Summary
Здесь мы показываем, использование флуоресцентного красителя Alexa, соединенного с α-бунгаротоксина для измерения ГАМК поверхность локализации рецептора и эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Благодаря использованию конструкций, несущих короткий внеклеточный тег, который связывается α-Бунгаротоксин, анализ плазмы мембранного белка торговли эндоцитоза может быть достигнута.
Abstract
Становится все более очевидным, что рецепторы нейротрансмиттеров, включая рецепторы ионотропного ГАМК A (GABAAR), выставочная динамичной торговли и клеточной поверхности мобильности 1-7. Для изучения рецепторов локализацию поверхности клеток и эндоцитоз, Техника, описанная здесь сочетает в себе использование флуоресцентного α-бунгаротоксина с клетки, экспрессирующие конструкции, содержащие α-бунгаротоксина (BGT) сайта связывания (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) основан на α-субъединицы мышечной никотинового рецептора ацетилхолина, который связывается Bgt с высоким сродством 8,9. Включение участка BBS позволяет поверхности локализацию и измерения вставки или удаления рецептора с применением флуоресцентного экзогенный БГТ, как описано ранее в отслеживании GABAA и метаботропного GABAB рецепторов 2,10. В дополнение к BBS сайта, мы вставили рН-чувствительные GFP (pHGFP 11) между аминокислотами 4 и 5 зрелой субъединицы GABAAR стандартными мolecular биология и ПЦР клонирования стратегии (см. рисунок 1) 12. BBS является 3 'рН-чувствительного GFP репортер, разделенных 13-амино аланин кислота / пролина линкера. За торговлю исследования, описанные в данной публикации, основанные на фиксированных образцов, pHGFP служит репортер от общего числа отмеченных GABAAR уровни субъединицы белка, что позволяет нормализация BGT помечены население рецептора к общей численности населения рецепторов. Это сводит к минимуму клетки к клетке изменчивость сигнала BGT окрашивания в результате высокой или более низкой базовой экспрессии меченых GABAAR субъединиц. Кроме того тег pHGFP позволяет легко идентифицировать построить экспрессирующих клеток для живых или фиксированных экспериментов визуализации.
Introduction
Использование флуоресцентной сочетании α-бунгаротоксина учиться рецептора локализацию и динамику был впервые в исследованиях никотиновой рецептора ацетилхолина 13-15 эндогенного цели токсина. Впоследствии введение минимальной BGT связывания пептида (BBS) был использован для изучения торговли обеих возбуждающих и тормозных лиганд-ионных каналов и G белком рецепторов 2,10,16-21. Эта техника BBS основе обеспечивает преимущества с другими подходами, используемых для исследований торговли людьми, такие как методы поверхность биотинилирования, маркировки антител живых клеток с антителами к внеклеточных эпитопов и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Во поверхности клетки биотинилирования свободные амины ковалентно модифицированный, с потенциалом, чтобы повлиять на клеточную активность. Исследования, основанные антитела часто мешает поверхностного антигена кластеризации или укупорки, которая может изменить события с торговлей людьми. В связи с этапа отбелки на FRAP сtudies, важной задачей является повреждения основной клеточную структуру. Дополнительным преимуществом является то, что BBS отмеченных конструкции также могут быть использованы для биохимических методик с оборота рецептора в сочетании биотин-Бунгаротоксин ослов. Этот метод легко применим к клеточных линий и первичных клеток. Для использования в клетках, которые экспрессируют никотиновую ацетилхолин (Nachr) рецепторов, антагонист тубокурарин нАХР должны использоваться на протяжении всего протокола, как указано. Выполнение простой поверхности BGT маркировки (эквивалент Т = 0 момент времени для протокола эндоцитоза) на нетрансфицированных клеток в отсутствие тубокурарина, должны представить доказательства эндогенного Nachr.
Важным фактором для использования этого метода является целесообразным введение в BBS так, что он присутствует на внеклеточный месте, когда представляющий интерес белок доставляется в плазматической мембране. Например, N-концевые домены из GABAAR субъединиц проживают в везикулярного просвета во торговлей людьмиговли и стать внеклеточного рецептора после введения в плазматической мембране, что позволяет конкретной маркировки рецепторами клеточной поверхности и оценка их удаления с поверхности клеток с помощью эндоцитотических событий. Ранее нами было показано, что добавление GFP, Myc, или BBS эпитопов в этой области GABAAR субъединиц функционально молчание. Стандартные элементы должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что меченый белок экспрессируется на том же уровне, чтобы без метки конструкции, что она соответствующим образом локализованы, и что он не влияет на функцию рецептора. Эта характеристика трансфектированных конструкций также поможет в устранении неполадок проблем избыточной экспрессии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы, описанные ниже, в соответствии с IACUC и IRB этическими комитетами из Университета Питтсбурга в Школе медицины.
1. Подготовка гиппокампа нейронов культур в капот культуры ткани
Примечание: Используйте стерильной техники и реагентов на протяжении протокола 1.
- Подготовка поли-D-лизина (0,1 мг / мл в H 2 O) покровные стекла с покрытием в качестве субстрата для нейрональной культуры.
- Поместите 4-5 круглые покровные стекла внутри каждого 3,5 см блюдо культуры ткани.
- Пятно 70 мкл поли-D-лизина на каждый 12 мм покровным. Примечание: для живого изображения, со стеклянным дном 3,5-см блюдо культуры ткани могут быть использованы (пятно 200 мкл поли-D-лизин на встроенном 14 мм покровным стеклом).
- Оставьте приготовленных блюд в капот культуры ткани O / N. Чтобы свести к минимуму поли-D-лизин испарения и держать поверхности стерильные в капот культуры ткани, закрыть створку окна и выключить тыс.э вентилятора O / N. Примечание: УФ лампы не используются во время O / N инкубации.
- На следующее утро, мыть посуду 3x 2 мл H 2 O.
- После удаления последнего H 2 O стирка, добавить 2 мл СМИ к каждому 3,5 см блюдо и не оставляют посуду в инкубаторе до готовности к пластине нейроны в шаге 1.4.
- Нейронов гиппокампа получают из эмбриональный день 18-19 (E18-19) крыс (модифицированные с Goslin 22).
- Трансфекции недавно диссоциированных нейронов в день культивирования с 1-4 мкг maxiprepped конструкцию ДНК.
Примечание: обычно от 3 мкг ДНК трансфицируют в 1-2 млн. нейронов, с жизнеспособностью 50% и эффективность трансфекции 60% (например, начиная с 2000000 нейронов: ((2 х 10 6 нейронов х 0.5) 0.6) обеспечивает около 1 млн. нейронов;.. 600 000 из которых Трансфицированные 1 разное количество ДНК-конструкция может быть трансфицированы при устранении потенциальных проблемсверхэкспрессия, а затем соответствующей характеристике конструкта локализации и функции. - Пластинчатый трансфицированных нейронов на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизина при конечной плотности приблизительно 200000 нейронов в 3,5 см чашку. Примечание: для стеклянным дном блюдо, тарелка 40,000-50,000 нейронов на 14 мм площадью остекления.
- Замените носитель 4-24 ч после подготовки нейронов культур, затем позволить нейроны не развивать в инкубаторе до 14-17 дней в пробирке (DIV) или желаемой стадии.
2. Эндоцитоз Анализ
ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на α-бунгаротоксина и тубокурарина отходов и обращению:
- Обработка всех пептидных нейротоксинов рекомендуется в пределах руководящих принципов уровень биологической безопасности-2 (BL-2) научно-исследовательских протоколов. Все собственно средства индивидуальной защиты необходимо носить. Лиофилизованные токсина порошки должны быть восстановлены в соответствии с инструкциями изготовителя. Токсин отходов шоусть быть утилизированы в соответствии с санитарного состояния окружающей среды и труда руководящего учреждения.
- Для удаления возможных пептидных агрегатов, которые могли образоваться во время хранения, α-бунгаротоксина аликвоты должны быть кратко центрифугировали перед использованием, и супернатант должен быть использован для эксперимента.
- α-Бунгаротоксин (Bgt) запасы ресуспендировали до концентрации 1 мг / мл в стерильной Н2О и хранили в 10 мкл аликвотах при -20 ° С. Флуоресцентно сочетании запасы Bgt используются при 3 мкг / мл. Тубокурарин используют в конечной концентрации 150 мкМ.
- Установить скамейки верхний нагреватель блока до 16 ° С в холодной комнате с тонкого алюминия или нержавеющей стали пластины на вершине. С другой стороны, если таковые имеются, настольная охлаждение / обогрев устройство может быть использовано для каждого шага, требующего 16 ° C.
- Прохладный внеклеточного Гепес-солевом буфере (HBS, содержащие в мм: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 глюкозы, 1,2 MgCl 2 и 2,5CaCl 2, рН 7,4) до 16 ° С на водяной бане.
- Передача нейронов блюда алюминиевую пластину при 16 ° С и прохладный в течение 5 мин.
- Удалить вложение (держать обусловленные СМИ и резерв в инкубаторе в течение шагом 2.8, эндоцитоза временных точках анализа) и заменить с 1 мл 16 ° C HBS + тубокурарина (150 мкм) в течение 2 мин.
- Удалить HBS + тубокурарин, чтобы обозначенный мусоросборник и заменить 1 мл 16 ° C HBS + тубокурарин (150 мкМ) + α-бунгаротоксина Alexa 594 [3 мкг / мл], инкубации при 16 ° С в течение 15 мин.
- Удалить HBS + тубокурарин + α-Бунгаротоксин Alexa 594 до обозначенный мусоросборник и мыть посуды 3x 2 мл 16 ° C HBS (промывные воды могут быть собраны с помощью аспирации в вакуумной колбе, содержащей 50 мл 50% хлорной извести).
- Для экспериментов жить изображений временных рядов следующие рецептора эндоцитоза с помощью стакан дном 3,5 см культуры блюдо, выполните шаги 2.1-2.6, а затем перенести блюдо нагревательный столик(Пельтье устройство) на микроскопе, и начать изображений с конфокальной или установки TIRF микроскопа.
- Переход T = 0 момент времени покровные в блюдо РТ 4% параформальдегида / 4% сахарозы в течение 20 мин, продолжая с другими покровные к шагу 2.9.
- Для других временных точках, заменить HBS с кондиционером, уравновешенную 37 ° C СМИ (защищены в шаге 2.4) и вернуться в инкубаторе в течение эндоцитоза при 37 ° C. Примечание: предложили дополнительные моменты времени Т = 15, 30 и 60.
- В моменты времени необходимо, принять блюда из инкубатора, мыть быстро дважды 2 мл РТ DPBS (не DPBS не кальций, магний), то исправить в 4% параформальдегида / 4% сахарозы в течение 20 мин.
- Через 20 мин фиксации, удалить 4% параформальдегида / 4% сахарозы тратить контейнер и мыть посуду в два раза с 2 мл РТ DPBS.
- Инкубируйте покровные при комнатной температуре в течение 10 мин в растворе иммунофлюоресценции блок (блок решение = 5% лошадиной сыворотки, 0,5% BSA в DPBS), содержащий 0,2% Тритон Х-100 в permeabilИзе нейроны и включить анти-GFP иммуноокрашивания внутриклеточного пула рецепторов и / или маркировки других белков, представляющих интерес.
- Удалить блок + 0,2% Тритон Х-100 и инкубировать покровные в блоке решения иммунофлюоресценции без Triton X-100 в течение 20-30 мин.
- Выполните инкубации первичные антитела покровные в блоке в течение нескольких часов при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Примечание: инкубация покровные с праймериз при 4 ° CO / N обычно производит более высокие результаты иммунофлуоресцентных.
- Вымойте покровные 3 раза с DPBS (5 мин для каждого шага стирки).
- Инкубируйте покровные с вторичными антителами в блоке растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Вымойте покровные 3 раза с DPBS (5 мин для каждого шага стирки).
- Mount покровные, обработки каждый покровное индивидуально: удаления избытка жидкости из задней части покровного стекла с лабораторной ткани, затем инвертировать покровное на 4 мкл монтажа среду на предметное стекло.
- Разрешить слайды, чтобы высушить при комнатной температуре покрывается за 30 мин, затем улруда при 4 ° С до готовности для выполнения микроскопии.
- Сбор и анализ эксперимента с конфокальной микроскопии (слепой экспериментальной состоянии) Изображение. 60X масло Н.А. 1,49 погружения цель со следующими лазеров: аргон 488 нм, 561 диода, 640 диода.
- Используя те же настройки захвата изображений, приобрести односпальные Z раздел изображений с нейронной тела клетки и несколько дендритных процессов в фокусе.
- Количественно α-бунгаротоксина Alexa флуоресценции GFP сигнал и иммунное окрашивание по 20 мкм 3-4 проксимальных дендритов на один нейрон, используя тот же порог для анализа всех данных эндоцитоза.
- Анализ данных из 10-12 нейронов для каждой временной точки, повторяя эксперимент с несколькими независимыми нейрональных культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристика BBS меткой построить включает в себя важные элементы, такие как определения, если экспрессированный белок собирает надлежащим образом (в частности, с рецепторами, состоящими из нескольких субъединиц), трафика на клеточной поверхности и локализует соответствующим образом. Тормозные синапсы состоят из ГАМК поверхности рецептора кластеры, которые локализуются с ингибиторной gephyrin эшафот белка и соединенный с пресинаптических тормозящих терминалов, определенных везикулярного тормозного транспортера аминокислот, который загружает ГАМК и глицин в синаптических пузырьков (VIAAT / VGAT). Показанный на рисунке 2, являются α2pHGFP + BBS выражая нейроны с поверхности GABAAR меченного BGT, а затем иммуноокрашивания для всего населения рецептора с анти-GFP антитела и любой постсинаптической тормозного gephyrin эшафот белка (рис. 2А) или VIAAT (рис. 2В).
На рисунке 3 показана эндоцитоз α2, содержащий GABAAR в нейронах гиппокампа на 15 DIV. Измерения флуоресценции BGT отдельных дендритных процессов как показано в панелях (рис. 3А) нормированы на уровне экспрессии конструкта через окрашивания в GFP антител. Окончательный сравнение моментов времени производится нормализации к измерению Т = 0, как показано на фиг.3В. Количественная оценка интернализации рецепторов над минутного периода 60 (рис. 3В) от флуоресцентного сигнала меняется со временем (среднее ± SEM: Т0 = 100 ± 7,2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6 и T60 = 19,1 ± 3,4 мин ) был лучше всего описывается одной экспонентой (при 37 º С: т 1/2 = 26 ± 4,8 мин).
Альтернативный подход, показано на рисунке 4, это следовать рецептора эндоцитоза в одного нейрона на живой покадровой обработки изображений конфокальной микроскопии. Точечные и перекрытие флуоресценция поверхности pHGFP отмеченных GABAAR и BGT л abeled рецепторы видна в начале эксперимента (T0). За время курса, Bgt помечены ГАМК АР сигнала уменьшается, а рецепторы эндоцитоз, а сигнал pHGFP остается высоким в связи с новой вставки рецепторов. Минимальный уменьшение сигнала phGFP связано с клеточной поверхности изменения распределения рецепторов и фотообесцвечивания.
Рисунок 1. Схема на BBS и pHGFP отмеченных GABAAR субъединицу и эндоцитоз анализа. Эндоцитоз измеряется первым применением флуоресцентно меченого бунгаротоксина к нейронов или клеток с последующим кратким стирки для удаления несвязанного токсин, то потери флуоресценции контролируют как рецепторы усвоены.
JPG "ширина =" 500 "/>
Рисунок 2. Конфокальной визуализации BBS и pHGFP отмеченных GABAAR показывая соответствующее локализации с ингибирующих компонентов синапса. Surface GABAAR в α2pHGFP + BBS выражая нейроны были помечены α-бунгаротоксина Alexa 594 (красный), с последующим использованием иммунной, увеличенные дендритов Показано, Право каждого нейрона. Объединенная группа (α-Бунгаротоксин Alexa 594 в красном, GFP в зеленом, gephyrin или VIAAT синим цветом). Поверхность Bgt помечены GABAAR шоу колокализацию с А) постсинаптическую тормозящее эшафот gephyrin и В белок) прикладывание к пресинаптической маркера VIAAT. (Шкала бары, 10 мкм.)
Рисунок 3. Конфокальной визуализации GABAAR эндоцитоза в 15 DIV нейронов гиппокампа. А) Б) график представляет поверхность GABAAR α-бунгаротоксина Alexa 594 потери флуоресценции с течением времени с эндоцитоза (нормализованное к Т = 0) (10-12 нейроны в момент времени, 4 процессов проанализированы за нейрона; планки погрешностей представляют среднее ± SEM).
Рисунок 4. Жить конфокальной микроскопии из GABAAR эндоцитоза в 15 DIV нейронов гиппокампа. А) B3pHGFP + BBS, содержащего поверхностные GABAAR в нейронах были живы-меченного α-бунгаротоксина Alexa 594 (красный), с последующим удалением короткого несвязанный α-бунгаротоксина Alexa 594 промывкой. Нейроны были обследованы с помощью конфокальной микроскопии при 37 ° С в HBS течение 20 мин при интервале 1 мин (масштаб баров, 10 мкм). Bgt Меченые GABAARs были локализованы на клеточной поверхности при T0, как видно по колокализации с сигналом pHGFP при T0. За время курса, Bgt помечены ГАМК АР сигнала уменьшается, а рецепторы эндоцитоз, новая pHGFP выражая рецепторы постоянно вставляются, поэтому сигнал pHGFP остается почти постоянной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В основе BBS неподвижные и живые Методы, описанные здесь, могут использоваться для отслеживания рецептор или другой плазматической мембраны с торговлей белка в клеточных линиях, нейронах и других первичных клеток. Этот метод был успешно использован для изучения вставки мембраны и удаление лиганд-ионных каналов и GPCR и оценки изменений в области незаконного оборота в связи с наличием агонистов и модуляторов. Ключевые аспекты включают соответствующую локализацию тега к внеклеточного нахождения и осуществляющее контроль за тем, что добавление в BBS (стандарт для других журналистов, таких как GFP) функционально молчание. Для использования в клетках, которые экспрессируют никотиновую ацетилхолин (Nachr) рецепторов, антагонист тубокурарин нАХР должны использоваться на протяжении всего протокола, как указано. В случае, когда дополнительный GFP тег не используется, общий BBS отмеченных уровень белка может быть определена с помощью окрашивания с дополнительным α-бунгаротоксина в сочетании с другим флуорофора после фиксации и permeabilizAtion. Выбор временных точках для измерения эндоцитоза темпы рецептора / интересующего белка требует оценки текущего знания торговли для рецепторов / белок в сочетании с первоначального использования несколько моментов времени. Этот метод также может быть легко использованы с обычной иммунной окраски. Мы также опишем альтернативный подход для отслеживания рецептора эндоцитоза через живой экспериментов визуализации конфокальной. Наличие оборудования, требования времени для живых экспериментов и других экспериментальных ограничений поможет выбор метода, оба они являются жизнеспособными и опубликованных методов. Будущие приложения из методов BBS включают живую или фиксированный изображений в сочетании с эндосомных и лизосомальных маркеров следовать судьбу рецепторов, то есть ориентации на переработку эндосомы и обратная передача на мембрану плазмы или деградации через лизосом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Поддержку оказали запуска-фондов от биологического факультета фармакологии и химической в университете Питтсбурга школа медицины. Подтверждение Иакова членов лаборатории, которые внесли свой вклад в видео представления: Николай Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).
