Summary
Protokollen beskriver det corneale micropocket assay som utvikles hos mus.
Abstract
Musen korneal micropocket assay er et robust og kvantitativt in vivo-forsøk for vurdering av angiogenese. Ved å bruke standardiserte slow-release pellets inneholdende spesifikke vekstfaktorer som utløser blodkarvekst gjennom hele den naturlig avaskulær hornhinnen, kan angiogenese kan måles og kvantifiseres. I dette assay den angiogene responsen blir generert i løpet av flere dager, avhengig av type og dosen av vekstfaktor som brukes. Induksjonen av neovaskularisering er vanligvis utløst av enten basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) eller vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Ved å kombinere disse vekstfaktorer med sukralfat og Hydron (poly-HEMA (poly (2-hydroksyetylmetakrylat))), og støping av blandingen til pellets, kan de bli kirurgisk implantert i mus øyet. Disse ensartede pellets sakte-frigjøre vekstfaktorer over fem eller seks dager (bFGF eller VEGF henholdsvis) som muliggjør tilstrekkelig angiogent respons krevde for fartøy område quantification bruker en spaltelampe. Denne analysen kan brukes til forskjellige anvendelser, inkludert evalueringen av angiogene modulator legemidler eller behandlinger, så vel som sammenligning av forskjellige genetiske bakgrunner som påvirker angiogenese. En dyktig etterforsker etter å ha praktisert denne analysen kan implantere en pellet på mindre enn 5 min per øye.
Introduction
Prosessen med angiogenese, dannelsen av nye blodkar dannes forhåndseksisterende de, er meget komplisert og er regulert av flere endogene faktorer som styrer forskjellige trinn av fartøyet spiring og morfogenese. Angiogenese er utløst som følge av en forskyvning i balanse mellom profiler og anti-angiogene faktorer, en balanse som normalt opprettholder blodkar i en hviletilstand. Angiogenese hos voksne forekommer i visse fysiologiske betingelser slik som under den kvinnelige eggløsningssyklus eller i reparasjonsprosesser som sårheling og regenerering av vev. Imidlertid er det også et kjennetegn av flere patologier inkludert maligne tilstander, autoimmune og inflammatoriske sykdommer. Involvering av angiogenese i disse fysiologiske og patologiske tilstander som gjør det til et viktig tema for forskning og et attraktivt mål for terapi.
På grunn av kompleksiteten i angiogenese og involvering av flere ceLLS og faktorer i prosessen, inkludert endotelceller, pericytes, utegående celler og stromale celler, in vitro-modeller er begrenset og kan ikke rekapitulere den unike in vivo mikromiljøet. Hoved in vitro analyser av angiogenese er i stor grad fokusert på å observere direkte effekter på endotelceller og måle visse trinn i angiogeneprosessen under kontrollerte forhold. Disse assayer omfatter kvantifisering av endotelial celleproliferasjon 1, migrering 2, nettverksdannelse 3, røret dannelsen 4 og spirende fra sfæroider 5. Ex vivo-modeller, i motsetning til in vitro-de, er mer komplisert og innlemme flere vev celletyper, et eksempel er aorta ring analysen seks. Ikke desto mindre, i likhet med andre systemer, kan det ikke ta bidraget av sirkulerende celler og naturlige stroma av endotelceller som eksisterer in vivo. Forsøkå studere angiogenese henhold flyt å etterligne in vivo innstillingen utføres med microfluidic systemer 7, men selv disse analysene, selv om mye bedre, er fortsatt ikke i stand til å gjøre rede for alle avdelinger eksisterende in vivo.
På grunn av begrensninger i in vitro og ex vivo angiogenese modeller, in vivo-modeller forbli de mer pålitelig valg for angiogenese studier. Eksempler på disse modellene inkluderer implantasjon av gjennomsiktige kamre, "Windows", som tillater visualisering av voksende blod fartøy under mikroskop 8, injiserbare subkutane implantater som matrigel og fartøy dannelse i normalt vev som mus øret og kylling chorioallantoic membran (CAM ). Imidlertid er en av de mest akseptable og kvantitative in vivo angiogenese-modeller er det corneale micropocket neovaskularisering analysen beskrevet her, som utnytter naturlig avaskulærhornhinnen som en "skjerm" for å visualisere og vurdere nye angiogent vekst ni.
Her beskriver vi det corneale micropocket assay som utvikles hos mus. Utgangspunktet modellen ble brukt for å måle ikke-spesifikke angiogene stimuli i kanin hornhinner. Dette ble gjort ved å innføre tumorstykker inn i den vandige humor fra det fremre kammer i kaninøyne målt og tumor-indusert neovaskularisering 11.
Imidlertid analysen ble senere utviklet for å studere virkningene av spesifikke vekstfaktorer 10 for bedre å spesifisere og standardisere den angiogene effekten. For å frigjøre vekstfaktor i øyet, ble det langsomt frigjørende pellets inneholdende kjente mengder av angiogene vekstfaktorer brukes i stedet for vev. Tilgjengeligheten av renset rekombinante angiogenetiske proteiner som bFGF eller VEGF aktivert deres bruk som konkrete mål av angiogenese modulaters 12. Til å begynne med analysen vari stor grad brukes i kaniner, som er lettere å jobbe med på grunn av sin størrelse, men senere modellen ble oversatt til mus; en mindre og rimeligere dyremodell. Skifter fra kanin til mus gitt en viktig fordel av å være i stand til å bruke genetisk manipulerte dyr, og dermed skape et nytt område av forskning på genetiske komponenter som påvirker angiogenese 13. I tillegg til den mer akseptabel bruk av cornea analysen i å studere angiogenese, kan andre biologiske prosesser også undersøkt ved bruk av modifiserte assays. For eksempel ble studier av lymphangiogenesis gjort mulig gjennom implantasjon av lavdose bFGF pellets som tillot visualisering av lymfekar gjennom konkrete molekylære markører 14. I tillegg har denne analysen ga et middel for å evaluere effekten av stråling på 15 angiogenese.
I summering, er hornhinnen micropocket angiogenese analysen en kvantitativ, reproducible, fleksibel vurdering av angiogenese in vivo. En stor fordel med denne analysen er at målingen av bakgrunns fartøy er unødvendig fordi fartøyene vokse på en naturlig avaskulære vev. Vi beskriver her protokollen fra denne analysen i detaljer og diskutere ulike scenarier som kan oppstå. Analysen består av tre adskilte partier. Her vil vi beskrive fremstillingen av vekstfaktor inkludert pellets, den etterfølgende kirurgisk implantering og til slutt den metode som brukes til å kvantifisere resulterende neovaskulær vekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller som involverer dyr er forelagt og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Children Hospital Boston og drives i samsvar med anbefalingene fra Foreningen for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Pass på å bruke steril instrumentering og aseptisk techniqure mens du utfører prosedyren.
1. Utarbeidelse av pellets
- Vei opp 10 mg sucralfate og 60 mg av Hydron med sterile unbent slikkepott. Plasser i separate mikrosentrifugerør.
- Plasser en 1 cm firkantet stykke mesh i en steril 10 cm parabolen. Invertere så mesh hviler på grunt lokk. Sett til side.
- Tilsett 500 pl av etanol til Hydron og virvle i minst 10 min.
- Tilsett passende mengde vekstfaktor (standard: 20 pg for bFGF, 50 ug for VEGF) til sukralfat og vortex kort. Vogn-vekstfaktor i en-80 ° C fryser i en konsentrasjon på 1 mg / ml. Væske volumer tilsettes bør være et minimum på 20 pl for å sikre at sukralfat er fullstendig fuktet, men bør ikke overstige 50 pl. Større volum gjør fordampningen av væsken i neste trinn vanskelig.
- Plasser sukralfat blandingen i sentrifugal fordamperen satt på lav inntil blandingen er helt tørr, normalt 30-50 minutter, avhengig av volumet av væsken som brukes.
- Kontroller blandingen for restfuktighet med den kileformede ende av en steril spatel. Blandingen skal føle seg "crunchy".
- Bruk avsmalnet ende av spatelen for å bryte opp sukralfat blandingen inne i røret.
- Tilsett 10 pl av den Hydron til sukralfat.
- På grunn av den viskøse natur Hydron, kuttet enden fra en 200 mL pipette tips og deretter tegne og løslate de 10 mL før pipettering opp igjen og legge til sucralfate.
- Raskt bruke bøyd spyttetula å blande Hydron og sukralfat og fjerne fra tube.
- Samle blandingen langs den nedre side av spissen av det bøyde spatel og deretter rotere røret mens tegningen spatelen ut langs veggen av røret. Blandingen vil tørke raskt, så dette trinnet må utføres effektivt.
- Fordel blandingen på det klargjorte mesh med tang for å holde den på plass. Blandingen bør være et jevnt lag og fyll inn i hullene i nettingen.
- Dypp bøyd slikkepott inn i røret som inneholder Hydron og bruke den strøk begge sider av nettet.
- Plasser belagt mesh lener seg på siden mot kanten av fatet og la tørke ved RT i 30-45 min.
- Plasser mesh i -20 ° C fryser eller fortsette umiddelbart til neste trinn. Hold mesh inne parabolen.
- Plasser 35 mm rett på innsiden av den større petriskål, lokket av. Bruk pinsett til forsiktig drar fibrene i mesh fra hverandre over 35 mm parabolen. Stray pellets cen hentes fra den større fatet på slutten.
- Sjekk pellets for ensartethet henhold omfang. Prosessen resulterer i omtrent 250 pellets dermed standarddose per pellet for bFGF og VEGF er 80 ng og 200 ng, respektivt.
- Oppbevar pellets i 35 mm rett i -20 ° C fryser i inntil 3 måneder.
2. Kirurgisk Implantasjon av pellets
- Sett opp en kirurgisk området under drifts mikroskop.
- Anesthetize mus med Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) og plasserer muse henhold mikroskop så øyet er synlig. Utfør tå klype for å sikre tilstrekkelig grad av anestesi.
- Anesthetize musen øye ved å plassere en dråpe proparacaine løsning oppå øyeeplet. Vent 20-30 sek og bearbeid med en kompress.
- Proptose musen øye med matt # 1 gullsmeder tang være sikker på å forlate huden mellom tang og vernebriller. Det er viktig å bedømme trykket brukt riktig.60; Holde øye for hardt vil føre til at det å bli rød og irritert, mens for løs tak vil tillate øye å flytte under operasjonen.
- Bruk 30 ° microknife å lage et snitt i hornhinnen ca 1 mm fra limbus. Snittet skal være 1-2 mm i lengde. Innsnitt bør være dype nok til å trenge utover epitellaget inn midstroma, men ikke så dypt til å sprekke øyet.
- Bruk von Graef kniv for å lage en lomme vinkelrett på snittet.
- Skyv kniven under corneal sjiktet ved snittstedet og arbeide forsiktig kniv i og flytte den langs snittet for større plass, og dermed danner lommen. Det hjelper å flytte musen i tillegg til å være i stand til å arbeide med krumningen av øyet. Vær forsiktig med å presse nedover med spissen for å unngå sprekker øyet.
- Fukt # 5 gullsmed tang med proparacaine og plukke en pellet opp av parabolen. Plasser en pellet på øyet. Fukt von Graef kniv med proparacaine og overføre noen av væske på pellet å gjøre det gummiaktig og smidig. Fjern overflødig fuktighet med kompress eller bomullspinne.
- Sett pellet i lommen ved hjelp av von Graef kniv til å dytte den inn under hornhinnen laget. Når hele pellet er inne, kjøre den flate siden av von Graef kniven over området for å sjekke at pelleten er sikker.
- Coat øyet med trippel antibiotisk salve.
- Snu musen og gjenta operasjonen i motsatt øye.
3. Kvantifisering av Hornhinnen neovaskulariseringen.
La dyr å utvikle fartøy over en viss periode av tid. Dagen for fartøy gradering avhenger av vekstfaktor som brukes. Grade bFGF på dag 5 og svakere VEGF på dag 6. Den dagen implantasjon er dag 0.
- Anesthetize mus med Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal).
- Bruk spaltelampe mikroskop for grading. En okulær har en reticule, linjer innenfor okularet brukes som måle hjelpemiddel for å kvantifisere fartøy lengde og avstand rundt øyet omkrets at fartøyene har spiret.
- Hold musen foran omfang, posisjonering musen så øyet blir sett i okulær med pellet direkte foran. Stabilisere hodet mellom tommelen og pekefingeren slik at huden strammes på ansiktet og øyet er litt proptosed.
- Plasser den på y-aksen av reticule langs limbale fartøyet direkte under pelleten. Måle lengden av fartøyer forgrening oppover mot pellets. Spill denne målingen i tiendedels millimeter og utpeke Vessel Lengde (VL) (figur 1A).
- Slå enten musen eller reticule slik at avstanden rundt øyet at disse fartøyene har spiret blir klart. Det er lettest å tenke på øyet som en urskive med intervaller på 1 til 12. Dette kan betegnes antall klokketime (CH) (figur 1B). Det kan være et helt tall eller brøkdeler av 0,25 (eksempel 2, 2,25, 2,5 eller 2,75). Merk: CH er subjektiv. For eksempel kan noen måle avstanden rundt øyet å omfatte alle fartøyer spiret fra limbus mens andre kan avslutte målingen ved det punkt hvor fartøyets lengde er en halv maksimal. Den viktigste faktoren er å være konsekvent med hvordan man velger å gradere.
Figur 1. Kvantifisering av hornhinnen neovascularization. (A) 80 ng bFGF pellet implantert i C57BL / 6J mus viser spaltelampe reticule orientert for å måle fartøyets lengde. VL = 0,9 mm. (B) Samme øye viser spaltelampe reticule roteres for å måle klokketime. CH = 3.25. Beregnet fartøy areal = 1.84 mm 2. Disse bildene har blitt digitalt forbedret for å gi rom for tillegg av reticule skjematisk. Klikk her for å se større bilde.
- Beregn fartøyet området (VA) ved hjelp av formelen nedenfor, som er basert på det området av en oval (Merk, er det nyttig å ha dette i bakhodet når gradering.) Express VA i millimeter kvadrat. Formelen er som følger:
Vessel Lengde x klokketime x 0,2 π = Vessel område
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske resultater for bFGF og VEGF pellets i den normale lave angiogene C57BL / 6J mus er vist i figur 2A og B, henholdsvis. Figur 2E viser den normale fordeling av fartøyets område (VA) i C57BL / 6J stamme med varierende doser av disse vekst faktorer. 80 ng bFGF pellets normalt resultere i en VA på omtrent 2,0 mm 2, selv om verdiene i et område på 1,8 til 2,4 mm 2, er akseptable. 200 ng VEGF-pellets vanligvis forårsake en reaksjon på omtrent 0,7 mm 2, og et område av akseptable verdier på 0,6-0,9 mm 2. For eksperimenter hvor en anti-angiogen effekt er mistenkt, større fartøysområder er ønskelig å være i stand til å visualisere en reduksjon. Figur 3 viser effekten av anti-angiogene medikament thalidomid på bFGF-drevet neovaskularisering. Behandlingen resulterte i 38% inhibering av vekst av kar. I forsøk hvor en økning kanforventes det er best å bruke lavere doser som standard pellet fører til en nær maksimal respons. Pellets som består av 10-40 ng bFGF ville være mer hensiktsmessig (figur 2C).
Stammer kjent for å ha en høy-angiogen respons til en bestemt vekstfaktor kan ha en va mer enn det dobbelte av en typisk lav-angiogen belastning. Figur 2D viser responsen fra et 129S1 / SvImJ mus til en 20 ng FGF pellet. Til sammenligning, er de samme doserings pellet er vist i en C57BL / 6J i figur 2C. En omfattende tabell detaljering angiogent potensialet i ulike stammer til både bFGF- og VEGF-indusert neovascularization har tidligere blitt utgitt av vår lab 13.
Visse stammer eller pigmentations kan utvise vekst eller lekkasje av iris fartøy i respons til en pellet. Dette kan skje i ett eller begge øyne hos en individuell mus, og kan eller kan ikke være konstant i løpet entire gruppe hvori analysen er utført. Dette fenomenet kan resultere i brudd av iris fartøy forårsaker blod for å fylle fremre kammer (hyphema). Hyphemas kan gjøre gradering corneal neovaskularisering vanskelig eller umulig. Figur 4 illustrerer en mild (4A), og alvorlig form (4B) av denne forekomst.
Figur 2. Eksempler på vekstfaktor-indusert corneal neovaskularisering. (A) 80 ng bFGF pelleten implanteres i et lavt angiogene C57BL / 6J mus, resulterer i et fartøy område lik 2,0 mm 2. Det er meget vanlig for denne dose for å forårsake fartøy for å nå pelleten og vokse inn i den. (B) 20 ng bFGF pellet implantert i enC57BL / 6J-mus, noe som resulterer i et fartøy område lik 1,04 mm 2. (C) 200 ng VEGF pellet implantert i en C57BL / 6J mus, resulterer i et fartøy område lik 0,71 mm 2. (D) 20 ng bFGF pellet i den høye angiogene 129S1 / SvImJ belastning. I forhold til (C), også en 20 ng FGF pellet, har denne stammen en angiogen potensial som er større enn det dobbelte av C57BL / 6J mus. (E) Hornhinnen neovaskulært området (gjennomsnitt ± SD, n = 10) i C57BL / 6J mus indusert av økende doser av enten VEGF eller bFGF. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Hemming av bFGF-indusert Vessel vekst ved antiangiogene middel. (A) Kontroll kjøretøyet behandlet C57BL / 6J mus. Implantering av 80 ng bFGF pellet som resulterer i en gruppe fartøy område lik 2,0 mm 2. (B) Thalidomid behandlede mus (200 mg / kg, oralt i 5 dager). Gruppe fartøy området tilsvarer 1,25 mm 2 og reflekterer 38% reduksjon i vekst fartøy. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Vekstfaktor-indusert hyphemas i muse-iris. (A) Mild hyphema i en C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Denne belastningen viser den samme hornhinnen neovascularization som sine pigmenterte kolleger, men er mer prone til Iris blødning. (B) Storskala hyphema i en 129P3 / J mus. Hele øyet har et rødlig skjær samt mer uttalt dammer av blod nærmere bunnen av iris. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere kritiske trinn med å utføre en vellykket korneal analyse. Den første er å gjøre ensartede pellets istand til å bli implantert og stimulerende fartøy. De viktigste deler av pellet preparatet er 1) ved hjelp av transportør-fritt vekstfaktor; 2) å sikre en god blanding av vekstfaktor med sukralfat og Hydron og 3) å bevege den avsluttende blanding raskt, men forsiktig fra Eppendorf-rør til nettingen, hvor pelletene er støpt. Det anbefales at "dummy" pellets gjøres uten vekstfaktor for å øve på teknikken. Pellets skal vises hvitt og kalkholdig og være omtrent firkantet i formen. Eventuelle pellets som inkluderer klare områder bør utelukkes som disse områdene sannsynligvis inneholder kun Hydron. Det bør også bemerkes at pelletene er dannet med etanol og at bFGF og VEGF er stabilisert ved inkludering av sukralfat, som etterligner heparin-binding. Sukralfat tjener også til å gi en langsom frigjøring platform for vekstfaktorer. Hvis andre stimulatorer eller inhibitorer tilsettes til pelletene, bør disse faktorene testes først å bestemme stabiliteten i etanol. Det anbefales at "dummy" pellets gjøres uten vekstfaktor til først å praktisere teknikken. "Dummy" eller simulert pellets inneholder bare sukralfat og Hydron med PBS substituert for volumet av vekstfaktor eller en forbindelse som testes. Disse pellets ikke stimulerer fartøy vekst eller limbale betennelse. Sham pellets tjene som en hensiktsmessig kontroll i eksperimenter hvor en agent er mistenkt for å være pro-angiogene og testes uten tilsetting av vekstfaktor til pelleten. Forbindelser og vekstfaktor kan kombineres i pellets for tilfeller hvor en interaksjon blir undersøkt, i hvilket tilfelle pelleter av vekstfaktoren alene ville være passende kontroll.
Kirurgisk implantering er den mest krevende delen av analysen.0; Det er i utgangspunktet meget vanskelig å måle den aktuelle dybde for snittet. For dypt et snitt fører til at kloden til å sprekke og øyet blir ubrukelig. Dette er en dramatisk effekt, og derfor man lærer raskt ikke å "pop" øyet. Det tar betydelig lengre tid å konsekvent gjøre et snitt dypt nok til å tillate lomme formasjon. Når snittet er for grunt, er det øverste lag av hornhinnen lett skadet eller revet av med von Graef kniv som det er satt inn for å gjøre lommen. Det siste trinnet for å kvantifisere den nye vekst av kar krever konsistens på den måte som for gradering. Fartøyets lengde er en enkel måling mens klokken timers verdi som viser vekst rundt omkretsen av øyet er mer subjektiv. Metoden som brukes bør være den samme fra mus til mus og mellom eksperimenter.
En annen viktig bestanddel av analysen er valget av anestesi, som kan haen innvirkning på den enkle og suksess for den kirurgiske prosedyren. Injiserbare Avertin er minst komplisert som det gir mulighet for enkel bruk av musen i motsetning til fordampet anestesi levert via nesen membran. Det anbefales å unngå kombinasjonen av ketamin og xylazin så vel på grunn av sin tilknytning til hornhinnelesjoner hos gnagere 16,17.
Det er viktig å være oppmerksom på enhver endring i vekten av musene i løpet av eksperimentet. Vekttap kan være en indikasjon på dårlige boforhold eller sykdom, og disse kan negativt påvirke en mus evne til å vokse årene i øyet. Vekter bør tas på dagene av pelleten implanteres og fartøy gradering for å bestemme prosentandel av vekten tapt, hvis noen. Tap av 5% eller mindre er akseptabelt og kan resultere fra stress av håndtering av mus, spesielt i eksperimenter med hyppig dosering behandling. Større enn 5% vekttap er urovekkende og vil uspesifiktundertrykke vekst av kar. Dermed resultater fra slike eksperimenter bør anses som ugyldig.
For å ta hensyn til iboende eksperimentelle varianser fra prosedyre teknikk og effekten av variablene studert, bør brukes et minimum antall mus for å oppnå gyldige resultater. I vår erfaring anbefaler vi ikke mindre enn 5 mus per gruppe givende en n av ti øyne.
Til tross for de mange fordelene med hornhinnen micropocket analysen, er det også noen begrensninger. Den største ulempe er behovet for en relativt lang periode trening for å mestre teknikken. En person med ingen tidligere teknisk erfaring i musen øye ville kreve omtrent fire måneders praksis før eksperimenter på 20-25 mus kan betraktes som pålitelig. Videre er det noen variasjoner mellom forskjellige personer som utfører analysen, noe som begrenser muligheten for å sammenligne mellom eksperimenter som er utførti forskjellige tider av forskjellige personer. En annen begrensning ved denne modellen er at eksperimenter er relativt kort (5-6 dager) og er begrenset av utgivelsen av bFGF eller VEGF fra pelleten. Derfor er denne analysen godt egnet for behandling som har en rask respons in vivo, selv om dette kan delvis kompenseres for ved forbehandling av musene for ønsket tidsrom før prosedyren. Standard narkotika analysene som vanligvis begynner administrasjon på dagen for pellet implantasjon (Dag 0) fortsetter inntil dagen av gradering (dag 5 eller 6).
Betydningen av denne teknikken er at det er en av de mest pålitelige kvantitative assays angiogenese. Et alternativ i mus er matrigel pluggen assay, men denne analysen er mer kvalitativ og er mindre spesifikke for en bestemt vekstfaktor på grunn av en utstrakt celleinfiltrasjon som oppstår i pluggen. Fleksibiliteten av det corneale analysen gjør det mulig å skreddersy den mengdeangiogenese generert og for å velge en bestemt stimulator. Det er mulig å erstatte de vanlige vekstfaktorer med andre kjente eller mistenkte angiogene faktorer. I tillegg er det mulig å kombinere vanlige vekstfaktorer og mulige inhibitorer innenfor samme pellet for å evaluere anti-angiogen aktivitet uten systemisk levering. Til slutt, gjør at denne analysen en å stimulere angiogenese på ulike genetiske bakgrunn, som kan være nyttig i å kartlegge genetiske effekter og etablere virkningen av et bestemt gen på angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Kristin Johnson for det grafiske arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
