dekk 3x med DPBS (5 min for hvert vasketrinn).
- Mount Dekk, håndtering hver dekk individuelt: fjerne overflødig væske fra baksiden av dekkglass med lab vev, så speildekkglass på 4 pl av monteringsmedium på et glass lysbilde.
- Tillat lysbilder til tørk på RT dekket for 30 minutter da stmalm ved 4 ° C inntil de er klare til å utføre mikroskopi.
- Bilde innsamling og analyse av eksperimenter med konfokalmikroskopi (blind for eksperimentell tilstand). 60X olje NA 1,49 nedsenking objektiv med følgende lasere: Argon gass 488 nm, 561 diode, 640 diode.
- Bruke samme bilde kjøp innstillinger, skaffe enkelt Z seksjons bilder med nevronale cellekroppen og flere dendrittiske prosesser i fokus.
- Kvantifisere α-bungarotoxin Alexa fluorescens signal og GFP farging sammen 20 mikrometer av 3-4 proksimale dendritter per nevron, med samme terskel for analyse av alle endocytose data.
- Analyser av data 10-12 neuroner for hvert tidspunkt, å gjenta forsøket med flere uavhengige neuronale kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av et BBS tagget konstruksjon omfatter viktige kontroller slik som å bestemme om det uttrykte protein setter sammen på riktig måte (spesielt med reseptorer er sammensatt av flere underenheter), traffics til celleoverflaten, og lokaliserer hensiktsmessig. Hemmende synapser er sammensatt av GABA A-reseptoren overflate klynger som colocalize med hemmende scaffoldprotein gephyrin og er apposed til presynaptiske hemmende terminaler, identifisert av vesikulær hemmende aminosyre transporter som laster GABA og glysin i synaptiske vesikler (VIAAT / VGAT). Vist i figur 2 er α2pHGFP + BBS uttrykke neuroner med overflate GABAAR merket med Bgt, etterfulgt av farging for total reseptor populasjon med anti-GFP antistoff og enten den postsynaptiske hemmende scaffoldprotein gephyrin (figur 2A), eller VIAAT (figur 2B).
Figur 3 viser endocytose av α2 inneholder GABAAR i hippocampus nevroner ved 15 DIV. BGT fluorescens-målinger av individuelle dendrittiske prosesser som er vist på panelene (figur 3A) er normalisert til nivået av konstrukt ekspresjon via GFP antistoffarging. Endelig sammenlikning av tidspunktene er laget ved normalisering til T = 0 måling, som vist i figur 3B. Kvantifisering av internalisering av reseptorer enn en 60 min periode (Figur 3B) fra fluorescens signal endringer over tid (Mean ± SEM: T0 = 100 ± 7.2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6, og T60 = 19,1 ± 3,4 min ) var best beskrives ved en enkel eksponentiell (ved 37 ° C: t 1/2 = 26 ± 4,8 min).
En alternativ tilnærming, vist i figur 4, er å følge reseptor endocytose i en enkelt neuron av levende avbildning time-lapse konfokal mikroskopi. Den punctate og overlappende fluorescens av overflaten pHGFP tagget GABAAR og Bgt l abeled reseptorer er synlig i starten av eksperimentet (T0). Over tid selvfølgelig, Bgt merket GABA AR signal avtar, som reseptorer endocytose, mens pHGFP signalet forblir høy på grunn av ny reseptor innsetting. Den minimal reduksjon i phGFP signalet er på grunn av celleoverflatereseptoren fordelings endringer og fotobleking.
Figur 1. Diagram av en BBS og pHGFP tagget GABAAR subenhet og endocytose assay. Endocytose måles ved først å påføre en fluorescensmerkede bungarotoxin til neuroner eller celler, etterfulgt av en kort vask for å fjerne ubundet toksin, så fluorescens tap overvåkes som reseptorer er internalisert.
jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Confocal avbildning av BBS og pHGFP tagget GABAAR viser hensiktsmessig lokalisering med hemmende synapse komponenter. Surface GABAAR i α2pHGFP + BBS uttrykke nevronene ble merket med α-bungarotoxin Alexa 594 (rød), etterfulgt av farging, er utvidelser av dendritter vist til høyre for hver nervecelle. Fusjonert panel (α-bungarotoxin Alexa 594 i rødt, GFP i grønt, gephyrin eller VIAAT i blått). Overflate Bgt merket GABAAR showet colocalization med A) den postsynaptiske hemmende scaffoldprotein gephyrin og B) stilling mot den presynaptiske markør VIAAT. (Scale barer, 10 mikrometer.)
Figur 3. Confocal avbildning av GABAAR endocytose i 15 DIV hippocampus nevroner. A) B) Graf representerer overflaten GABAAR α-bungarotoxin Alexa 594 fluorescens tap over tid med endocytose (normalisert til T = 0) (10-12 nevroner per tidspunkt, 4 prosesser analysert per nevron; feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM).
Figur 4. Lev confocal avbildning av GABAAR endocytose i 15 DIV hippocampus nevroner. A) B3pHGFP + BBS som inneholder overflate GABAAR i nevroner var levende-merket med α-bungarotoxin Alexa 594 (rød), fulgt av kort fjerning av ubundet α-bungarotoxin Alexa 594 ved vasking. Neuroner ble fotografert ved konfokal mikroskopi ved 37 ° C i HBS i 20 min ved 1 min intervall (Skala barer, 10 um). BGT Merkede GABAARs ble lokalisert til celleoverflaten ved T0, som sett av colocalization med pHGFP signal på T0. Over tid selvfølgelig, Bgt merket GABA AR signal avtar, som reseptorer endocytose, er ny pHGFP uttrykker reseptorer stadig satt inn, slik at pHGFP signalet forblir nesten konstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De BBS baserte faste og levende teknikker som er beskrevet her kan brukes til å spore-reseptor eller et annet plasma membran protein handel med cellelinjer, nerveceller, og andre primære celler. Denne fremgangsmåten har blitt brukt til å studere membran innsetting og fjerning av ligand-gated ionekanaler og GPCR og vurdere endringer i handel på grunn av tilstedeværelsen av reseptoragonister og modulatorer. Viktige aspekter er hensiktsmessig lokalisering av koden til et ekstracellulært sted og utfører kontroller for å sikre at tillegg av BBS (som standard for andre journalister, som for eksempel GFP) er funksjonelt stille. For bruk i cellene som uttrykker nikotin acetylkolin (nAChR) reseptorer, må nAChR antagonist tubocurarine brukes gjennom hele protokollen som angitt. I det tilfellet hvor den ytterligere GFP taggen ikke benyttes, totalt BBS kodede proteinnivå kan bestemmes via farging med en ytterligere α-bungarotoxin koplet til et annet fluoroforen etter fiksering og permeabilizasjon. Valg av tidspunkt for måling av endocytose priser av reseptoren / protein av interesse krever å vurdere den nåværende kunnskap om menneskehandel for reseptoren / protein, kombinert med førstegangs bruk av flere tidspunkter. Denne teknikk som også lett kan anvendes sammen med konvensjonelle farging. Vi beskriver også en alternativ tilnærming for sporing reseptor endocytose via live-confocal bildebehandling eksperimenter. Tilgjengelighet utstyr, vil tidskrav for virkelige eksperimenter, og andre eksperimentelle begrensninger veilede valg av metode, både å være levedyktige og publiserte teknikker. Fremtidige anvendelser av BBS teknikker inkluderer levende eller fast bildebehandling kombinert med endosomal og lysosomale markører for å følge reseptor skjebne, dvs. rettet til gjenvinning endosomes og tilbakelevering til plasma membranen eller degradering via lysosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Støtte ble gitt av oppstartsfond fra Pharmacology and Chemical Biology avdeling ved University of Pittsburgh School of Medicine. Erkjennelse av Jacob lab medlemmer som har bidratt til videoen innsending: Nicholas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).
