Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

Published: August 16, 2014 doi: 10.3791/51375
* These authors contributed equally

Summary

El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones.

Abstract

El ensayo de microbolsa de córnea de ratón es un ensayo robusto y cuantitativa in vivo para la evaluación de la angiogénesis. Mediante el uso de gránulos de liberación lenta estandarizadas que contienen factores de crecimiento específicos que activan el crecimiento de vasos sanguíneos a lo largo de la córnea avascular, naturalmente, la angiogénesis puede medirse y cuantificarse. En este ensayo se genera la respuesta angiogénica en el transcurso de varios días, dependiendo del tipo y la dosis del factor de crecimiento utilizado. La inducción de neovascularización son generalmente accionadas por cualquiera de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Mediante la combinación de estos factores de crecimiento con sucralfato y Hydron (poli-HEMA (poli (metacrilato de 2-hidroxietilo))) y la mezcla de fundición en forma de gránulos, que pueden ser implantados quirúrgicamente en el ojo del ratón. Estos gránulos uniformes lentamente a la liberación Los factores de crecimiento durante cinco o seis días (bFGF o VEGF, respectivamente) que permite suficiente respuesta angiogénica requerido para el área del vaso quantification usando una lámpara de hendidura. Este ensayo se puede utilizar para diferentes aplicaciones, incluyendo la evaluación de medicamentos o tratamientos moduladores angiogénicos así como la comparación entre los diferentes fondos genéticos que afectan a la angiogénesis. Un investigador experto después de practicar este ensayo puede implantar un pellet en menos de 5 min por ojo.

Introduction

El proceso de angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos se forman los preexistentes, es muy complejo y está regulado por varios factores endógenos que controlan diferentes etapas de germinación recipiente y la morfogénesis. La angiogénesis se activa debido a un cambio en el equilibrio entre los factores pro-y anti-angiogénicos, un equilibrio que mantiene normalmente la vasculatura en un estado de reposo. La angiogénesis en adultos se produce en ciertas condiciones fisiológicas, tales como durante el ciclo ovárico femenino o en los procesos de reparación, tales como la curación de heridas y regeneración de tejidos. Sin embargo, también es una característica de varias patologías, incluyendo tumores malignos, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias. La participación de la angiogénesis en estas condiciones fisiológicas y patológicas hace que sea un tema importante para la investigación y un blanco atractivo para la terapia.

Debido a la complejidad de la angiogénesis y la participación de varios cells y factores en el proceso, incluyendo las células endoteliales, pericitos, células circulantes y las células del estroma, in vitro modelos siguen siendo limitados y no pueden recapitular el microambiente único en vivo. La principal ensayos in vitro de la angiogénesis se centran en gran medida en la observación de efectos directos sobre las células endoteliales y la medición de ciertas medidas en proceso angiogénico en condiciones controladas. Estos ensayos incluyen la cuantificación de la proliferación celular endotelial 1, la migración 2, la formación de la red 3, la formación del tubo 4 y la brotación de esferoides 5. Modelos ex vivo, a diferencia de los in vitro, son más complejos e incorporar múltiples tipos de células de tejidos, siendo un ejemplo el ensayo de anillo aórtico 6. Sin embargo, como otros sistemas, no puede capturar la contribución de las células circulantes y el estroma natural de las células endoteliales como existe in vivo. Los intentospara estudiar la angiogénesis bajo flujo para imitar el entorno in vivo se llevan a cabo utilizando sistemas de microfluidos 7, sin embargo, incluso estos ensayos, aunque ha mejorado mucho, todavía son incapaces de dar cuenta de todos los compartimentos existentes en vivo.

Debido a las limitaciones de la ex vivo modelos de angiogénesis in vitro y en modelos in vivo siguen siendo las opciones más fiables para los estudios de la angiogénesis. Ejemplos de estos modelos incluyen la implantación de cámaras transparentes, "Windows", que permiten la visualización de los vasos sanguíneos que crecen bajo microscopio de 8, implantes subcutáneos inyectables tales como matrigel y recipiente de formación en tejidos normales tales como oreja de ratón y la membrana corioalantoidea de pollo (CAM ). Sin embargo, uno de los modelos de angiogénesis in vivo más aceptables y cuantitativos es el ensayo de neovascularización corneal microbolsa se ​​describe aquí, que aprovecha la natural avascularcórnea como una "pantalla" para visualizar y evaluar el nuevo crecimiento angiogénico 9.

Aquí se describe el ensayo de microbolsa corneal como desarrollado en ratones. Inicialmente, el modelo se utilizó para medir los estímulos angiogénicos no específicos en córneas de conejo. Esto se hizo mediante la introducción de piezas de tumor en el humor acuoso de la cámara anterior del ojo del conejo y se mide la neovascularización inducida por tumor 11.

Sin embargo, el ensayo se desarrolló más tarde para estudiar los efectos de factores de crecimiento específico 10 para especificar y estandarizar el efecto angiogénico mejor. Con el fin de liberar el factor de crecimiento en el ojo, se usaron gránulos de liberación lenta que contienen cantidades conocidas de los factores de crecimiento angiogénicos en lugar de tejidos. La disponibilidad de proteínas recombinantes purificadas angiogénicos tales como bFGF o VEGF activar su uso como objetivos específicos de la angiogénesis modulaters 12. Inicialmente, el ensayo seutilizado en gran medida en los conejos, que son más fáciles de trabajar debido a su tamaño, pero más tarde el modelo fue traducido en ratones; un modelo animal más pequeño y menos caro. El cambio de conejo a ratones proporcionan una importante ventaja de ser capaz de utilizar animales manipulados genéticamente, creando así una nueva área de investigación sobre los componentes genéticos que afectan la angiogénesis 13. Además del uso más aceptable de ensayo de la córnea en el estudio de la angiogénesis, otros procesos biológicos también pueden ser investigados utilizando ensayos modificados. Por ejemplo, se realizaron estudios de linfangiogénesis posible a través de la implantación de gránulos de bajas dosis de bFGF que permitieron la visualización de los vasos linfáticos a través de marcadores moleculares específicos 14. Además, este ensayo ha proporcionado un medio para evaluar los efectos de la radiación sobre la angiogénesis 15.

En resumen, el ensayo de angiogénesis microbolsa corneal es una cuantitativa, reproducible, evaluación flexible de la angiogénesis in vivo. Una ventaja importante de este ensayo es que la medición de los buques de fondo es innecesaria porque los vasos crecen en un tejido avascular naturalmente. Se describe aquí el protocolo de este ensayo en los detalles y discutir diferentes escenarios que pueden ocurrir. El ensayo consta de 3 segmentos discretos. Aquí vamos a describir la preparación de gránulos de factor de crecimiento incluido, la implantación quirúrgica posterior y, finalmente, el método utilizado para cuantificar el crecimiento neovascular resultante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los protocolos que involucran animales son presentados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital de Niños de Boston y se llevan a cabo de conformidad con las recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Asegúrese de utilizar instrumentos estériles y techniqure aséptica mientras realiza el procedimiento.

1 Preparación de Pellets

  1. Pesar 10 mg de sucralfato y 60 mg de Hydron con la espátula estéril sin doblar. Coloque en tubos de microcentrífuga separados.
  2. Coloque un pedazo cuadrado de 1 cm de malla en una placa de 10 cm estéril. Invertir de manera malla descansa sobre la tapa superficial. Ponga a un lado.
  3. Añadir 500 l de etanol a la Hydron y agitar durante al menos 10 min.
  4. Añadir la cantidad apropiada de factor de crecimiento (estándar: 20 g de bFGF, 50 g de VEGF) a la sucralfato y agitar brevemente. Factor de crecimiento en una tienda-80 ° C congelador a una concentración de 1 mg / ml. Los volúmenes líquidos agregados deben tener un mínimo de 20 l para asegurar el sucralfato está completamente humedecido, pero no deben exceder de 50 l. Mayor volumen hace que la evaporación del líquido en la siguiente etapa difícil.
  5. Colocar la mezcla de sucralfato en el evaporador centrífugo de implantación baja hasta que la mezcla esté completamente seco, normalmente 30-50 min dependiendo del volumen de líquido utilizado.
    1. Compruebe la mezcla para la humedad residual con el extremo cónico de una espátula estéril. La mezcla debe sentirse "crujiente".
  6. Con la punta afilada de la espátula para romper la mezcla sucralfato dentro del tubo.
  7. Añadir 10 l de la hydron al sucralfato.
    1. Debido a la naturaleza viscosa de Hydron, cortar el extremo de una punta de pipeta 200 l y luego dibujar y liberar los 10 l antes de la pipeta hacia arriba otra vez y añadiendo al sucralfato.
  8. Utilizar rápidamente escupió dobladaula para mezclar la hydron y sucralfato y retirar de tubo.
    1. Reunir la mezcla a lo largo de la parte inferior de la punta de la espátula doblada y luego girar el tubo mientras el dibujo de la espátula a lo largo de la pared del tubo. La mezcla se seca rápidamente lo que este paso se debe realizar de manera eficiente.
  9. Extienda la mezcla sobre la malla preparada utilizando pinzas para mantenerlo en su lugar. La mezcla debe ser una capa uniforme y llenar en los agujeros de la malla.
  10. Sumerja la espátula doblada en el tubo que contiene hydron y utilizarlo cubrir ambos lados de la malla.
  11. Coloque la malla recubierta apoyado en parte contra el borde del plato y dejar secar a temperatura ambiente durante 30 a 45 min.
  12. Coloque la malla de -20 ° C congelador o proceder inmediatamente al siguiente paso. Mantenga malla dentro del plato.
  13. Coloque el plato de 35 mm en el interior de la placa de Petri grande, tapa. Utilice el par de pinzas para tirar cuidadosamente las fibras de la malla aparte sobre el plato 35 mm. Bolitas de Stray cun ser recogidos desde el plato más grande al final.
    1. Compruebe pellets para la uniformidad en el alcance. El proceso rinde aproximadamente 250 pastillas por lo tanto la dosis estándar por pastilla para bFGF y VEGF es 80 ng y 200 ng, respectivamente.
  14. Bolitas en tienda a 35 mm plato en -20 ° C congelador hasta 3 meses.

2. implantación quirúrgica de Pellets

  1. Establezca un área quirúrgica bajo microscopio quirúrgico.
  2. Anestesiar al ratón con Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) y coloque el ratón bajo el microscopio de modo ojo es visible. Realizar pizca dedo del pie para asegurar un nivel suficiente de la anestesia.
  3. Anestesiar el ojo del ratón colocando 1 gota de solución proparacaina lo alto del globo ocular. Espere 20-30 segundos y quite con una gasa.
  4. Proptose el ojo del ratón con el # 1 embotado joyeros fórceps siendo cierto para dejar la piel entre los fórceps y los ojos. Es importante para juzgar la presión aplicada correctamente.60; La celebración de la vista con demasiada firmeza hará que se ponga roja e irritada, mientras que también perderá una bodega permitirá ojo se mueva durante la cirugía.
  5. Utilice la microknife 30 ° para hacer una incisión en la córnea de aproximadamente 1 mm desde el limbo. La incisión debe ser de 1-2 mm de longitud. Incisión debe ser lo suficientemente profundo para penetrar más allá de la capa epitelial en midstroma pero no tan profundo como para romper el ojo.
  6. Utilice el cuchillo von Graef para hacer un bolsillo perpendicular a la incisión.
    1. Deslizar el cuchillo debajo de la capa córnea en el sitio de la incisión y trabajar suavemente cuchillo en y moverlo a lo largo de la incisión para agrandar el espacio, formando así el bolsillo. Esto ayuda a mover el ratón así como para ser capaz de trabajar con la curvatura del ojo. Tenga cuidado de no empujar hacia abajo con la punta para evitar la ruptura del ojo.
  7. Moje fórceps el # 5 de joyero con proparacaína y elegir un pellet subir de plato. Colocar un pellet en el ojo. Humedezca el cuchillo von Graef con proparacaína y transferir algunas de líquido sobre pellet para que sea gomoso y flexible. Retire el exceso de humedad con una gasa o un hisopo de algodón.
  8. Inserte la pastilla en el bolsillo con el cuchillo von Graef para empujarlo dentro de debajo de la capa córnea. Una vez que todo el sedimento que hay dentro, desliza la parte plana del cuchillo von Graef más sitio para comprobar que la pastilla es segura.
  9. Cubra el ojo con un ungüento antibiótico triple.
  10. Ponga el ratón y repetir la cirugía en el ojo opuesto.

3. Cuantificación de neovascularización corneal.

Deje a los animales para desarrollar vasos durante un período determinado de tiempo. El día de la clasificación recipiente depende del factor de crecimiento utilizado. Grado bFGF en el día 5 y el VEGF más débil en el día 6. El día de la implantación es el día 0.

  1. Anestesiar el ratón con avertina (400-500 mg / kg, intraperitoneal).
  2. Utilice el microscopio de lámpara de hendidura para grading. Un ocular tiene una retícula, líneas dentro del ocular utilizado como una ayuda de medición para cuantificar la eslora del buque y la distancia alrededor de la circunferencia del ojo que los buques han brotado.
    1. Mantenga el ratón delante de alcance, posicionando el ratón de modo ojo se ve en ocular con pellet directamente por delante. Estabilizar la cabeza entre el pulgar y el dedo índice para que la piel se tensa en la cara y el ojo es ligeramente proptosed.
  3. Coloque el eje y de la retícula a lo largo del recipiente de limbal directamente debajo de pellets. Medir la longitud de los vasos de ramificación hacia arriba, hacia pellets. Registre esta medición en décimas de milímetros y designar a la eslora del buque (VL) (Figura 1A).
  4. Gire el ratón o el bolso para que la distancia alrededor del ojo que estos buques han brotado se aclara. Es más fácil pensar en el ojo como un reloj con intervalos de 1 a 12 horas Designar este número reloj (CH) (Figura 1B). Puede ser un número entero o fracciones de 0,25 (por ejemplo, 2, 2,25, 2,5 o 2,75). Nota: CH es subjetiva. Por ejemplo, algunos pueden medir la distancia alrededor del ojo para incluir todos los buques germinados desde el limbo mientras que otros pueden detener la medición en el punto donde la eslora del buque es la mitad del máximo. El factor importante es ser coherente con la forma en que uno elige a grado.

Figura 1
Figura 1. Cuantificación de la neovascularización corneal. (A) 80 ng de bFGF sedimento implantado en ratones C57BL / 6J muestra retícula lámpara de hendidura orientada para medir la longitud del vaso. VL = 0,9 mm. (B) La misma muestra el ojo con lámpara de hendidura retícula gira para medir hora de reloj. CH = 3.25. Área del vaso Calculado = 1,84 mm 2. Estas imágenes han sido mejoradas digitalmente para permitir la adición de esquemática retícula. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

  1. Calcular el área del vaso (VA) utilizando la siguiente fórmula, que se basa en el área de un óvalo (Nota, es útil tener esto en cuenta a la hora de clasificación.) Expreso VA en milímetros cuadrados. La fórmula es como sigue:
    Vessel longitud x Reloj hora x 0,2 π = área del vaso

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Los resultados típicos para bFGF y VEGF pellets en los bajos angiogénicos C57BL / 6J normales se muestran en la Figura 2A y B, respectivamente. Figura 2E muestra la distribución normal de área del vaso (VA) en el / cepa C57BL 6J con dosis variables de estos crecimiento factores. 80 pelets de bFGF ng normalmente dan como resultado un VA de aproximadamente 2,0 mm 2, aunque los valores en una gama de 1.8 a 2.4 mm 2 son aceptables. 200 ng de VEGF gránulos típicamente causan una respuesta de aproximadamente 0,7 mm 2, con un rango de valores aceptables de 0,6-0,9 mm 2. Para los experimentos de los que se sospeche un efecto anti-angiogénico, las áreas de los vasos más grandes son deseables para ser capaz de visualizar una disminución. Figura 3 muestra el efecto de la talidomida fármaco anti-angiogénico sobre la neovascularización impulsado por bFGF. El tratamiento dio lugar a la inhibición de 38% de crecimiento de los vasos. En experimentos en los que un aumento puedeesperar lo mejor es utilizar dosis más bajas como el pellet estándar produce una respuesta máxima próximo. Pellets que consisten en 10-40 ng bFGF sería más apropiado (Figura 2C).

Las cepas se sabe que tienen una respuesta de alta angiogénico a un factor de crecimiento particular pueden tener un VA más del doble que la de una cepa de baja angiogénico típico. Figura 2D muestra la respuesta de un ratón 129S1 / SvImJ a un FGF pellet 20 ng. Para la comparación, la misma pastilla de dosificación se muestra en una C57BL / 6J en la Figura 2C. Una extensa tabla que detalla el potencial angiogénico de diversas cepas a tanto bFGF y la neovascularización inducida por VEGF ha sido publicado previamente por nuestro laboratorio 13.

Ciertas cepas o pigmentaciones pueden exhibir crecimiento o fuga de los vasos del iris en respuesta a una pastilla. Esto puede ocurrir en uno o ambos ojos de un ratón individual y pueden o no ser consistentes en la entIRE grupo en el que se realiza el ensayo. Este fenómeno puede resultar en la ruptura de los vasos del iris haciendo que la sangre para llenar la cámara anterior (hipema). Hifemas puede hacer clasificación de la neovascularización de la córnea difícil o imposible. Figura 4 ilustra una leve (4A) y forma severa (4B) de esta ocurrencia.

Figura 2
Figura 2. Ejemplos de factor de crecimiento inducido neovascularización de la córnea. (A) 80 ng de bFGF sedimento implantado en un ratón angiogénica bajo C57BL / 6J, resultando en un área del vaso igual a 2,0 mm 2. Es muy común para esta dosis para causar recipientes alcancen el sedimento y crecen en él. (B) 20 ng de bFGF sedimento implantado en unRatones C57BL / 6J, resultando en un área del vaso igual a 1,04 mm 2. (C) 200 ng de VEGF sedimento implantado en un ratón C57BL / 6J, resultando en un área del vaso igual a 0,71 mm 2. (D) 20 ng bFGF pellet en la alta tensión 129S1 / SvImJ angiogénico. En comparación con (C), también un FGF pellet 20 ng, esta cepa tiene un potencial angiogénico mayor que el doble que la de ratones C57BL / 6J. (E) Área neovascular corneal (media ± DE, n = 10) en ratones C57BL / 6J inducidas por el aumento de dosis de cualquiera de VEGF o bFGF. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Figura 3. Inhibición de Vess inducida por bFGFel crecimiento por el agente anti-angiogénico. vehículo (A) de control tratados C57BL / 6J ratón. Implantación de 80 ng de bFGF sedimento resultante en un área del vaso grupo igual a 2,0 mm 2. (B) La talidomida tratada ratón (200 mg / kg, por vía oral durante 5 días). Área del vaso es igual a 1,25 mm Grupo 2 y refleja disminución del 38% en el crecimiento de los vasos. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4
Figura 4. Crecimiento hipemas inducida por el factor en el iris murinos. (A) hipema leve en un C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Esta cepa exhibe la misma neovascularización de la córnea como sus homólogos pigmentadas, pero es más prone a Iris sangrado. (B) hifema a gran escala en un ratón 129P3 / J. Todo el ojo tiene un tinte rojizo, así como piscinas más pronunciados de la sangre más a fondo del iris. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hay varios pasos críticos en la realización de un exitoso ensayo de la córnea. El primero es hacer gránulos uniformes capaces de ser implantado y la estimulación de los vasos. Las partes más importantes de la preparación de pellets son: 1) el uso del factor de crecimiento sin vehículo; 2) garantizar una buena mezcla de factores de crecimiento con el sucralfato y hydron y 3) que se mueve la mezcla final con rapidez pero con cuidado del tubo Eppendorf a la malla donde se echan los pellets. Se recomienda que los pellets "dummy" pueden hacer sin factor de crecimiento para practicar la técnica. Los pellets deben aparecen en blanco y calcáreo y estar más o menos de forma cuadrada. Cualquier gránulos que incluyen áreas claras deben ser excluidos de probabilidades estas áreas contienen sólo hydron. También hay que señalar que los gránulos se forman con etanol y que el bFGF y VEGF se estabilizan mediante la inclusión de sucralfato, que imita la unión de heparina. El sucralfato también sirve para proporcionar una liberación lenta platform para los factores de crecimiento. Si se añaden otros estimuladores o inhibidores de los pellets, estos factores deben ser probados primero en determinar la estabilidad en etanol. Se recomienda que los pellets "dummy" pueden hacer sin factor de crecimiento para practicar inicialmente la técnica. "Dummy" o gránulos simuladas contienen sólo sucralfato y Hydron con PBS sustituido por el volumen de factor de crecimiento o compuesto que está siendo probado. Estas pastillas no estimulan el crecimiento de vasos o inflamación del limbo. Pellets de Sham sirven como un control apropiado en experimentos en los que se sospecha un agente de ser pro-angiogénico y se prueba sin la adición del factor de crecimiento al sedimento. Compuestos y el factor de crecimiento pueden ser combinados en pastillas para casos en los que se investiga la interacción, en la que gránulos de caso del factor de crecimiento por sí solo sería el control apropiado.

La implantación quirúrgica es la parte más difícil del ensayo.0; Inicialmente es muy difícil de medir la profundidad apropiada para la incisión. Demasiado profundo de una incisión hace que el globo a la ruptura y el ojo se vuelve inoperable. Este es un efecto dramático y, por tanto, se aprende rápidamente a no "hacer estallar" el ojo. Se necesita mucho más tiempo para hacer constantemente una incisión suficientemente profundo para permitir la formación de bolsas. Cuando la incisión es demasiado poco profunda, la capa superior de la córnea se daña fácilmente arrancada o con el cuchillo von Graef medida que se inserta para hacer el bolsillo. El paso final de cuantificar el crecimiento de nuevos vasos requiere coherencia en la forma de la clasificación. La eslora del buque es una medición directa, mientras que el valor de la hora del reloj que representa el crecimiento alrededor de la circunferencia del ojo es más subjetivo. El método utilizado debe ser el mismo de ratón a ratón y entre experimentos.

Otro componente crítico del ensayo es la elección de la anestesia, que puede tenerun impacto en la facilidad y el éxito del procedimiento quirúrgico. Avertin inyectable es la menos complicada ya que permite una fácil manipulación del ratón en contraste con la anestesia vaporizado entregado a través de cono de la nariz. Es recomendable evitar la combinación de ketamina y xilazina así debido a su asociación con lesiones corneales en roedores 16,17.

Es importante tener en cuenta cualquier cambio en el peso de los ratones durante el experimento. La pérdida de peso puede ser indicativo de las condiciones de vivienda pobres o enfermedades y estos pueden afectar negativamente a la capacidad de un ratón a crecer vasos en el ojo. Los pesos deben tomarse con el día de la implantación de pellets y clasificación recipiente para determinar el porcentaje de peso perdido, si los hubiere. La pérdida de 5% o menos es aceptable y puede resultar del estrés de la manipulación de los ratones, especialmente durante los experimentos de tratamiento con una dosificación frecuente. Pérdida de peso superior al 5% es preocupante y lo hará de forma no específicasuprimir el crecimiento de vasos. Por lo tanto los resultados de dichos experimentos deben considerarse inválidos.

Para tener en cuenta las variaciones experimentales inherentes de la técnica de procedimiento y la eficacia de las variables estudiadas, un número mínimo de ratones se debe utilizar para lograr resultados válidos. En nuestra experiencia, recomendamos no menos de 5 ratones por grupo que producen un n de 10 ojos.

A pesar de las muchas ventajas de la microensayo corneal, también hay algunas limitaciones. El principal inconveniente es la necesidad de un período de entrenamiento relativamente largo con el fin de dominar la técnica. Una persona sin experiencia técnica previa de trabajo en el ojo del ratón requeriría aproximadamente cuatro meses de práctica antes de los experimentos de 20-25 ratones podían ser consideradas como fiables. Además, hay algunas variaciones entre las diferentes personas que realizan el ensayo, lo que limita la posibilidad de comparar entre los experimentos que se realizanen diferentes momentos por diferentes personas. Otra limitación de este modelo es que los experimentos son relativamente corto (5-6 días) y están restringidas por la liberación del bFGF o VEGF a partir del sedimento. Por lo tanto, este ensayo es muy adecuado para terapias que tienen una respuesta rápida in vivo, aunque esto puede ser parcialmente compensado por pre-tratamiento de los ratones durante la longitud deseada de tiempo antes del procedimiento. Ensayos de prueba de la droga estándar suelen comenzar su administración en el día de la implantación de pellets (día 0) continuando hasta el día de la clasificación (día 5 o 6).

La importancia de esta técnica es que es uno de los ensayos de angiogénesis cuantitativos más fiables. Una alternativa en ratones es el ensayo de tapón de Matrigel, sin embargo, este ensayo es más cualitativo y es menos específico para un determinado factor de crecimiento debido a una extensa infiltración de células que se produce en el enchufe. La flexibilidad del ensayo de la córnea permite adaptar la cantidadde la angiogénesis generado y para elegir un estimulador específico. Es posible sustituir los factores de crecimiento estándar con otros factores angiogénicos conocidos o sospechosos. Además, es posible combinar factores de crecimiento estándar y los inhibidores de posibles dentro de la misma pastilla para evaluar la actividad anti-angiogénica sin entrega sistémica. Finalmente, este ensayo permite para estimular la angiogénesis en diferentes fondos genéticos, que pueden ser útiles en la cartografía de los efectos genéticos y en el establecimiento del impacto de un gen en particular sobre la angiogénesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Damos las gracias a Kristin Johnson para la obra gráfica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1: Pellet preparation
Sucralfate Sigma #S0652
Hydron (aka Poly(2-Hema)) Sigma #P3932-10G
Ethanol Pharmco Products Inc #111000200CSGL
Growth factors: Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))
 Fibroblast growth factor (FGF) PeproTech #AF-100-18B
Vascular endothelial growth factor (VEGF) R D Systems #293-VE-050/CF
35 mm dish Becton-Dickson #353001 Used for storage of pellets
10 cm petri dish VWR #25384-342 Used as work surface for preparing pellets
Mesh Sefar America #03--300/51 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave
Spatulas Fisher Scientific #21-401-10 Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific #05-408-146 One for hydron, one for sucralfate
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2315E Need 2 for pulling mesh apart
Centrifugal evaporator ThermoSavant DNA110 SpeedVac
Section 2: Surgical implantation of pellets
Operating microscope Zeiss
2.5% Avertin General anesthetic
Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% Falcon NDC# 6131401601 Eye anesthetic
Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment Bausch Lomb NDC# 2420878055 Contains neomycin, polymixin and bacitracin
Ophthalmic microknife, 5 mm Surgistar #924501 30 degree angle
von Graef knife Ambler Surgical #3401E
Jewelers forceps, #1 Ambler Surgical #2301E Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2305E For picking up pellets and placing on eye
Small curved scissors Ambler Surgical #5636E For trimming whiskers
Gauze For blotting eye after proparacaine
Section 3: Grading of Corneal Neovascularization
2.5% Avertin General anesthetic
Slit lamp Nikon FS-2 Needs an ocular with a reticule to assist in measuring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
  2. Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
  3. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
  4. Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
  5. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
  6. Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
  7. Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
  8. Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
  9. Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
  10. Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
  11. Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
  12. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
  13. Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
  14. Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
  15. Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
  16. Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
  17. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).

Tags

Neurociencia Número 90 la angiogénesis la neovascularización, el modelo el factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento endotelial vascular
El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Birsner, A. E., Benny, O., D'Amato,More

Birsner, A. E., Benny, O., D'Amato, R. J. The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (90), e51375, doi:10.3791/51375 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter